우리는 기꺼이이 프로젝트에 사용 된 표본 공급 Olbrich 정원의 존 Wirth 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 부분에서 지원 (G.R.G.에 R01HL115282) 국립 과학 재단 (J.R.G와 G.R.G.를 DGE1144804), 위스콘신 대학 외과 및 동문 기금 (H.D.L.). 이 작품 또한 일부 환경 보호 기구 (스타 그랜트 no. 83573701)에서 건강의 국가 학회 (R01HL093282-01A1 및 UH3TR000506), 그리고 국립 과학 재단 (IGERT DGE1144804)에 의해 지원 되었다.

1. 식물 조직 세제 기반 접근을 사용 하 여 decellularization
<ol><li>
신선 또는 냉동 F. hispida, 잎 샘플을 사용 합니다. -20 ° C 냉동 고 (최대 1 년) 나중에 사용에 대 한 저장소에서 사용 되지 않는 신선한 샘플을 동결. 참고: 거의 모든 원하는 식물의 줄기 나 잎 조직을 사용 합니다. 확장된 저장 시간은 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.<ol>
<li>샘플의 용도 기준으로 하 여 처리 하는 샘플의 형태와 크기를 결정 (즉, 샘플 스트립으로 잘라 기계적 테스트 응용 프로그램에 대 한 적합, 한편 8 m m 디스크 샘플 다 잘 자란 응용 프로그램에 유용 ). 잘라 잎 8 m m 디스크 날카로운, 깨끗 한 생 검 펀치 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2o. 잠수 하는 동안 참고: 전체 잎과 줄기에는이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나, 작은 샘플은 빨리 decellularize 것입니다.</li>
		<li>실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2O 세척 및 그들을 녹여 낮은 속도 설정 흔들 플레이트 세트에 5-10 분에 대 한 샘플을 품 어. 충분히 이온된 h 조2O를 사용 하 여 모든 샘플은 철저 하 게 침수 되도록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이온된 H2o. 장소에서에서의 솔루션 (유리 또는 플라스틱 접시 이상적 이다) 적합 한 컨테이너에 샘플을 준비 하 고 SDS 솔루션 샘플 표지를 추가. 손상을 방지 하기 위해 샘플에 낮은 속도를 흔들 플레이트 세트에 실내 온도 (20-25 ° C)에서 5 일에 대 한 샘플을 품 어. 참고:이 decellularization 과정을 감속 하 고 SDS에 의해 고르지 치료 이어질 수 컨테이너를 혼잡 하지 않습니다. 이 단계 동안 샘플 갈색 색조를 취득 해야 합니다.<ol>
<li>5 일 후 바꿉니다 SDS 솔루션 이온된 H2o. 품 어떤 잔여 SDS 솔루션을 철저 하 게 씻어을 흔들어 접시에 추가 10-15 분에 대 한 샘플을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10% (v/v) 표 백제 솔루션에서 1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제를 준비 합니다. 500 mL 솔루션, 백제의 50 mL와 5 mL의 비 이온 계면 활성 제를 혼합 후 이온 H2o. Submerge 445 mL을 추가 갓된 솔루션에서 샘플링 합니다. 참고: 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 없는 긴 수명, 따라서, 준비의 48 h 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>
샘플은 완전히 지워질 때까지 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 마다 24 h를 교체 (시각적 비교를 위해 그림 1A 참조). 다음 씻어 초과 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션을 2 분 동안 흔들어 접시에 이온된 수에 샘플을 품 어. 흔들어 접시 샘플을 손상을 방지 하기 위해 낮은 설정으로 설정 합니다. 참고: 샘플 사용의 선택을 취소 하는 데 필요한 시간 따라 달라 집니다, 유형 및 식물의 종. 전체 decellularization의이 샘플의 완전 한 변색 (철저 한 청소를 보장 하기 위해 DNA 정량화를 수행).<ol>
<li>년까지 그들을 저장 하는 샘플을 lyophilize (플래시 동결 액체 질소를 사용 하 여 선호,-80 ° C에서 샘플을 동결 하 셔도 됩니다) 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 하 고.</li>
		<li>Tris HCl (10 m m, pH 8.5)에서 샘플을 다시 구성 하기 충분히 코트 샘플을 사용 하 여. 혈 청 무료 미디어 사용 (린스, 표준 24 잘 접시에서 당즉 사용 150-300 µ L) 하기 전에 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 2-3 번 샘플 린스. 참고: Tris HCl 버퍼 및 혈 청 무료 미디어 (즉 DMEM, 그러나 어떤 기본적인 세포 배양 매체를 대체할 수) 낮추는 이온 H2O 혼자 치료 보다 SDS 처리 샘플의 세포 생존 능력에 대 한 영향에 더 효과적입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세제 무료 Decellularization 접근을 사용 하 여 샘플의 준비
참고:이 절차의 초기 단계 일치 단계 1.1-1.1.2 (위 참조).
<ol><li>5% (v/v) 표 백제 (NaClO)와 3% (w/v) 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3) 솔루션을 준비 합니다. F. hispida 잎 샘플 잘라 뜨거운 접시에 감동 하면서 8 m m 디스크에 대 한 60-70 ° C에 증기 두건에서 솔루션을 따뜻한. 참고: 중 탄산 나트륨 탄산 나트륨 (Na2CO3), 또는 수산화 나트륨 (NaOH)로 교체하실 수 있습니다. 원하는 온도 크게 (90 ° C로 실 온)에서 변화 하 고 사용 하는 샘플의 속성에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	<li>솔루션에는 원하는 온도 도달 하면, 일단 샘플 잠수함 하 고 그들을 손상 되지 않도록 교 반 속도 줄일 수 있습니다. 후 샘플 지워집니다 가시 (참조 그림 1B 시각적 비교를 위해), 목욕에서 신중 하 게 제거. 이온된 H2O 초과 표 백제 솔루션을 제거 하려면 1-2 분에 한 번 샘플을 품 어. 참고: 샘플을 취소 하는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 예를 들어 전체 잎 또는 줄기 완전히 취소 하 고 열 탕에 시간이 걸릴 수 있습니다와 같은 컷된 파 슬 리 10-15 분, 두꺼운 또는 더 큰 샘플 동안에 지울 수 있습니다.</li>
	<li>샘플을 lyophilize 하 고 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+from+first+principles+to+state+of+the+art.">Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+function+of+hepatocytes+on+a+novel+three-dimensional+synthetic+biodegradable+polymer+scaffold+with+an+intrinsic+network+of+channels.">Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels.</a> Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).</li><li>Park, A., Wu, B., Griffith, L. <a target="_blank" 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저자는 공개 없다.

여기, decellularize 식물 조직에 두 가지 방법은 설명 합니다. 여기, 결과 나온 프로토콜 가능성이 있다는 제안25, 이전 연구 결과 함께 결합의 광범위에 적용 가능한 종 식물, 줄기와 잎에서 수행할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 공장 decellularization 대부분 실험실에서 실행 될 수 있다 그래서 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 그것은 주목할 만한 그 decellularization, 후에 건설 기계 해야 합니다 수 functionalized 포유류 세포 접착을 촉진 하기 위하여입니다. 포유류 세포 접착 및 조직 되어 식물에 성장 수 있도록 다른 기능화 기술 설명 다른25 현재 원고는 아닙니다 주제.
두 decellularization 프로토콜 여기 (그림 1)에서 마지막 단계는 그들의 성공에 중요 했다. 때 두 메서드 중 하나를 수행 할 하지 혼잡이 목욕 하는 것은 고르지 못한 개간 귀 착될 것 이다. 이러한 메서드는 전체 잎과 줄기;에 적용할 수 있습니다 그러나, 이것은 그들을 취소 하는 데 필요한 시간의 길이 증가. 지우고 전체 샘플에 걸쳐 일관성을 유지 하는 샘플 완전히 잠긴 다는 것을 확인 하십시오. 이상적으로, decellularization 구조적 손상을 최소화 하면서 가장 세포 물질의 식물 조직을 선택을 취소 해야 합니다. 그것은 원하는 견본으로 작동 하는 데 필요한 세제 무료 메서드를 수정할 수 있습니다. 목욕 온도 시간을 빨리 맑게 될 수 있습니다 하지만 또한 손상 될 수 있습니다 더 많은 샘플에 그들은 지나치게 incubated 있다면. 낮은 온도 이상 보육 시간 필요할 수 있습니다 그리고 더 깨지기 쉬운 샘플에 대 한 적절 한 될 것 이다. 표 백제 솔루션에서의 농도 또한 가속 또는 감속 decellularization 프로세스를 변경할 수 있습니다. 세제 없는 방법으로 사용 하기 위해 새로운 샘플을 테스트 것이 좋습니다을 시작 decellularization (이상적으로 15-20 분 간격)의 진행 상황에 대 한 목욕 온도 50-60 ° C의 자주 검사 때까지 그들은 적절 하 게 지워집니다. 이 온도 범위는 기술의 최적화 하는 동안 테스트 식물 종의 대부분에 의해 잘 용납 되었다. 완료 되 면, 샘플을 시각적으로 검열 될 수 있다 하 고 수동으로 그들이 하지-incubated 되었고로 irreparably 손상 되도록 것 표시 될 찢는 또는 목욕에서 제거 시 해체. 샘플 준비 하는이 접근을 사용 하 여 세포 성장에 영향을 감소 표시 ( 그림 3A참조)만 이온 H2o. 세척과 세제 기반 방식 보다 그러나, Tris HCl (10 m m, pH 8.5)와 또한 세척 및 민감한 애플리케이션에서 특히 혈 청 무료 미디어, 하는 것이 좋습니다.
세제-기반 (SDS) 메서드는 가능성이 대부분 식물 종에 적용 가능한 최소한의 물리적 동요를 요구 하기 때문에 전체 잎과 섬세 한 샘플을 지우기 위한 특히 유용. 위에서 설명 했 듯이, 마지막 단계는 샘플의 decellularization에 대 한 중요 한. 고유한 물리적 특성을 가진 샘플 비 이온 계면 활성 제 목욕에 보육 시간을 조정 하 여 지울 수 있습니다. 이 과정의 중요 한 결점은, decellularized 조직 수 있습니다 이후에 포유류 세포의 세포 대사 활동에 영향을 미칠 수 있는 사용 하 고, 세제의 흔적입니다. 따라서, 사용 하기 전에 철저 한 세척 단계는 권장 됩니다. 여기 샘플 혈 청 자유로운 미디어 다음 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5)로 씻어 그 이온 H2O (그림 3B)그들의 사용 하기 전에 보다 더 높은 세포 생존 능력 있다고 밝혀졌다.
저장할 때 나중에 사용에 대 한 치료 샘플 메서드 중 하나에, 그것은 손상 결과 건설 기계 영향을 수 없습니다 것을 보장 하기 위해 모니터링 하는 것이 중요. 손상 또는 과도 한 취 처리 뿐만 아니라 식물 조직의 변색으로 나타날 수 있습니다. 그들은 더 이상 유용 하기 전에 그들을 활용 하기 위하여 매주 샘플 모니터링의 삭제 해야 하는 것이 좋습니다. 손상의 개시 더 이상 지속 두꺼운 더 강력한 샘플 견본 종류 사이 변화 한다.
일반적으로, 식물 바이오의 잠재 근원으로 많은 약속을 잡으십시오. 이것은 그들의 자연스럽 게 개발 된 복잡 한 구조에 의해 강화 하 고 특성 그들 있도록 그들의 네이티브 환경에서 성장. 조직 공학 공중 발판으로 성공적인 활용 식물 조직 어렵고 비용이 많이 드는, 자주 설계, 생체 재료에 대 한 잠재적으로 저렴 한 대안을 제시 한다. 본질적으로 다양 한 종에서 다른, 식물 조직의 표면 지형은 직접 공간적 지향된 세포 성장25또한 밝혀 수 있습니다. 예를 들어 이전 연구는 인간의 세포에 응답 지형 신호 decellularized 식물25에 따라서 매우 조직적인된 패턴25셀 문화이 건설 기계를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 조직 공학에는 또 다른 기능은 드 노 보 perfusability입니다. 식물 조직 유체 수송에 매우 효율적으로 년의 수백만의 수백을 통해 진화 하 고 그들의 혈관 네트워크 효율적으로 끼얹는다24를 수 있습니다. 이 속성은 셀룰러 마이그레이션 및 임상 응용 프로그램에 대 한 대체 조직 만들기의 궁극적인 목표와 신생 가이드를 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 이 높은 표면적과 상호 다공성 생체 세포 증식 하 고 이식 때 도움이 되는 증명 이전 연구의 결과 의해 지지는 vivo에서, 호스트 세포의 사용 안으로 마이그레이션 에 임 플 란 트36,,3738,39. 높은 표면적과 상호 다공성 또한 식물 조직40,,4142의 특징, 따라서 식물 파생 된 건설 기계는 주변 조직 와 통합 가능성이 vivo에서. 또한, 최근 연구 발견 decellularized 잎 성공적으로 셀24 끼얹는다 될 수 있다 인간 세포는 decellularized 식물 조직에 시드 했다 때 그들은 그들의 지형의 단서25일치. 언제 촬영된 모두 함께, 식물에서 파생 된 건설 기계 조직 엔지니어링 응용 프로그램으로 성공적으로 적용 될 필요한 속성 보유.

조직 생활을 만드는 1980 년대에 등장 하는 조직 공학 대체, 그리고 잠재적으로 주소 중요 한 장기 및 조직 부족1. 한 전략은 자극 하 고 누락 된 조직이 나 장기를 재생성 하기 위해 시체를 안내 건설 기계를 사용 하 고. 첨단 3 차원 인쇄 생산 독특한 물리적 특성으로 건설 기계와 같은 접근을 제조, 비록 달성 물리적 및 생물학적 속성의 다양 한 범위와 건설 기계를 제조 하는 능력 유지 도전2 , 3. 또한, 기능 혈관 네트워크의 부족으로 이러한 기술을 제한 되어 3 차원 조직 재생에. Decellularized 인간과 동물 조직으로 건설 기계를 사용 하 여가 문제4,5,,67우회 주 었 있다. 그러나, 높은 비용, 일괄 배치 변화, 및 제한 된 가용성의 광범위 한 사용을 제한할 수 있습니다 decellularized 동물 투어8. 또한 환자에 게 잠재적인 질병 전송 및 일부 decellularized 포유류 조직9면역학 반응에 대 한 우려가 있다.
셀 루 로스, 식물 및 세균성 소스에서 파생 된 다양 한 응용 프로그램에 대 한 바이오 재생 의학에서 생성 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다:10,11, 연골12,,1314 및 상처 치유15뼈. 그들은 내 구성과 저항 포유류 세포에 의해 분해 되 고 하는 룰의 구성 되어 건설 기계 추가 혜택이 있다. 이것이 사실은 포유류 세포는 셀 룰 로스 분자를 분해 하는 데 필요한 효소를 생산 하지 않습니다. 비교에서는, 건설 기계는 세포 외 기질, 콜라겐 등에서 고분자를 사용 하 여, 쉽게16 를 세분화 생산과 장기 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 콜라겐 건설 기계 화학 cross-linking에 의해 안정 될 수 있다. 그러나, 건설 기계17의 생체 적합성에 영향을 주는 cross-linkers의 고유한 독성 때문 교환이 이다. 반대로, 셀 루 로스 통하지 포유류 세포18,,1920효소 저하 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 이식의 사이트에 남아 있을 가능성이 있다. 이 가수분해 전처리를 통해 저하의 속도 cellulases21장비의 공동 배달을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. Decellularized 플랜트-파생 셀 룰 로스 건설 기계에서 vivo에서 의 생체 적합성도 쥐22연구에서 입증 되었습니다.
진화의 년의 수백만의 수백을 통해 식물의 구조와 구성의 유체 수송 및 유지의 효율성을 증가 하 정제는. 공장 혈관 혈관은 작은 혈관, 머 레이 법23에 따르면 포유류 맥 관 구조에 유사한으로 분기 하 여 유압 저항을 최소화 합니다. Decellularization, 후 식물의 용기 및 상호 연결 된 숨 구멍의 복잡 한 네트워크 유지 됩니다. 쉽게 사용할 수 있는 고유 식물 종의 수많은 고려 건설 기계 공장에서 파생 된 현재 조직 공학24,25건설 기계에 영향을 미치는 디자인 한계를 극복 하기 위해 가능성이 있다. 예를 들어, Modulevsky 그 외 여러분 시연 신생 및 셀 마이그레이션 decellularized 애플 조직 마우스22의 뒤에 피하 이식 했다 때 발생. 마찬가지로, Gershlak 외. 내 피 세포 decellularized 잎24의 맥 관 구조 내에서 성장 될 수 있었다 보여주었다. 별도 실험에서 Gershlak 그 외 여러분 또한 cardiomyocytes 잎의 표면에 성장 수와24계약 수를 보여줄 수 있었다.
식물은 또한 현재까지 개발 된 가장 진보 된 제조 기법으로도 달성 하기 어려운 거시적인 규모에 복잡 한 조직 세포에서 포함 됩니다. 식물 조직의 복잡 한 계층 구조 디자인은 그들이 그들의 성분26의 합계 보다 더 강한 합니다. 식물 줄기 등 견고 하 고 힘든 구성에서 배열 하는 다른 기계적 특성의 과다 보유와 같은 훨씬 더 유연 하 고 유연한 것27를 나뭇잎. 잎 크기 면에서 종에 따라 다릅니다, 그리고 모양, 강도, vascularization, 정도 휴식 및 화란의 다른 학위를가지고 있습니다. 전반적으로, 이러한 식물 속성 decellularized 식물 독특하고 대단히 기능적인 의료 기기, 건설 기계 엔지니어링 조직 등으로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
이 프로토콜 decellularize 식물 조직에 두 가지 방법에 초점을 맞추고와 같은 고 조직 공학에서 공중 발판으로 사용 하기 위해 유래한 다. 첫 번째 방법은 DNA와 포유류 decellularize 조직6,22,25 식물에 널리 사용 되는 기술에서 적응 되어 세포 물질을 제거 하는 일련의를 사용 하는 세제 기반 기술 ,,2829,30. 두 번째 방법은 세제 무료 이며 일반적으로 나뭇잎31의 부드러운 조직을 제거 하는 데 사용 하는 "skeletonization" 프로토콜에서 적응 됩니다. 이전 작업 그 주변의 부드러운 조직31는 맥 관 구조 분리를 촉진 표 백제와 나트륨 중 탄산염 해결책에서 잎을 끓인 것을 보여주었다. 이 기술은 17번째 및 18번째 세기 Albertus Seba32 및33에드워드 패 리 쉬 작품 등에서 실시 하는 실험을 다시 인용 될 수 있다. 이러한 실험을 중심으로 잎과 과일, 같은 공장 문제를 떠나 장기간 물에 잠긴 (달 주) 시간과 수 있도록 자연스럽 게 멀리 부패 부드러운 조직. 여기 "skeletonization" 접근은 셀룰러 잔류물을 제거 하 고 부드러운 조직 구조를 크게 방해 하지 않도록 낮은 온도에서 더 이상 보육 시간 등 온화한 조건, 사용에 적응 됩니다. 여기 자세한 실험에 대 한 3 개의 식물 종류 사용 되었다: 무화과나무 hispida, Pachira aquatica 및 필리핀의 종. DNA 정량화, 기계적 테스트, 그리고 두 방법 모두에서 세포 대사 활동에 미치는 영향의 결과 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:771px;" width="771">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:136px;">75746-1KG</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:111px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:136px;">807426</td>
			<td style="width:277px;">Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)</td>
			<td style="width:111px;">Clorox</td>
			<td style="width:136px;">Item #: 31009</td>
			<td style="width:277px;">Standard concentrated bleach.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:111px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">217120010</td>
			<td style="width:277px;">Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">8 mm Biopunch</td>
			<td style="width:111px;">HealthLink</td>
			<td style="width:136px;">15111-80</td>
			<td style="width:277px;">Cuts samples that fit well in 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Belly Dancer-Shake table</td>
			<td style="width:111px;">Stovall Life Sciences</td>
			<td style="width:136px;">BDRAA115S</td>
			<td style="width:277px;">Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Isotemp hot/stir plate</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any style/brand of hot/stir plate.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:247px;">Beaker</td>
			<td style="width:111px;">Any</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:277px;">Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP153-500</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">MT50003PC</td>
			<td style="width:277px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:247px;">Quant-iT Picogreen dsDNA assay</td>
			<td style="width:111px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:136px;">P11496</td>
			<td style="width:277px;">Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two methods for decellularization of plant tissues for tissue engineering applications

헌, 합성, 및 동물 파생 된 이식 조직 교체에 대 한 건설 기계로 현재 사용 되는 낮은 가용성, 불 쌍 한 생체 적합성 및 비용 제한이 있습니다. 식물 조직 그들이 유일 하 게 적합 상호 다공성, 기존 혈관 네트워크, 그리고 다양 한 기계 건설 기계, 높은 표면적, 우수한 물 수송 및 보존, 등으로 사용 하는 유리한 특성이 있다 속성입니다. 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 식물 decellularization의 2 개의 성공적인 방법이 여기 설명 되어 있습니다. 첫 번째 방법은 포유류 조직 취소 하는 데 사용 하는 이전 설립된 방법과 비슷합니다 세포 물질을 제거 하는 세제 목욕을 기반으로 합니다. 두 번째 잎 맥 관 구조를 격리 하 고 온수 표 백제 및 잎과 줄기를 소금 목욕의 사용을 포함 하는 프로토콜에서 적응 하는 세제 무료 방법입니다. 두 방법 모두 유사한 기계적 특성 및 낮은 세포 대사 충격, 따라서 더 나은 그들의 의도 된 응용 프로그램을 적합 한 프로토콜을 선택 하려면 사용자를 허용 건설 기계를 얻을.

두 방법 모두 굴복 건설 기계 세포 배양 및 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 적합 했다. 그림 1 세제 기반 메서드와 세제 없는 메서드에 대 한 컷된 샘플 (8 m m 직경)에 그대로 잎을 사용 하 여 decellularization 프로세스의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 무화과나무 hispida 조직 두 방법 모두 다음의 성공적인 decellularization 나왔고 명확 하 고 그대로 샘플 (그림 1A 및 1B). 그것은 전체 식물 조직 (그림 1A); decellularize 수 그러나, 작은 샘플을 빠르고 효과적으로 취소 등장. 세제-기반 접근 방식으로 관찰 잠재적인 문제 참여 비 이온 계면 활성 제 탕 (그림 1C)에서 조기 제거 결과로 이기종 decellularization. 세제 없는 방법의 단점은 온수 욕조 (그림 1D)에 연장된 보육 인해 손상이 발생할 수 있습니다.
두 방법 모두를 사용 하 여 준비 decellularized 장비의 기계적 특성으로 다른 연구24,34에 단축 인장 시험을 사용 하 여 조사 되었다. 이 테스트는 최대 탄젠트 계수 (MTM) (그림 2A), 실패 (SAF) (그림 2B)와 궁극 장력 강도 (UTS) (그림 2C) F. hispida 와 Pachira aquatica 샘플에 대 한 스트레인 나왔고. P. aquatica 샘플 두 decellularization 프로토콜을 사용 하 여 준비 매개 변수 측정의 모든 3에 걸쳐 유사한 기계적 특성을 표시 합니다. F. hispida 샘플 테스트는 UTS 제외 하 고 모든 경우에 비슷한 추세를 보였다. 특히, 세제 기반 (SDS) 프로토콜을 사용 하 여 준비 샘플 세제 무료 (표 백제) 방식으로 준비 보다 더 높은 평균 UTS 결과 했다. 이러한 결과 다른 식물에서 수집 된 샘플 뚜렷한 decellularized 비 계 속성 두 decellularization 프로토콜을 통해 준비 하는 때 생성 될 수 있습니다 보여 줍니다.
측정 하려면 DNA 제거, 샘플 했다 방법 중 하나를 사용 하 여 지워지고 그들의 게놈 DNA가 이전 설립된 프로토콜35를 사용 하 여 격리 된. 두 decellularization 방법 (세제 및 세제 무료) 크게 감소 2.47 샘플의 게놈 DNA 콘텐츠 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 0.18)와 2.71 조직의 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 1.60) 각각 (그림 2D). 비 decellularized 샘플 했다 104.67 조직의 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 26.21) (그림 2D). DNA 콘텐츠 decellularization 표시 식물 세포의 효과적인 제거 후에 상당한 감소 중요.
두 개의 decellularization 방법의 세포 생존 능력에 미치는 영향 인간 피부 섬유 아 세포 (hDF) decellularized P. aquatica 필리핀 건설 기계 면 전에 서 2 일에 대 한 교양된의 신진 대사 활동을 측정 하 여 평가 되었다. hDFs 건설 기계 세제 기반 메서드 (그림 3A)를 통해 준비 대 세제 무료 메서드를 통해 decellularized의 경작 하는 때 더 높은 신진 대사 활동을 했다. 에 decellularization, 실험의 추가 설정 하는 동안 사용 하는 시 약의 철저 한 제거는 준비 된 건설 기계 씻 겨 광범위 하 게 세포 배양 전에 수행한 확인 합니다. 두 개의 별도 세척 방법 샘플 세제 기반 방식을 사용 하 여 준비에 시험 되었다: Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5)에서 세척 뒤 대 혈 청 무료 미디어에서 세척 2 세척 이온 H2o. 두 방법 모두 1 x PBS 최종 세척 단계 사용합니다. 이후 decellularized 공장 건설 기계에 노출 하는 포유류 세포에 미치는 영향 위와 같은 대사 활동 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 혈 청 무료 미디어 다음 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 이온된 H2O, 세제 무료에서 샘플에 비해 세제 기반 방식으로 처리 하는 샘플을 만들기에 비해 세포 대사 활동에 미치는 영향을 줄이기 위해 도움이 방법 (그림 3B)입니다.
그것은 이전 포유류 세포 세제 기반 접근25;를 사용 하 여 준비 하는 건설 기계에 성장할 수 있는 표시 했다 따라서, 그것은 이전 안 된 세제 무료 방법으로 준비 하는 샘플에 이것을 설명 하는 데 필요한 했다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 시드 했다 비 계 당 20000 셀에서 F. hispida 잎 샘플 (8 m m 디스크) decellularized 고 24 h에 대 한 품 어 수. 이러한 건설 기계 했다 공업화 준수 촉진에 RGD 도파민 켤레와 셀 소개 하기 전에. 그림 4 는 전형적인 샘플에서 수집 된 이미지를 보여 줍니다. 밝은 분야 이미지 샘플 사용 (그림 4A)의 섹션의 전체 구조를 표시 하도록 수집 되었다. MSCs는 calcein를 사용 하 여 및 형광 현미경 (그림 4B) 몇 군데 얼룩이 했다. 이미지 (그림 4C)는 잎의 표면에 성장 하 고 있는 셀의 위치를 표시 하기를 중첩 후 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig1.jpg"> 그림 1 . Decellularization 식물 조직에 대 한 일반적인 워크플로입니다. 식물 조직 (세탁기 및 준비 단계는 유니버설);의 decellularization에 대 한 일반적인 워크플로 (A) 상위 경로 세제 무료 방법에 대 한 세제 기반 방법 (B) 하단입니다. F. hispida 잎의 비 이온 계면 활성 제/표 백제 목욕 (D) A 손상 decellularization에서 조기 제거로 인해 세제 기반 메서드를 사용 하 여 피 aquatica 잎의 (C)는 불완전/실패 decellularization 온수에서 장기간된 외피 때문 세제 무료 방법에서 솔루션을 표 백제. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig2.jpg"> 그림 2 . 기계적 성질 및 방법 사이 decellularization의 효과의 비교. ± SD; 의미 통계 분석 수행 했다 두 표본 t-검정 및 p 나열 된 값 어디 통계적 (작거나 보다 0.05)를 사용 하 여. F. hispida 의 샘플 및 P. aquatica (세제-기반 접근, 세제 무료, 대 한 빨강과 녹색 치료 샘플에 사용 되는 파란색 막대) 사이 기계적인 테스트의 비교 결과 (F. hispida 세제 기반 n = 4, 세제 없는 n = 2; P. aquatica 세제 자료 n = 3, 세제 무료 n = 4) (A) 최대 탄젠트 계수 (MTM) (B) 스트레인 실패 (SAF) (C)와 궁극 장력 강도 (UTS)에서. (D) A dsDNA 정량화 분석 결과 각 그룹에서 3 개의 샘플에 3 중에서 실행 되었다: 치료 (신선한, n = 3), 세제 무료 방법 (표 백제, n = 3) 및 세제 기반 방법 (SDS, n = 3), p 값은 decellularization 메서드 그룹 치료 샘플 그룹에 비해입니다. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig3.jpg"> 그림 3 . 두 개의 decellularization 메서드 간에 미치는 영향을 비교 하는 신진 대사 활동 분석 결과 결과. 의미 ± SD; 통계 분석 수행 했다 2-표본 t-검정을 사용 하 여 및 (작거나 보다 0.05) 통계적으로 중요 한 곳을 나열 된 p 값. 세포 대사 활동 P. aquatica 와 필리핀 (아무 샘플 추가 제어 웰 스도 정규화)의 종의 조직 샘플의 측정 했다 두의 대사 영향의 (A) 비교 표시 decellularization 메서드 (n = 3 각 그룹에 대 한) 및 (B) 비교 두 가지를 사용 하 여 신진 대사 활동에 대 한 영향의 세척 방법 세제 기반 프로토콜에서: Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 혈 청 자유로운 미디어와 결합 (n = 4) 대 이온 H 2 O (n = 4). <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57586/57586fig4.jpg"> 그림 4 . 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 표면에 성장 무화과나무 hispida 잎, RGD 도파민 켤레와 기능성된 decellularized. MSCs F. hispida 잎에 성장, 세제 무료 메서드에서 decellularized 되었고 RGD 도파민 공액 (바 참조에 대 한 추가 500 µ m 규모)와 기능성 decellularized 리프 (B의 섹션의 (A) 밝은 필드 이미지 ) Calcein의 형광 이미지 스테인드 MSCs 잎 표면 (C) 결합 된 밝은 분야 및 형광 이미지에 성장. <a href="/files/ftp_upload/57586/57586fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

two-methods-for-decellularization-plant-tissues-for-tissue

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K 조회수.  University of Wisconsin-Madison. 여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

비디오: Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

심근 조직 공학을위한 생물학 유래 주사용 재료의 제조

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

연구

생체공학

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

외과 검색, 분리 및<em&gt; 체외</em&gt; 조직 공학 응용 프로그램에 대한 인간의 전방 십자 인대에서 파생 된 세포의 확장

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.

Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.

조직 공학 Thermoresponsive 나노 구조 표면의 제조

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin exine capsules (SECs) are obtained when spores or pollen are processed so as to remove the internal sporoplasmic contents. The resulting hollow microcapsules exhibit a high degree of micromeritic uniformity and retain intricate microstructural features related to the particular plant species. Herein, we demonstrate a streamlined process for the production of SECs from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs. The current SEC isolation procedure has been recently optimized to significantly reduce the processing requirements which are conventionally used in SEC isolation, and to ensure the production of intact microcapsules. Natural L. clavatum spores are defatted with acetone, treated with phosphoric acid, and extensively washed to remove sporoplasmic contents. After acetone defatting, a single processing step using 85% phosphoric acid has been shown to remove all sporoplasmic contents. By limiting the acid processing time to 30 hr, it is possible to isolate clean SECs and avoid SEC fracturing, which has been shown to occur with prolonged processing time. Extensive washing with water, dilute acids, dilute bases, and solvents ensures that all sporoplasmic material and chemical residues are adequately removed. The vacuum loading technique is utilized to load a model protein (Bovine Serum Albumin) as a representative hydrophilic compound. Vacuum loading provides a simple technique to load various compounds without the need for harsh solvents or undesirable chemicals which are often required in other microencapsulation protocols. Based on these isolation and loading protocols, SECs provide a promising material for use in a diverse range of microencapsulation applications, such as, therapeutics, foods, cosmetics, and personal care products.

This protocol/manuscript describes a streamlined process for the production of sporopollenin exine capsules (SECs) from Lycopodium clavatum spores and for the loading of hydrophilic compounds into these SECs.

마이크로 캡슐화 애플리케이션을위한 추출 공장 기반 캡슐

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...