이 프로토콜은 신선 냉동 또는 고정 뇌 제제를 사용하여 형광 RNAscope in situ hybridization 및 immunohistochemistry를 결합합니다. 이 기술은 동일한 조직 표본에서 RNA 및 단백질 표적의 공간 시각화를 위한 고감도 in situ hybridization 및 immunohistochemistry 방법의 조합을 시연하여 유연성을 제공합니다. 이 방법은 뇌 조직 절편의 다중 표지에 적용할 수 있으며, 신경 과학에서 이종 신경 집단 내에서 mRNA 및 단백질의 공간 조직 및 기능적 중요성을 조사하는 데 도움이 됩니다.
이 프로토콜은 주로 신선 냉동 조직 및 파라포름알데히드 고정 조직의 처리 단계에 중점을 둡니다. 갓 냉동된 뇌 조직을 절편하기 시작하려면 미리 냉각된 저온 유지 장치 척에 부착하고 14마이크로미터 두께의 관상 절편을 자릅니다. 단면을 충전된 유리 현미경 슬라이드에 장착합니다.
장착된 슬라이드를 슬라이드 박스로 옮깁니다. 그런 다음 상자를 드라이아이스에 담아 섭씨 영하 80도의 냉동고로 운반합니다. 조직 고정을 위해 준비된 파라포름알데히드 용액을 여과합니다.
섭씨 4도까지 식힌다. 드라이아이스에 영하 80 섭씨 온도의 냉동고에서 거치된 활주를 가져오고 즉시 15 분 동안 미리 식힌 파라포름알데히드 해결책에서 그것을 담그고십시오, 유리제 활주가 완전하게 건조된다는 것을 보증하기 위하여 신선하 얼린 조직의 탈수를 실행하십시오. 진동 마이크로톰을 사용하여 심장 경식 고정 마운트에서 뇌를 제거한 후 30마이크로미터 두께의 조직 절편을 자릅니다.
절단된 부분을 동결 보호제 용액에 보관하십시오. FISH 분석 당일, 자유 부유 섹션을 0.1 몰 PBS가 포함된 12웰 세포 배양 플레이트로 옮기고 회전하는 플랫폼 셰이커에서 90-100RPM으로 교반하여 동결 보호제를 씻어냅니다. 그런 다음 붓을 사용하여 세척 중 분리를 방지하기 위해 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 평평하게 장착하고 최소 2시간 동안 자연 건조합니다.
소수성 배리어 펜을 사용하여 FISH 시약을 담을 섹션 주위에 소수성 배리어를 그립니다. 전처리 후 조직을 프로테아제 용액에서 배양하고 제조업체의 지침에 따라 2시간 동안 RNAscope 프로브와 하이브리드화합니다. 그런 다음 순차적 증폭 단계와 형광 면역조직화학을 수행합니다.
슬라이드를 배양하기 위해 가습된 빛 보호 챔버를 준비하는 것으로 시작하십시오. 수조에서 50X 세척 버퍼를 데우고 섭씨 40도까지 10분 동안 프로브를 가열합니다. 실온으로 냉각되면 50X 스톡 농도에서 1X 세척 버퍼 1리터를 준비합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 프로브 혼합물을 준비합니다. 단백질 분해 효소 처리를 위해 단백질 분해 효소 3을 조직 절편에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. proteinase를 씻어내기 위하여는, 단면도 떨어져 나가는 것을 피하는 실내 온도에 있는 0.1개 molar PBS에 있는 활주를 온화하게 담그십시오.
교잡의 경우 프로브 혼합물을 조직 섹션에 추가합니다. 가습된 예열된 챔버에 놓습니다. 그런 다음 섭씨 40도에서 2시간 동안 배양합니다.
세척 버퍼로 조직 부분을 2분 동안 두 번 헹굽니다. 신호 증폭을 위해 스포이드 병을 사용하여 증폭 용액을 추가하여 조직 섹션을 덮고 텍스트에 설명된 대로 배양합니다. 조직 절편에 차단 용액을 추가하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
슬라이드를 튕겨 배양 후 과도한 차단 완충액을 제거합니다. 이제 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1차 항체가 있는 절편을 배양합니다. 다음날 1X TBS로 미끄럼틀을 세 번 씻습니다.
2차 항체를 추가하고 절편을 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 카메라가 장착된 형광 현미경으로 슬라이드를 검사합니다. 대표 이미지를 20배 배율로 획득하여 TIF 파일로 저장합니다.
본 연구에서 조직 품질, 무결성 및 박테리아 오염의 부재는 DAPI 라벨링의 부재로 확인되었습니다. 유비퀴틴 C, 펩티딜프롤릴 이소머라제 B 및 RNA 중합효소 IIA mRNA를 표적으로 하는 양성 대조군 프로브의 라벨링을 통해 RNA 무결성이 확인되었습니다. NTS 내에서 GalR1 mRNA 양성 뉴런을 구별하기 위한 신선 냉동 제제에서 추가 신경화학적 마커를 사용했습니다.
막에 결합된 소포 수송체는 명확하게 표시되었습니다. 대조적으로, PHOX2B 프로모터의 제어 하에 발현된 티로신 하이드록실라아제 및 GFP와 같은 세포질 단백질은 희미하게 관찰되었으며 명확한 윤곽이 없기 때문에 응집성으로 설명되었습니다. 세포질 GalR1 mRNA의 GalR1 FISH 프로브 라벨링은 구멍이 뚫리고 명확하게 관찰되었습니다.
면역조직화학의 질이 단백질 세포 내 국소화에 의존한다는 것을 확인하기 위해, 동일한 조직 절편에서 서로 다른 핵 및 세포질 단백질을 FISH와 병렬로 표지했습니다. 세포질 PHOX2B GFP는 응집 모양을 가졌습니다. 핵 PHOX2B 단백질 신호는 명확하여 FISH와 결합했을 때 더 높은 품질의 면역 표지를 확인했습니다.
FISH와 함께 고정된 동결 절편에서 수행했을 때, 면역조직화학은 세포 내 국소화에 관계없이 신뢰할 수 있었습니다. GlyT2 mRNA 양성 뉴런은 NTS 내에서가 아니라 NTS의 복부에 위치했습니다. GlyT2 mRNA 양성 및 PHOX2B mRNA 양성 뉴런은 공동 국소화되지 않았습니다.
PHOX2B mRNA 양성 NTS 뉴런의 하위 집단은 티로신 하이드록실라제 면역 반응성이었으며, GlyT2 mRNA를 포함하지 않았습니다. RNAscope를 사용하면 세포와 조직의 단일 분자 분해능으로 RNA 분포를 시각화하고 분석할 수 있습니다. 새로운 RNA 종, 질병 메커니즘, 유전자 발현 패턴, 뉴런 다양성 및 세포 상호 작용에 대한 연구를 지원합니다.
