이 연구는 NINR (F32NR013611)에서 재정 지원을 받았다. 우리는 더 인정 하 고 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 및 FracLac의 개발자 감사 합니다 하 고 싶습니다 (알 간다 카레라스 외. , Karperien 그 외 여러분, 각각)는 여기에 설명 된 분석 되지 않을 것 이라고 수 없이.

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저자는 공개 없다.

Microglia 셀 가늘게 생리학과 병리학 그들의 마이크로-도메인 내에서 조정 하 고 미묘한7,14 에 심한 부상8형태학2 의 다양 한 범위를 표시 합니다. ImageJ 프로토콜의 사용 microglia 형태학 정량화 모든 실험실에 액세스할 수 있는 플랫폼으로 만들고 플러그인 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어는. 설명된 프로토콜 이미지 처리 및이 소프트웨어를 사용 하 여 분석에 초점을 맞추고, 하는 동안 데이터 수집, 유효성 및 안정성의 일관성 우수한 IHC와 현미경 검사로 시작 합니다. 이 프로토콜 이진, 해골, 그리고 전체 photomicrographs 및 단일 셀의 개요 대표를 개선 하는 데 사용 하지만 가난한 IHC 염색의 자리를 차지할 수 없습니다 그리고 낮은 반면, 결과 현미경 흐리게, 또는 왜곡 이미지. 추가 고려로 해야 합니다 주의 microglia 형태를 번복할 수 변경 저장, 단면, 전에 동안 뇌 조직의 병합을 하지. 마지막으로, 각 실험에서 microglia 해야 될 몇 군데 같은 현미경으로 동일한 규모를 사용 하 여. 계측, 목표, 및 소프트웨어 현미경 비슷한 목표에도 불구 하 고 다른 크기의 photomicrographs 귀착되 고 세부 사항 뿐만 아니라 각 프레임 내에서 셀의 수 사이 다. 예를 들어 이미지 수집 Leica SPII에 40 X 목표를 사용 하 여 두 수 세포와 수집 Zeiss 880을 사용 하 여 보다 자세히 결과. 이것은 전체 프레임 보다는 단일 셀에서 수집 된 셀 분파 데이터에 대 한 특히 중요 한이 데이터 샘플링의 문제가 된다.
일반적으로, 해골 분석 전체 photomicrograph를 이용 하는 두 가지 이유로 단일 셀 프랙탈 분석을 선행 한다. photomicrograph에 있는 모든 셀의 결정 셀 분파는 급속 한 때 단일 셀 프랙탈 분석에 비해 시간이 요인 경우 심사 도구로 고려 될 수 있습니다. 또한, 골격 분석 하는 동안 파생 된 이진 이미지 프랙탈 분석을 위해 사용 됩니다. 일단 몇 군데, 사용자 영향을 소개 기초 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 중요 한 단계 수가 있습니다. 사용자 간의 대부분 변수 프로토콜 단계 단계 4.2 (증가 이미지 밝기) 이며 (임계값 결정) 4.5 단계. 가능 하면, 밝기 (0-255 사이의 max 또는 min 슬라이더)를 증가 하는 최적의 수 결정 이며 모든 이미지와 사용자를 위해 일정 하 게 유지. 이미지 변화는 훌륭한, 사용자 대신 밝기는 이미지 사이 선택할 수 있습니다. 또는, 이미지는 밝고 콘트라스트가 높은 경우 생략 될 수 있습니다 다음 밝기를 증가 하 고 임계 처리 전문 임계값 필터를 사용 하 여 표준화 될 수 있다 (예., 황) 보다는 더 많은 변수 기본. 일단 최적화, 추가 사용자 영향을 최소화 하기 위해 매개 변수를 준수 해야 됩니다.
사용자 가변성의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 따라서 다양성 증가 사용자 1과 사용자 2 모두 데이터 컬렉션에 기여 하는 경우와 데이터 값 사용자 1과 사용자 2 대 증가 했다. 사용자 1 및 사용자 2 바이너리 및 해당 이미지의 차이의 예를 들어 컬러 서클 (그림 5)에 의해 강조 표시 됩니다. 이 경우, 두 사용자가 microglia에 제한 된 전문성을 갖춘 짧게 훈련된 학부 학생 이었다. 정기적인 감독과 microglia 증가 프로토콜 교육2 함께 전문가 의해 멘토링 간 사용자 가변성을 줄일 수 있습니다. 비록 여기 평가 하지, 프랙탈 분석이 작습니다 간 사용자 변화에 따라 이진은 수동으로 하 고 개별적으로 고립 된 임계 처리 microglia 모양 결정에 전적으로 의존 하는 것 보다는 한 photomicrograph 이기 때문에. 그러나, 모든 방법을 사용자 간의 몇 가지 변화를 보유합니다. 따라서, 단일 사용자 (이상적으로, 일부 전문 microglia 셀에 의해 훈련)는 전체 데이터 집합에 대 한 데이터 수집을 완료 해야 합니다.
추가 수정이이 프로토콜을 쉽게 만들 수 있습니다 하 고 이미지 품질과 노이즈를 줄이고 과정 연결을 보장 하는 노력에 따라 달라 집니다. 예를 들어 대비 충분 한 경우에, 언샵 마스크 필요 하지 않습니다 그리고 생략 될 수 있습니다. 그것은 최적화 하 고 이미지, 실험 사례 및 전체 집합에서 데이터를 수집 하는 전에 컨트롤의 특정 집합에 대 한 프로토콜을 마무리 하. 마지막으로, 추가 플러그인 사용할 수 있습니다 다른 장소를 명확히 하거나 이전에이 프로토콜에서 설명 되지 않은 이미지를 선명 하 게와 같은 팽창 또는 선명 하 게.
이 프로토콜의 이점은 그것의 보편적인 가용성 및 적응성 이다. 또한, 신속 하 고 전체 photomicrograph에 적용은 AnalyzeSkeleton를 사용 하 여 셀 분파를 평가입니다. 다중 셀 분석 방법의 이점은 전체 지역 보다는 단일 셀에 초점 이다. 따라서, 신속 하 게 이미지 내의 모든 microglia의 조건 (끝점 및 프로세스 길이) 평균 분파를 평가 가능 하다. 여러 셀의 분석을 제공 하는 뼈대 분석: 프랙탈 분석 photomicrographs에서 단일 셀을 필요한 시간 투자 때문에 의해 일치할 수 없는 셀 숫자의 측면에서 데이터 샘플링. 이 보일 수 있는 가장 적합 한 인스턴스 microglia 형태학 근거리 초점 부상에서 상영 될 것입니다. 한 제한은 전체 필드 이미지 렌더링 IHC photomicrographs의 뼈대 모델을 만들 때 더 많은 시간이 소요 단일 셀 방식에 비해 완벽 하지 않습니다. 또한, 지역 분석 적합 하지 않다 상황에 크게 동일한 필드 내 다른 microglia 형태학이 있다. 마지막으로,이 분석 방법은 세포 수, 실험 조건 간에 다를 수 매개 변수에 따라 달라 집니다.
프랙탈 분석 단일 셀에 진행 되며 따라서 뼈대 분석에서 결과 평균 셀 분파 데이터 출력을 보완 한다. 하지만 훨씬 더 많은 시간을 소모 하 고,이 투자 형태학 데이터의 광범위 한 범위를 생성 합니다. 예를 들어 세포 밀도, 스팬 비율, 그리고 순환 데이터 크기, 연신 율, 및 셀 개요의 모양을 각각 설명. 프랙탈 차원 및 lacunarity 요약 셀 복잡성과 모양이, 각각. 각 매개 변수를 계산 하는 방법 및 데이터 해석 될 수 있습니다 방법의 자세한 요약 대화형 수동16 에서 제공 되 고 같은 세부 구체적인 연구 질문에 관하여 고려 되어야 한다. 척도 생리 및 pathologic 조건에서 발생할 수 있는 2D microglia 형태학에 작은 변화를 중요 한 도구에 설명 된 프로토콜 결과. 견고, 볼록함이, 폼 팩터16,20 등 추가 형태학 분석 가능한 3D 도형을 생성 하는 경우 있을 수 있습니다.
프로토콜 개발 및 적응은 지속적이 고 사용자 중심. 그것은 소량/밝은-필드 이미지7 하지만 아직 임베디드 조직 파라핀 형광8 에서 확장 되었습니다. 그것은 또한, 추가 분석에 대 한 Imaris 등 독점 소프트웨어와 함께에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 생리학의 다양 한에 적용 될 수 microglia에 국한 되지 않습니다 하지만 어떤 셀 또는 특정 패턴 또는 IHC 메서드를 사용 하 여 식별 될 수 있는 조직에 적용 될 수 있습니다. 마지막으로, 충분 한 샘플 크기, 복수 또는 클러스터 분석에 적용할 수 있는 형태12,21;에 따르면 microglia 충 이것은 의미 있는 정보 microglia 형태학은 microglia 기능 및 그들의 주위에 응답의 중요 한 지표 이다입니다. Microglial 형태 론 적 다양성에 대 한 감사는 확장 하 고 완전히 건강 및 질병 명과 혈관 신경 상호 작용을 이해 하는 것이 중요. 이 분야에 있는 성장 계량 microglia 형태학 여러 연속 변수를 사용 하 여 요약을 개발, 사용 하기 쉬운, 그리고 재현성 프로토콜에 의해 향상 됩니다.

Microglia 있는에 대 한 즉각적이 고 다양 한 형태 론 적 응답 변경 가능성의 연속체를 따라 뇌 생리학1 드 없는 및 amoeboid 형태학2에 하이퍼 분파와 매우 복잡 한 형태학에서 다양 . Microglia 또한 편광 및 막대 모양의3될 수 있습니다. Microglia 셀 분파 일반적으로 여러 프로세스 하는 데 복잡 한 모양으로 정의 된 고 셀 당 끝점의 수와 세포 프로세스의 길이 자주 보고 됩니다. Microglia 연속 셀 잡담 그리고 vivo에서 운동 성4,5신경 그리고 glial 기능을 정밀 하 게 조정 된다, 때문 microglia 형태학에 다양 한 세포 기능 및 장애의 지표로 사용할 수 있습니다. 두뇌. 양적 접근 필요 적절 하 게 이러한 morphologic 변화의 다양성을 설명 하 고 없는 셀 (예: 간 질5,6 미묘한 생리 물결에서 발생 하는 간의 차이 구별 하는 그리고 뇌 진 탕7) (스트로크8) 같은 심한 부상에 뿐만 아니라. 형태학 정량화7,8,9,10,11,12,,1314 의 사용 증가 건강 및 질병 동안 microglia 형태학의 전체 다양성을 발표할 예정 이다. 현재 연구 ImageJ 플러그인 microglia의 형광 또는 비 형광 photomicrographs에서 microglia 형태를 요약 하는 데 필요한의 단계적 사용 immunohistochemistry (IHC) 후 고정된 쥐 나 조직에 취득 세부 사항.
중앙 분석 기술을 설명 하는 ImageJ 플러그인 AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, 2010 년 큰 유 방 구조, 계량에 개발 및 FracLac16, ImageJ 및 프랙탈 분석을 통합 하는 2014 년 개발 계량 개별 microglia 모양. 이러한 플러그인 전체 photomicrographs 이내 microglia 분파의 신속한 분석 또는 photomicrograph에서 정의 된 투자 수익의 여러 microglia를 제공합니다. 이 분석은 혼자 또는 보완 프랙탈 분석에 사용할 수 있습니다. 단일 셀 프랙탈 분석 (FracLac) 시간의 투자가 필요 하지만 microglia 복잡성, 모양 및 크기에 관한 여러 형태로 출력을 제공 한다. 두 도구를 사용 하 여 중복, 셀으로 분파는 셀 복잡성, 상호 보완적 이며 여러 매개 변수 조합 데이터 집합12,17내 다양 한 microglia 형태학 사이 구별 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia 뇌 식 세포 두뇌 항상성에 참여 하 고 지속적으로 장애, 부상 및 질병에 대 한 그들의 환경 조사는. 첫 번째 응답자로 microglia 신경 및 명과 장애를 완화 하기 위해 중요 한 기능 그리고이 과정에서 그들은 다양 한 형태 론 적 변화를 받게. Microglia 형태학 기술적 분류 될 수 있다 또는, 또는, 셀 분파, 복잡성, 모양 등의 매개 변수에 대 한 지속적인 가변으로 측정할 수 있습니다. Microglia 측정 방법 단일 셀에 적용 하는 동안 몇 가지 기술을 여러 microglia 전체 photomicrograph에 적용 됩니다. 이 방법의 목적은 여러 계량 하 고 쉽게 사용할 수 ImageJ 프로토콜을 사용 하 여 단일 셀. 이 프로토콜은 단계 요약 ImageJ 플러그인 대표 이진 및 해당 이미지에 형광 고 밝은 필드 photomicrographs를 변환 하 고 그들을 분석 하는 것이 좋습니다 (2D/3D) AnalyzeSkeleton 및 FracLac 소프트웨어 플러그인을 사용 하 고 형태 데이터 컬렉션에 대 한입니다. 이러한 플러그인의 출력 프로세스 끝점, 교차점, 및 길이 뿐 아니라 복잡성, 셀 모양 및 크기 설명자 셀 형태를 요약합니다. 여기에 설명 된 뼈대 분석 프로토콜은 FracLac 무료 개별 셀 분석을 제공 하는 반면 전체 photomicrograph 또는 관심 (ROI)의 지역 내에서 여러 microglia 지역 분석에 대 한 적합 합니다. 결합, 프로토콜은 목표, 건강 하 고 손상 된 두뇌에 다양 한 microglia 형태학 사이 충에 사용 될 수 있는 민감한, 그리고 종합 평가 도구를 제공 합니다.

여기에 설명 된 microglia 형태 분석 프로토콜 요약 단계 형광 및 형태학 분석에 대 한 한 덩어리 photomicrographs를 처리 하는 데 도움이. 다음이 단계는 그림 2 에 요약 시각적으로 그리고 그림 3. 이 단계의 목표는 축적 된 데이터는 유효 적절 하 게 원래 photomicrograph 모델 대표 이진 하 고 해당 이미지를 만드는 것입니다. 응용 프로그램 프로토콜, 후 AnalyzeSkeleton 플러그인에서 태그 해골 이미지에서 결과 끝점 및 지점 수 (즉., 프로세스) lengthcan 결과 출력 파일에서 요약 될. 끝점 및 길이 데이터 처리 다음 microglia 분파 photomicrograph 또는 투자 수익의 정도 추정 하는 데 사용 됩니다. 그림 4 에 결과 데이터 (끝점/셀 및 프로세스 길이/셀)와 프로토콜 응용 프로그램 없이 수집 요약 되어 있습니다. 유사한 동향은 존재, 그림 4 층 에 요약 데이터 그림 4E에 비해 적은 변수 있습니다. 또한, 이러한 데이터 프로토콜을 적용 하는 경우 그룹 간의 차이 감지 하 감도 증가 설명. 마지막으로, 해야 합니다 주의 프로토콜의 응용 프로그램에서 간 사용자 변화에 관한 합니다. 이러한 차이 그림 5 는 같은 데이터 집합 두 개의 독립적인 사용자가 위에 요약 된 것 처럼 동일한 프로토콜을 적용 분석 했다 요약 된다.
추가 형태 데이터 프로토콜 응용 프로그램 중에 만들어진 바이너리 이미지에서 고립 된 단일 셀에서 수집 됩니다. 분석 하기 전에 microglia 형태학 및 FracLac 플러그인은 그림 6에 요약을 사용 하 여 프로토콜 단계. 우리 모두 손상 되지 않은 (그림 6A)에이 분석을 설명 하 고 부상 (그림 6B) 조직. 이진, 윤곽선, 볼록 선체/캡슐화 원과 상자 계산 예 각 셀으로 분석 하 고 프로토콜 없이 응용 프로그램은 그림 6 c-f. 에 표시 됩니다의 대표 이미지 이러한 이미지 그림 6G에 요약 되어 있는 형태 데이터에 있는 다름의 유래를 설명 하는 데 도움이.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> 그림 1입니다. 단일 기원 소마 (최적의)와 해당된 셀과 원래 photomicrograph 사이 해당 오버레이 대 원형 소마 (차선)와 해당된 microglia의 일러스트. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> 그림 2입니다. 형광 photomicrographs 응용 프로그램 프로토콜. 단일 셀 형광 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화는 세부 정보 표시를 잘립니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> 그림 3입니다. 밝은 분야 DAB 응용 프로그램 프로토콜 photomicrographs. 세부 정보 표시를 자른 단일 셀으로 밝은 분야 명인 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> 그림 4입니다. 데이터 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. (A) 형광 IHC와 노란색 상자 (B)에 해당 하는 자른된 세포의 예를 들어 photomicrograph. 예를 들어 이진 및 해당 이미지 (C) (D) 설명 된 대로 적용 하는 프로토콜 없이. Microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀의 요약 데이터 (흰색) 상승과 부상 (E) (회색) 대뇌 피 질의 조직 및 (F) 없이 프로토콜 적용. 스튜던트 t-검정 및 n을 사용 하 여 통계 분석 = 3, * * p < 0.01을 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> 그림 5입니다. 응용 프로그램 프로토콜 사용자 차이. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 이진과 해골 이미지는 원래 이미지와 프로토콜 변환의 예입니다. 두 이미지의 차이 색된 동그라미를 일치 하는 강조 표시 됩니다. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 손상 되지 않은 및 손상 된 두뇌 지구에서 microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀 데이터의 요약 그래프. 통계 분석 ANOVA와 샘플 크기는 n = 3; p < 0.05 * *p < 0.01, * * *p < 0.001. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> 그림 6입니다. 프랙탈 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. 손상 되지 않은 (A)와 해당 이진 (C), 및 개요 (D) 이미지를 적용 하는 프로토콜 없이 결과 부상된 (B) 피 microglia의 자른된 photomicrographs의 예입니다. 관련된 볼록 선체 (파란색)와 해당 개요 도형 (E) (핑크) 원형 바깥쪽 모양 밀도 계산, 비율, 및 순환 (G)에 사용 됩니다. 계산 방법 상자 (F), 설명 및 프랙탈 차원 (DB) 및 lacunarity (λ) 계산 (G)에 대 한 사용. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

67.1K 조회수.  University of Arizona. Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

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Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

연구

신경과학

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and simple protocol to detect protein expression during craniofacial morphogenesis/pathogenesis using mouse craniofacial tissues as examples. The protocol consists of preparation and cryosectioning of tissues, indirect immunofluorescence, image acquisition, and quantification. In addition, a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues for immunostaining is described, using craniofacial tissues and long bones as examples. Those methods are key to determine the protein expression and morphological/anatomical changes in various tissues during craniofacial morphogenesis/pathogenesis. They are also applicable to other tissues with appropriate modifications. Knowledge of the histology and high quality of sections are critical to draw scientific conclusions from experimental outcomes. Potential limitations of this methodology include but are not limited to specificity of antibodies and difficulties of quantification, which are also discussed here.

Here, we present a detailed protocol to detect and quantify protein levels during craniofacial morphogenesis/pathogenesis by immunostaining using mouse craniofacial tissues as examples. In addition, we describe a method for preparation and cryosectioning of undecalcified hard tissues from young mice for immunostaining.

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

발생학

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

의학

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within patient samples of glioblastoma, the deadliest and most invasive brain cancer. Not only are quantitative methods beneficial for accurately describing diseased tissues, they can also potentially contribute to more accurate prognosis, diagnosis, and the development of tissue-engineered systems and replacements. In glioblastoma, glial cells, such as microglia and astrocytes, have been independently correlated with poor prognosis based on pathologist grading. However, the state of these cells and other glial cell components has not been well-described quantitatively. This can be difficult due to the large processes that mark these glial cells. Furthermore, most histological analyses focus on the overall tissue sample or only within the bulk of the tumor, as opposed to delineating quantifications based on regions within the highly heterogeneous tissue. Here, we describe a method for identifying and quantitatively analyzing the populations of glial cells within the tumor bulk and adjacent regions of tumor resections from glioblastoma patients. We used chromogenic immunohistochemistry to identify the glial cell populations in patient tumor resections and ImageJ to analyze percent coverage of staining for each glial population. With these techniques we are able to better describe the glial cells throughout regions of the glioma tumor microenvironment.

This protocol was developed to quantitatively identify tumor microenvironment components in glioblastoma patient resections using chromogenic immunohistochemistry and ImageJ.

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

면역학 및 감염병학

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within cells. Neurochemical phenotyping of functionally identified neurons usually requires concurrent labelling with multiple antibodies (targeting protein) using immunohistochemistry (IHC) and optimization of in situ hybridization (targeting RNA), in tandem. A &#34;neurochemical signature&#34; to characterize particular neurons may be achieved however complicating factors include the need to verify FISH and IHC targets before combining the methods, and the limited number of RNAs and proteins that may be targeted simultaneously within the same tissue section.
Here we describe a protocol, using both fresh frozen and fixed mouse brain preparations, which detects multiple mRNAs and proteins in the same brain section using RNAscope FISH followed by fluorescence immunostaining, respectively. We use the combined method to describe the expression pattern of low abundance mRNAs (e.g., galanin receptor 1) and high abundance mRNAs (e.g., glycine transporter 2), in immunohistochemically identified brainstem nuclei.
Key considerations for protein labelling downstream of the FISH assay extend beyond tissue preparation and optimization of FISH probe labelling. For example, we found that antibody binding and labelling specificity can be detrimentally affected by the protease step within the FISH probe assay. Proteases catalyze hydrolytic cleavage of peptide bonds, facilitating FISH probe entry into cells, however they may also digest the protein targeted by the subsequent IHC assay, producing off target binding. The subcellular location of the targeted protein is another factor contributing to IHC success following FISH probe assay. We observed IHC specificity to be retained when the targeted protein is membrane bound, whereas IHC targeting cytoplasmic protein required extensive troubleshooting. Finally, we found handling of slide-mounted fixed frozen tissue more challenging than fresh frozen tissue, however IHC quality was overall better with fixed frozen tissue, when combined with RNAscope.

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

This protocol describes a method for combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and fluorescence immunohistochemistry (IHC) in both fresh frozen and fixed mouse brain sections, with the goal of achieving multilabel FISH and fluorescence IHC signal. IHC targeted cytoplasmic and membrane attached proteins.

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

요약

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환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Section(신선 냉동 또는 고정 마우스 뇌 절편에서 Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization과 형광 면역조직화학의 결합)

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화