Questo studio ha ricevuto il sostegno finanziario da NINR (F32NR013611). Vorremmo ulteriormente riconoscere e ringraziare gli sviluppatori di AnalyzeSkeleton(2D/3D) e FracLac (Arganda-Carreras et al e Karperien et al., rispettivamente) senza che l'analisi descritta nel presente documento non sarebbe possibile.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod+microglia:+a+morphological+definition.">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096 (2014).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients,+Impairs+Microglial+Motility,+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis/Microglial+Phagocytosis+Uncoupling.">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466 (2016).</li><li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus.">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection (2017).</li><li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury.">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211 (2017).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion.">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li><li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors.">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers.">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li><li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+response+to+Alzheimer's+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments.">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li><li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis.">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li><li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study.">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li><li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice.">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li><li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+reconstruction+of+histological+sections:+Application+to+mammary+gland+tissue.">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li><li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+microglia+activation:+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction.">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576 (2017).</li><li>. ImageJ User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2014)</li><li>Karperien, A. L., Jelinek, H. F., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractal,+Multifractal,+and+Lacunarity+Analysis+of+Microglia+in+Tissue+Engineering.">Fractal, Multifractal, and Lacunarity Analysis of Microglia in Tissue Engineering.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3 (51), eCollection (2015).</li><li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+quantitative+analysis+of+microglial+morphology.">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li><li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis.">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Cellule di microglia sono finemente sintonizzate per la fisiologia e la patologia all'interno dei loro micro-domini e visualizzare una vasta gamma di morfologie2 in sottile7,14 e lesioni lordo8. L'uso di protocolli ImageJ rende quantificazione di morfologia di microglia accessibile a tutti i laboratori come la piattaforma e plugin sono un'immagine di open source software di elaborazione. Mentre il protocollo descritto si trova sull'elaborazione delle immagini e analisi usando questo software, la consistenza della raccolta dei dati, validità e affidabilità inizia con eccellente IHC e microscopia. Questo protocollo è utilizzato per migliorare binary, scheletro e rappresentazioni di muta di intero microfotografie e singole cellule ma non può prendere il posto di scarsa colorazione IHC e microscopia che si traduce in basso contrasto, offuscata, o immagini distorte. Come un'ulteriore considerazione, si deve prestare attenzione non per appiattire il tessuto cerebrale durante il deposito, prima del sezionamento, che altera irrevocabilmente microglia morfologia. Infine, all'interno di ciascun esperimento, le microglia devono essere imaged utilizzando la stessa scala, nonché il microscopio stesso. Strumentazione, obiettivi e software variano fra microscopi che comporta diverse dimensioni microfotografie nonostante gli stessi obiettivi e cambiare i dettagli così come il numero di celle all'interno di ogni fotogramma. Ad esempio, acquisizione di immagini utilizzando un obiettivo 40x su una Leica SPII genera due volte il numero di cellule e meno dettagli rispetto acquisizione utilizzando una 880 Zeiss. Ciò è particolarmente importante per i dati di cella ramificazione raccolti da tutto il telaio, piuttosto che una singola cella, questo diventa un problema di campionamento dei dati.
In generale, analisi dello scheletro che utilizza l'intero Fotomicrografo precede l'analisi frattale singola cella per due motivi. Determinazione delle cellule ramificazione di tutte le celle in una microfotografia è rapido quando rispetto all'analisi frattale di singola cellula e può essere considerato come uno strumento di screening, se il tempo è un fattore. Inoltre, le immagini binarie derivate durante l'analisi dello scheletro sono utilizzate per analisi frattale. Una volta ripreso, ci sono un numero di passaggi critici che possono influenzare i risultati dell'analisi dello scheletro e introdurre utente-influenza. La procedura di protocollo che è la maggior parte delle variabili tra utenti è passo 4.2 (crescente luminosità dell'immagine) e passo 4.5 (determinazione della soglia). Ove possibile, un numero ottimale per aumentare la luminosità (max o min cursore tra 0 e 255) è determinato e mantenuto costante per tutti gli utenti e le immagini. Dove la variabilità di immagine è grande, l'utente può invece scegliere una luminosità che varia tra le immagini. In alternativa, se le immagini sono luminose e il contrasto è elevato, quindi aumentando la luminosità può essere omesso e la soglia può essere standardizzata utilizzando un filtro di soglia di specialità (ad es., Huang) anziché il valore predefinito più variabile. Una volta ottimizzato, i parametri devono essere rispettati al fine di minimizzare ulteriore utente-influenza.
Un esempio di variabilità di utente è presentato nella Figura 5. I valori dei dati sono stati aumentati di 1 utente contro utente 2 e pertanto sarebbe aumentata variabilità se sia utente 1 e utente 2 ha contribuito alla raccolta dei dati. Un esempio delle differenze di utente 1 e utente 2 immagini binarie e scheletrate sono evidenziate dai cerchi colorati (Figura 5). In questo caso, entrambi gli utenti sono stati brevemente addestrato gli studenti universitari con limitata esperienza in microglia. Regolare supervisione e mentoring da un'esperta con protocollo aumentata formazione2 microglia può ridurre la variabilità inter-utente. Anche se non valutato qui, analisi frattale sono meno soggetto a variabilità inter-utente perché cellule binarie sono manualmente e singolarmente isolate da una microfotografia, piuttosto che fare affidamento esclusivamente sulla soglia per determinare forme di microglia. Tuttavia, tutti i metodi di possiedono alcuni variabilità tra gli utenti. Di conseguenza, un singolo utente (idealmente, allenato da qualche competenza in cellule di microglia) dovrebbe completare la raccolta dei dati per un intero set di dati.
Ulteriori modifiche possono essere fatto facilmente al presente protocollo e dipenderanno dalla qualità dell'immagine e gli sforzi compiuti per ridurre rumore e garantire la connettività di processo. Ad esempio, se il contrasto è adeguato, maschera di contrasto non è necessario e può essere omesso. È prudente ottimizzare e finalizzare il protocollo per un insieme specifico di immagini, sia sperimentali casi e controlli, prima della raccolta dei dati da un intero set. Infine, i plugin aggiuntivi possono essere utilizzati al posto di altri per chiarire o affinare le immagini che non sono stati descritti nel presente protocollo come dilatare o affilare.
Vantaggi di questo protocollo sono l'universale disponibilità e adattabilità. Inoltre, valutare la ramificazione di cella utilizzando AnalyzeSkeleton è rapida e applicabili a un intero microfotografia. Un vantaggio dell'approccio di analisi multi-cellula è il focus su un'intera regione, piuttosto che singole cellule. Di conseguenza, è possibile valutare rapidamente la ramificazione media (in termini di endpoint e lunghezza di processo) di tutte le microglia all'interno dell'immagine. Analisi dello scheletro forniscono un'analisi di più celle: un campionamento dei dati in termini di numeri di cellulare che non possono essere eguagliati da analisi frattale dovuto l'investimento di tempo necessario per isolare cellule singole da microfotografie. Un'istanza dove questo potrebbe essere più adatto sarebbe in morfologie di microglia nelle vicinanze per una lesione focale di screening. Una limitazione è il rendering di immagini di tutto il campo per creare modelli di ossatura di IHC microfotografie è imperfetto rispetto all'approccio di singola cellula richiede più tempo. Inoltre, un'analisi della regione non è adeguata alle circostanze dove microglia morfologie sono drasticamente diverse nello stesso campo. Infine, questo metodo di analisi dipende dal numero di celle, un parametro che può differire tra condizioni sperimentali.
Analisi frattale sono condotta su una singola cella e quindi integra l'output dei dati di cella media ramificazione risultanti dall'analisi dello scheletro. Anche se molto più tempo che consumano, questo investimento produce una vasta gamma di dati morfometrici. Cella, ad esempio, densità, rapporto di span, e circolarità dati descrivono la dimensione, l'allungamento e forma del contorno della cella, rispettivamente. Lacunarity e dimensione frattale riassumere la complessità delle cellule e l'eterogeneità di forma, rispettivamente. Una sintesi più approfondita di come ogni parametro viene calcolato e come i dati possono essere interpretati viene fornita nel manuale interattivo16 e tale dettaglio dovrebbe essere considerato in relazione alla domanda di ricerca specifici. I risultati del protocollo descritto negli strumenti sensibili per quantificare i piccoli cambiamenti in morfologie di microglia 2D che possono verificarsi in condizioni fisiologiche e patologiche. L'analisi morfometrica aggiuntive quali solidità, convessità e modulo fattore16,20 potrebbe essere possibile se generare forme 3D.
Adattamento e sviluppo di un protocollo è continuo e guidata dall'utente. È stato esteso da fluorescenza8 a campo chiaro/DAB immagini7 ma non ancora a tessuto incorporato di paraffina. Esso inoltre può essere utilizzato in combinazione con software proprietario come Imaris per un'ulteriore analisi. Questo protocollo può essere applicato ad una varietà di fisiologia e non è limitato alle microglia, ma può essere applicato a qualsiasi cella o tessuto con particolari modelli o forme che possono essere identificate utilizzando metodi IHC. Infine, con dimensione del campione sufficiente, un'analisi multivariata o cluster può essere applicata per stratificare microglia secondo morfologia12,21; si tratta di informazioni significative come morfologia microglia è un indicatore fondamentale delle funzioni di microglia e le risposte ai loro dintorni. L'apprezzamento per la diversità morfologica microglial è importante per comprendere appieno le interazioni neuroni-glia-vascolare durante la malattia e di salute ed in espansione. Crescita in questo campo si arricchisce di protocolli ben sviluppati, facile da usare e riproducibili per quantificare e riepilogare microglia morfologia utilizzando più variabili continue.

Microglia hanno una risposta immediata e diversificata morfologica alle alterazioni nel cervello fisiologia1 lungo un continuum di possibilità che vanno da iper-ramificazione ed estremamente complesse morfologie a-ramificate e ameboidi morfologie2 . Microglia può anche diventare polarizzate e asta-a forma di3. Ramificazione delle cellule di microglia è comunemente definito come una forma complessa, avendo più processi e viene spesso segnalato come il numero di endpoint per la cellula e la lunghezza dei processi delle cellule. Poiché le microglia sono finemente sintonizzato alla funzione di un neurone e glial attraverso cellulare continuo cross-talk e in vivo della motilità4,5, microglia morfologie possono servire da indicatori di cellule diverse funzioni e disfunzioni nel cervello. Un approccio quantitativo è necessario per descrivere adeguatamente la diversità di questi cambiamenti morfologici e per distinguere le differenze tra cellule ramificate che si verificano con sottili perturbazioni fisiologiche (ad esempio l'epilessia5,6 e commozione cerebrale7) oltre che ferita lordo (ad esempio colpo8). Un maggiore uso di morfologia quantificazione7,8,9,10,11,12,13,14 ti rivelano la diversità completa delle morfologie di microglia durante salute e nella malattia. Il presente studio dettagli l'uso graduale di ImageJ plugin necessario riepilogare microglia morfologia da fluorescente o non fluorescente microfotografie di microglia acquisita nel tessuto fisso roditore dopo esame immuno-istochimico (IHC).
Centrale per le tecniche di analisi descritte qui sono il ImageJ plugin AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, sviluppato nel 2010 per quantificare grandi strutture mammarie e FracLac16, sviluppato nel 2014 per integrare l'analisi ImageJ e frattale di quantificare la microglia singole forme. Questi plugin forniscono una rapida analisi della microglia ramificazione all'interno di intero microfotografie o più microglia di un ROI definito all'interno di una microfotografia. Questa analisi può essere utilizzata da solo o in complemento con analisi frattale. L'analisi frattale di singola cellula (FracLac) richiede un investimento di tempo, ma fornisce uscite multiple di morfologia per quanto riguarda la complessità di microglia, forma e dimensione. L'uso di entrambi gli strumenti non è ridondante, come cellula di ramificazione è complementare alla complessità delle cellule e la combinazione di diversi parametri può essere utilizzata per distinguere tra microglia diverse morfologie all'interno di DataSet12,17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">primary antibody anti-IBA1</td>
			<td style="width:173px;">Wako&#160;</td>
			<td style="width:119px;">019-19741</td>
			<td style="width:167px;">rabbit host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield soft mount</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody</td>
			<td>Jackson ImmunorResearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>donkey host</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mL glass vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>UX-08923-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12-544-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Le microglia sono fagociti di cervello che partecipano nell'omeostasi del cervello e indagine continuamente il loro ambiente per disfunzione, ferite e malattie. Come i primi soccorritori, microglia hanno importanti funzioni per attenuare la disfunzione del neurone e glia, e in questo processo, subiscono una vasta gamma di cambiamenti morfologici. Microglia morfologie possono essere classificate in modo descrittivo o, in alternativa, possono essere quantificate come variabile continua per parametri quali la ramificazione delle cellule, la complessità e la forma. Mentre metodi per quantificare la microglia sono applicati a singole cellule, alcune tecniche applicano a più microglia in un intero microfotografia. Lo scopo di questo metodo è quello di quantificare multiple e singole celle utilizzando protocolli ImageJ prontamente disponibili. Questo protocollo è un riepilogo dei passaggi e plugin di ImageJ consigliato per convertire microfotografie di fluorescenza e campo chiaro in immagini rappresentative di binarie e scheletrate e ad analizzarli utilizzando software plugin AnalyzeSkeleton (2D/3D) e FracLac per la raccolta di dati di morfologia. Le uscite di questi plugin riassumono la morfologia delle cellule in termini di processo endpoint, giunzioni e lunghezza così come complessità, forma delle cellule e descrittori di dimensione. Il protocollo di analisi scheletro descritto nel presente documento è adatto per un'analisi regionale di microglia multipli all'interno di una microfotografia intero o un'area di interesse (ROI) mentre FracLac fornisce un'analisi complementare delle singole celle. Combinato, il protocollo prevede un obiettivo, strumento di valutazione sensibile e completa che può essere usato per stratificare tra microglia diverse morfologie presenti nel cervello sano e ferito.

I protocolli di analisi di morfologia microglia descritti qui riassumono passaggi utili nell'elaborazione fluorescenti e DAB microfotografie per analisi morfometrica. Questi passaggi sono visivamente riassunti nella Figura 2 e Figura 3. L'obiettivo della procedura è quello di creare un'immagine rappresentativa di binaria e scheletrata che modella in modo appropriato la microfotografia originale tale che i dati accumulati sono validi. Dopo l'applicazione del protocollo, il plugin di AnalyzeSkeleton si traduce in un'immagine dello scheletro contrassegnata da cui il numero di endpoint e ramo (i. e., processo) lengthpuò essere riassunte dai file di output risultante. Gli endpoint e i dati di lunghezza di processo vengono quindi utilizzati per stimare il grado di ramificazione di microglia nella microfotografia o ROI. Figura 4 riepiloga i dati risultanti (endpoint/cella e processo di lunghezza/cella) raccolti con e senza l'applicazione del protocollo. Mentre le tendenze simili esistono, i dati riassunti nella Figura 4F sono meno variabile rispetto a quelli in Figura 4E. Inoltre, questi dati illustrano una maggiore sensibilità per rilevare le differenze tra i gruppi quando viene applicato il protocollo. Infine, si deve prestare attenzione relativa variabilità inter-utente nell'applicazione del protocollo. Tali differenze sono riassunti dalla Figura 5 , dove lo stesso set di dati è stato analizzato da due utenti indipendenti applicando un protocollo identico come riepilogato sopra.
Morfologia di ulteriori dati vengono raccolti da singole cellule isolate dalle immagini binarie create durante l'applicazione del protocollo. La procedura di protocollo per analizzare la morfologia di microglia prima e utilizzando il plugin di FracLac sono riassunti nella Figura 6. Abbiamo illustrare questa analisi in entrambi illeso (Figura 6A) e ferite del tessuto (Figura 6B). Immagini rappresentative di binario, profilato, convesso scafo/incapsulamento cerchio ed esempi conteggio casella per ogni cella analizzati con e senza il protocollo di applicazione sono mostrati in Figura 6–F. Queste immagini consentono di illustrare le origini delle differenze nei dati di morfologia che sono riassunti nella Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Figura 1. Illustrazioni di microglia scheletrata con un soma circolare (non ottimale) contro un soma di singola origine (Ottimo) e la corrispondente sovrapposizione tra la cella scheletrata e l'originale microfotografia. Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Figura 2. Protocollo di applicazione a fluorescente microfotografie. Illustrazioni del protocollo scheletro analisi applicata a una microfotografia fluorescente con una singola cella ritagliata per visualizzare i dettagli. Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Figura 3. Applicazione del protocollo a campo chiaro DAB microfotografie. Illustrazioni del protocollo scheletro analisi applicata a una microfotografia DAB campo chiaro con una singola cella ritagliata per visualizzare i dettagli. Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Figura 4. Analisi dei dati con e senza l'applicazione del protocollo. (A) una microfotografia di esempio di IHC fluorescente e ritagliata cella corrispondente alla casella gialla (B). Immagini di esempio binarie e scheletrate con (C) e senza (D), il protocollo applicato come descritto. Dati di riepilogo della microglia endpoint/cella e processo di lunghezza/cella in illeso (bianco) e ferito il tessuto corticale (grigio) con (E) e senza (F) il protocollo applicato. Analisi statistica utilizzando dello studente test t e n = 3, * * denota p < 0.01. Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Figura 5. Differenze di utente con applicazione protocollo. Un esempio di un'originale immagine e protocollo conversione immagini binarie e scheletro di utente 1 e utente 2. Differenze tra le due immagini sono evidenziate con i cerchi colorati di corrispondenza. Grafici di riepilogo dei dati di lunghezza/cella endpoint/cella e processo di microglia nelle regioni del cervello illeso e feriti dall'utente 1 e utente 2. Analisi statistica con ANOVA e campione dimensione è n = 3; p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001. Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Nella figura 6. Analisi frattale con e senza l'applicazione del protocollo. Esempio di ritagliata microfotografie di microglia nel illeso (A) e (B) nella corteccia ferita con binario corrispondente (C) e le immagini di contorno (D) che risultano con e senza il protocollo applicato. Il guscio convesso associato (blu) e allegando il cerchio (rosa) per forme di contorno corrispondenti (E) vengono utilizzati per calcolare la densità di forma, rapporto e circolarità (G) della portata. La casella metodo di conteggio è illustrata in (F) e usata per la dimensione frattale (DB) e lacunarity (λ) calcoli (G). Barra della scala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Le microglia sono cellule immunitarie del cervello che rilevare e reagiscono alla fisiologia cerebrale alterata attraverso cambiamenti morfologici che può essere valutata quantitativamente. Questo protocollo illustra un ImageJ basato su protocollo di analisi per rappresentare le microglia morfologia come dati in continuo secondo metriche come ramificazione delle cellule, la complessità e la forma.

Quantificare la morfologia di Microglia da microfotografie di Immunohistochemistry preparato tessuto usando ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

65.9K Views.  University of Arizona. Le microglia sono cellule immunitarie del cervello che rilevare e reagiscono alla fisiologia cerebrale alterata attraverso cambiamenti morfologici che può essere valutata quantitativamente. Questo protocollo illustra un ImageJ basato su protocollo di analisi per rappresentare le microglia morfologia come dati in continuo secondo metriche come ramificazione delle cellule, la complessità e la forma.

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Ricerca

Neuroscienze

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

L&#39;esaurimento selettiva di microglia da cerebellare granuli colture cellulari Utilizzando L-leucina estere metilico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, which include neurotransmitter clearance, ion regulation, synaptic modulation, metabolic support to neurons, and blood flow regulation. Astrocytes are complex cells that have a soma, several major branches, and numerous fine processes that contact diverse cellular elements within the neuropil. In order to assess the morphology of astrocytes, it is necessary to have a reliable and reproducible method to visualize their structure. We report a reliable&#160;protocol to perform intracellular iontophoresis of astrocytes using fluorescent Lucifer yellow (LY) dye in lightly fixed brain tissue from adult mice. This method has several features that are useful to characterize astrocyte morphology. It allows for three-dimensional reconstruction of individual astrocytes, which is useful to perform morphological analyses on different aspects of their structure. Immunohistochemistry together with LY iontophoresis can also be utilized to understand the interaction of astrocytes with different components of nervous system and to evaluate the expression of proteins within the labelled astrocytes. This protocol can be implemented in a variety of mouse models of CNS disorders to rigorously examine astrocyte morphology with light microscopy. LY iontophoresis provides an experimental approach to evaluate astrocyte structure, especially in the context of injury or disease where these cells are proposed to undergo significant morphological changes.

Astrocytes are morphologically complex cells, exemplified by their multiple processes and bushy territories. To analyze their elaborate morphology, we present a reliable protocol to perform intracellular Lucifer yellow iontophoresis in lightly fixed tissue.

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.