Name: suppression of pro-fibrotic signaling potentiates factor-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts into induced cardiomyocytes
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes at JoVE.com

이 연구는 Boettcher 재단의 웹 주의 생물 의학 연구 프로그램, 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (13SDG17400031), 콜로라도의 대학 학과 의학 뛰어난 초기 경력에서에서 기금에 의해 지원 되었다 학자 프로그램, 콜로라도 사단의 심장 Barlow Nyle 기부금의 대학 및 NIH R01HL133230 (캔사스)에. A.S.R 섬유 증 연구 및 번역 (CFReT)에 대 한 NIH/NCATS 콜로라도 CTSA 보조금 번호 TL1TR001081와 콜로라도 대학 컨소시엄에서 미리 박사 친목에 의해 지원 되었다. 이 연구는 암 센터 지원 그랜트 (P30CA046934), 피부 질환 연구 코어 그랜트 (P30AR057212), 그리고 콜로라도의 대학 Anschutz 의료 캠퍼스에서 Flow Cytometry 코어에 의해 또한 지원 되었다.

동물을 요구 하는 모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 UC 덴버 Anschutz 의료 캠퍼스에 의해 승인 되었다.
1입니다. MEFs의 격리
<ol><li>E13에서 임신 마우스 C57BL/6를 구입. 밤새 배.</li>
	<li>승인 된 IACUC 프로토콜에 따라 어머니를 안락사 (예: ~1.3 L/분 CO2 동물 죽은 나타날 때까지 다음 자 궁 경관 탈 구)</li>
	<li>70% 에탄올으로 어머니를 살포 하 고 복 부 구멍을 엽니다. 포함 된 배아 자 궁 경적을 제거 하 고 살 균 PBS로 10 cm 접시에.</li>
	<li>출시 배아 배아 삭에서 절 개를 확인 합니다. 10 cm 살 균 PBS 가진 접시를 청소 하는 배아를 전송 합니다. 철저 하 게 린스.</li>
	<li>간 아래 시체를 잘라내어 머리와 상체를 삭제. 내부 장기를 제거 하 고 삭제. 나머지 조직 살 균 PBS 가진 깨끗 한 10 cm 접시에 전송 하 고 Biosafety 수준 1 또는 2 캐비닛에 접시를 전송. 깨끗 하 고 마른 10 cm 접시에 모든 배아에서 조직을 결합 하 고 정밀한 조각으로 말하다.</li>
	<li>다진된 배아를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 6 mL를 추가 합니다. 조직 헤어 피 펫에 의해 여러 번 triturate. 40 분 5% CO2와 37 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>성장 매체 (표 1)에 셀 resuspend 미디어의 볼륨은 수확 하는 배아의 수에 따라 조정 됩니다. 일반적으로, 약 1.2 배아 당 25 mL 성장 매체의 비율을 사용 합니다.</li>
	<li>플레이트 25 mL 15 cm 접시에 resuspended 셀의. 24 시간 후 미디어를 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 성장 매체의 25 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>72 h, 후 각 15 cm 접시를 0.25 %trypsin / 1 mM EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 셀 문화 접시에서 분리 때 trypsin 15 mL 성장 매체를 비활성화 하 고 50 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 세포를 수집 합니다. 실 온에서 160 x g 에서 3 분에 대 한 셀 원심 70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 성장 매체 및 필터 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 동결 매체에서 2 백만 셀 aliquots에 MEFs를 동결 (10 %DMSO, 25 %FBS Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) / 높은 포도 당)-80 ° c.에 사용할 준비가 될 때까지 24 시간 및 저장소 후 액체 질소에 셀 전송. 참고: MEFs의 글로벌 유전자 발현은 프로 파일링 RNA 시퀀싱으로이 프로토콜을 사용 하 여 절연 (RNA-seq) 셀 인증 되도록. 인코딩 MEF 세포에서 RNA-seq 데이터 취득 번호 GSE93454에서 NIH 유전자 식 옴니 버스 (지 오)을 다운로드 했다. 우리가 사용 하는 MEFs에 대 한 RNA-seq 유전자 표현 데이터 취득 번호 GSE71405와 NIH GEO에 예금 되었다. 이러한 두 데이터 세트는 일반적인 유전자 기호에 따라 병합 했다. 식 데이터 다음 로그-변형 되었다 그리고 우리의 MEFs 및 인코딩 MEFs 식 데이터 scatterplot 생성 되었고 선형 회귀선 (그림 1A)와 맞는. MEFs이이 프로토콜을 사용 하 여 절연 분자로 다른 실험실에 의해 고립 된 그 유사 하다.</li>
</ol>2. 레트로 바이러스와 MEFs의 변환의 생산
참고:이 섹션의 모든 단계 됩니다 실행 한다 Biosafety 수준 2 캐비닛에. 때문에이 프로토콜 활용 retroviral 변환, 그 안전 주의 모든 바이러스 성 미디어 프로그래밍에 대 한 타임 라인에 대 한 적어도 20 분 그림 1B 를 참조에 대 한 10% 표 백제와 함께 포함 된 낭비 치료 등을 확인 합니다.
<ol><li>
백 금 전자 (PE) 셀 라인을 사용 하 여 레트로 바이러스의 생산
	<ol>
<li>상업적으로 이용 가능한 PE 셀 PE 매체 (표 1) 포함 blasticidin 그리고 puromycin 선택 마커 개 그-의 표현 되도록 유지 효율적인 retroviral 입자 생산36유류 그리고 env 유전자 . 1:4 또는 1:5 매 2 일에서 통행 세포. 이 retroviral 생산 수율 저하로 세포의과 밀을 방지 하기 위해 주의.</li>
		<li>-1 일에 씨앗 10 cm 접시에 성장 매체 (표 1) 16-20 h 당 약 5 x 106 세포 transfection 전에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금 표 2 참조). 부드럽게 바위 요리 앞뒤로 여러 번와 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터도 도금 배포 되도록 신중 하 게 자리 (transfection 전에 최적의 도금 밀도 그림 1C 참조). 참고: 플레이트 PE 셀 선택 마커 생성된 retroviral 입자를 포함 하는 매체 MEFs 죽 일 하지 않습니다 있도록 transfection 이전 무료 매체 주의.</li>
		<li>당일 0, transfection에 대 한 DNA를 준비 합니다. 10 cm 접시 transfection 추가 재활 각 요소의 2 µ g-GATA4, Hand2, Tbx5, Mef2c 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m)-1.5 mL 튜브에. 참고: 다른 표준 셀 문화 접시 크기 transfect 하는 데 필요한 DNA의 양을를 표 2 를 참조 하십시오.</li>
		<li>별도 1.5 mL 튜브에 360 µ L 감소 된 혈 청 미디어를 추가 합니다. 36 µ L transfection 시 감소 된 혈 청 미디어를 직접 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: 감소 transfection 효율을 피하기 위해, 감소 된 혈 청 미디어에 직접 신중 하 게 transfection 시 약 추가.</li>
		<li>GHMT2m DNA 칵테일에 감소 된 혈 청 미디어/transfection 시 혼합물을 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 터치 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>PE 셀에 dropwise 반응 혼합물을 추가, 부드럽게 미디어에 대 한 10-15, 소용돌이 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에. 참고: 제조 업체에 따라 PE 세포 생성 10의 평균 titer6 107 감염 단위/mL. 이 프로토콜 약 2 x 106 감염 단위/mL 24 h 6 x 106 감염 단위/mL 평균 4의 나에 대 한 48 h에 의해 생성 됩니다. 있으 나 transfection GFP/DsRed의 경우; transfection/변환 효율에 대 한 대리로도 사용할 수 있습니다. transfection 효율 48 h (그림 1C) 90%를 초과할 전망 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MEFs의 변환
	<ol>
<li>0 일에 콜라겐과 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터 2 h 이상에서 요리 코트.</li>
		<li>액체 질소 및 해 동에서 MEFs를 제거 합니다. 플레이트 0.2 x 106 세포 성장 매체에 60 m m 접시 당. 부드럽게 되도록 락 접시 도금 유통도 하 고 인큐베이터에 (다른 표준 셀 문화 접시 크기에 대 한 밀도 도금에 대 한 최적의 도금 밀도 및 표 2 에 대 한 그림 1C 참조). 참고: 이러한 도금 밀도 격리 된 MEFs;의 여러 일괄 처리를 통해 테스트 되었습니다. MEFs 디스플레이 크게 생존을 손상 하지 않는 셀 시드 밀도 조정 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>당일 1, 24 h 후 transfection 30 mL 주사기를 사용 하 여 PE 세포에 의해 생성 된 retroviral 매체를 수집. 50 mL 원뿔 관으로 0.45 μ m 기 공 크기 필터를 통해 매체를 전달 합니다. 6 µ g/mL의 최종 농도를 hexadimethrine 브 로마 이드 transfection 시 약을 추가 합니다. 신중 하 게 세포의 변위를 방지 하기 위해 문화 접시의 벽에 pipetting 미디어 여 PE 셀에 10 mL 신선한 성장 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>MEFs에서 매체를 발음 하 고 각 접시에 갓 수확된 retroviral 매체의 4 mL를 추가 합니다. 인큐베이터에 MEFs를 반환 합니다. 무력화 retroviral 입자 바이러스 매체 접촉 모든 재료를 10% 표 백제를 추가 합니다.</li>
		<li>하루 2, 48 h 후 transfection, 2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 합니다. PE 셀 retroviral 매체의 2nd 컬렉션 다음 삭제 됩니다. 참고: 20 분 이상 원치 않는 레트로 바이러스를 무력화 폐기 PE 셀에 10% 표 백제를 추가 합니다.</li>
		<li>3 일에 MEFs에서 매체를 발음 하 고 보충 4 mL iCM 매체 (표 1) 0.5 µ M를 포함 하는 TGF-β, A-83-01 유형 I 수용 체 억제제. 2 일 마다 A-83-01을 포함 하는 iCM 매체를 보충. 참고: 변환 제어로 GFP를 사용 하는 경우 식 예정입니다 90% 초과이 시간 포인트 (그림 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 심장 마커 Cytometry
<ol><li>하루 9에서 aspirate 매체 죽은 세포와 파편 제거를 1 x PBS를 가진 MEFs와 세척 (1x) 재설정.</li>
	<li>37 ˚C에서 5 분 동안 0.25 %Trypsin / EDTA 1 mL를 추가 합니다. 가벼운 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 하 고 흔들어 접시; 셀 연결 된 남아 있으면 세포 분리 될 때까지 5 더 분 37 ˚C에서 품 어.</li>
	<li>70 µ m 기 공 셀 스 트레이너를 통해 5 %FBS 필터를 포함 하는 1 x PBS에 세포를 씻어.</li>
	<li>실내 온도 펠 릿에서 aspirate 액체에 3 분 동안 160 x g 에서 원심. 참고: 셀 수확량 증가, 약 50 µ L 액체를 셀 펠 릿 위에 둡니다.</li>
	<li>1 %BSA 포함 하는 500 µ L 1 x PBS를 가진 세포를 씻어.</li>
	<li>얼음에 0.2 mL/1 백만 셀과 셀 20 분 고정 솔루션을 수정.</li>
	<li>1 x 얼음 파 마/워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 제조업체의 해결책은 10 배 이다.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 160 x g 에서 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
	<li>추가 시간 3.7-3.8 단계를 반복 합니다. 2차 세척 후 다음 단계를 직접 진행 또는 하룻밤 4 ° C에서 세포를 유지.</li>
	<li>5% 염소 혈 청 및 실 온에서 30 분 동안 파 마/워시 버퍼 x 1 혈 청 당나귀의 100 µ L를 차단 합니다.</li>
	<li>희석된 주 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 마우스 분 T (1: 200) 그리고의 비율 척도를 α-actinin (1: 200) 마우스 세포 심장 sarcomere의 주요 구성 요소에 대 한 긍정적인. 실 온에서 1 h에 대 한 1 차적인 항 체를 품 어.</li>
	<li>160 x g 4 ° C에서 5 m에서 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.</li>
	<li>희석된 이차 항 체의 100 µ L를 추가 합니다. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀 안티 마우스 647 nm 이차 항 체 (1: 200)으로 표시 했다. 이차 항 체는 이상 끝 튜브 회전자에 실 온에서 45 분을 품 어. 호 일에 튜브를 배치 하 여 빛 으로부터 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>160 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 차가운 파 마/워시 버퍼 2 배를 씻어.</li>
	<li>PBS에서 1 %BSA 1 mL을 추가 하 고 즉시 FACS를 수행. 참고: 앞으로 대 쪽 분산형 점도 FACS를 수행할 때 가능한 세포를 먼저 게이트를 생성 합니다. 또는 셀을 수정 하기 전에 상용 라이브/죽은 세포 얼룩을 사용 하 여 라이브 식별 하 고 죽은 세포 인구를.</li>
</ol>4입니다. 재설정된 MEFs Immunostaining
<ol><li>주 14에서에서 aspirate 매체 MEFs와 세척 (1x) 얼음 처럼 차가운 PBS x 1 mL 1 재설정. 참고: immunostaining에 대 한 프로그래밍 수행 되었다 항 체 솔루션 볼륨을 최소화 하기 위해 12 잘 판에. 24 잘 접시도 사용할 수 있습니다; 단순히 반 모든 볼륨을 다음.</li>
	<li>발음 및 실 온에서 10 분 동안 500 µ L 2 %paraformaldehyde 셀을 수정.</li>
	<li>발음 하 고 3 번 1 mL 1 x PBS (5 분 실 온에서 세척 당)를 가진 셀을 씻어.</li>
	<li>500 µ L 0.2 %permeabilization 시 약 PBS에 실 온에서 15 분 동안 셀 permeabilize</li>
	<li>발음 하 고 500 µ L 10% 말 혈 청 PBS에 실 온에서 30 분 동안에 차단 합니다.</li>
	<li>발음 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 희석된 주 항 체의 500 µ L로 품 어. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀 마우스 분 T 또는 α-actinin (각 1:400) 되었고 공동으로 표시 Connexin 43 (1:400) 또는 분 나 (1:400).</li>
	<li>1 차적인 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어.</li>
	<li>발음 하 고 실 온에서 1 시간 동안 500 µ L 희석된 이차 항 체와 함께 품 어. 참고:이 프로토콜에 대 한 셀은 표시 반대로 마우스 555 nm 이차 항 체 (1:800) 분 T α-actinin를 인식 하 고 반대로 토끼 488 nm 이차 항 체 (1:800) Connexin 43 나 Troponin I. 인식 하, 핵 물 했다 Hoechst (1:10, 000)입니다. 빛에서 어둠 속에서 배양 하 여 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>이차 항 체를 발음 하 고 1 mL 1 x PBS (실 온에서 세척 당 5 분)와 세 번 씻어. 빛 으로부터 세포를 보호 하 고 4 ° c.에 저장을 호 일에 접시 포장</li>
	<li>이미지는 3 채널 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여입니다.</li>
</ol>5. 칼슘 이미징
참고: 경우 10 배 확대에서 이미징, 표준 셀 문화 요리와 접시는 칼슘 이미징에 적합. 높은 확대에 이미징 셀 유리 coverslips 또는 유리 하단 접시에 도금 될 필요 합니다.
<ol><li>중간 발음 및 2 mL (6 잘 플레이트)에 대 한 수정 Tyrode의 솔루션 (140 m m NaCl, KCl, 1.8 m m CaCl2, 5mm 1 m m MgCl2, 포도 당 10 mM, 10 mM HEPES, 0.1 %BSA, 및 1 %pyruvate, pH 7.4) 추가 Fura-2 오전 5 µ M를 포함 하 고 0.1% Pluronic F-127 (D14 t를 구타 하 o d 20) iCMs입니다. 37 ° c.에 30 분 동안 품 어 참고: 형광 표시기의 냉각을 방지 하기 위해 빛 으로부터 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>Fura-2의 디 에스테 르 화 수 있도록 실 온에서 30 분 동안 2 mL Tyrode의 솔루션에 세포를 씻어 오전.</li>
	<li>이미지 회전 디스크 confocal 현미경 검사 법 340 nm 및 380 nm Slidebook 5.5 캘리포니아2 + 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 실 온에서 이미지를 수행 합니다.</li>
	<li>칼슘 과도 340 형광 강도의 비율을 사용 하 여 계산는 380에서 형광 강도에 nm nm.</li>
	<li>원하는 경우, 1 또는 2 µ M isoproterenol 또는 10 µ M iCMs 치료 Nifedipine 칼슘 기준선 칼슘 과도 영상 후 처리를 조작 하. 셀 및 이미지에 화합물을 로컬로 추가 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li><li>Karantalis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+mesenchymal+stem+cells+produce+concordant+improvements+in+regional+function,+tissue+perfusion,+and+fibrotic+burden+when+administered+to+patients+undergoing+coronary+artery+bypass+grafting:+The+Prospective+Randomized+Study+of+Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+in+Patients+Undergoing+Cardiac+Surgery+(PROMETHEUS)+trial.">Autologous mesenchymal stem cells produce concordant improvements in regional function, tissue perfusion, and fibrotic burden when administered to patients undergoing coronary artery bypass grafting: The Prospective Randomized Study of Mesenchymal Stem Cell Therapy in Patients Undergoing Cardiac Surgery (PROMETHEUS) trial.</a> Circ Res. 114 (8), 1302-1310 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone,+Heart,+and+Other+Mesoderm+Cell+Types.">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. 166 (2), 451-467 (2016).</li><li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+A+source+of+cardiac+regeneration.">iPS cells: A source of cardiac regeneration.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538, 388-391 (2016).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 357-386 (2010).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+with+the+MyoD+transactivation+domain.">Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 105-113 (2013).</li><li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro.">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li><li>Addis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+direct+fibroblast+reprogramming+to+cardiomyocytes+using+calcium+activity+as+a+functional+measure+of+success.">Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).</li><li>Ifkovitz, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+TGF&#946;+signaling+increases+direct+conversion+of+fibroblasts+to+induced+cardiomyocytes.">Inhibition of TGF&#946; signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes.</a> PLoS One. 9 (2), e89678 (2014).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming.">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li><li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+MYOCD,+SRF,+Mesp1+and+SMARCD3+enhance+the+cardio-inducing+effect+of+GATA4,+TBX5,+and+MEF2C+during+direct+cellular+reprogramming.">Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming.</a> PLoS One. 8 (5), e63577 (2013).</li><li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+induced+cardiac+reprogramming+in+vivo:+evidence+for+mature+cardiac+myocytes+and+improved+cardiac+function.">MicroRNA induced cardiac reprogramming in vivo: evidence for mature cardiac myocytes and improved cardiac function.</a> Circ Res. 116 (3), 418-424 (2015).</li><li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes.">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110 (11), 1465-1473 (2012).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), 1216-1220 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling.">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nature Communications. 6, 1-15 (2015).</li><li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plat-E:+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses.">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene Therapy. 7, 1063-1066 (2000).</li><li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt1/protein+kinase+B+enhances+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes.">Akt1/protein kinase B enhances reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN281+enhances+cardiac+reprogramming+by+modulating+cardiac+and+inflammatory+gene+expression.">ZFN281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression.</a> Genes &amp; Dev. 31, 1770-1783 (2017).</li><li>Mohamed, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Enhancement+of+In+Vitro+and+In+Vivo+Direct+Cardiac+Reprogramming.">Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming.</a> Circulation. 135, 978-995 (2017).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li><li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+reprogramming+to+transdifferentiate+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+adenoviral+vectors:+Implications+for+clinical+myocardial+regeneration.">In situ reprogramming to transdifferentiate fibroblasts into cardiomyocytes using adenoviral vectors: Implications for clinical myocardial regeneration.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. , 329-339 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구 직접 프로 거리 신호 통로의 억제와 함께 요소를 프로그래밍 하는 GHMT2m의 배달을 통해 기능 iCMs에 섬유 아 세포를 재 설 정할 고효율 전략을 설명 합니다. Cytometry, immunofluorescent 이미징, 이미징, 및 셀 카운트, 우리는이 프로토콜에 대부분 셀의 표시 치고 칼슘을 사용 하 성공적인 프로그래밍 받 다 고 CM 혈통 운명 채택. 우리는 반대로 거리의 추가 화합물 TGF-β 유형 포함 나 수용 체 억제?...

허 혈 성 심장 질환은 미국1에서 죽음의 주요 원인. 약 800000 미국인 경험을 첫 번째 또는 재발 성 심근 경색 (MI) 당 년1. 미, 다음 cardiomyocytes (CMs) 및 심장 섬유 증, 활성화 된 심장 섬유 아 세포에서의 죽음 심장 기능2,3손상. 미 다음 심장 마비의 진행 성인 CMs4,5의 가난한 재생 용량 때문 돌이킬 아니다. 현재 임상 치료 질병의 진행을 느리게 하 고 미래의 심장 이벤트6,7,,89의 위험을 감소, 아무 치료 반대로 질병의 진행 하는 무 능력 때문 CMs 후 경색10를 다시 생성 합니다. 새로운 세포 치료 치료 환자 닉 실망 하 떠오르고 있다, 지금까지 미 다음 마음에 줄기 세포를 제공 하는 임상 시험 결정적이 아닌 재생 잠재적인11,12, 나타났습니다. 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
먼저 다카하시 & 야 마나카, 시연 4 녹음 방송 요인의 overexpression에 의해 섬유 아 세포에서 파생 하는 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 생성 세포 치료19에 새로운 돌파구를 문을 열었습니다. 이 세포는 모든 3 개의 세균 층19로 분화 할 수 있다 그리고 CMs의 많은 수를 생성 하기 위한 몇 가지 매우 효율적인 방법을 이전 표시 되었습니다20,21. HiPSC 파생 된 CMs (엉덩이-CMs) cardiomyogenesis를 공부 하는 강력한 플랫폼을 제공 하 고 상해를 따르는 마음을 고치기를 위한 중요 한 의미를 가질 수 있습니다. 그러나, 현재 기형종 형성22의 문제로 인해 변환 장애물을 직면 하는 엉덩이 CMs 그리고 그들의 미 성숙한 성격 프로 arrhythmogenic23을 수 있습니다. HiPSCs로 섬유 아 세포를 프로그래밍 직접 다른 세포 유형으로 섬유 아 세포를 프로그래밍에 관심을 촉발 시켰다. 것 외. 시연 심장 혈통, 직접 프로그래밍에 섬유 아 세포 결과에 GATA4, Mef2c, 및 Tbx5 (그리니치 표준시)의 그 overexpression 이기는 하지만 낮은 효율24. 프로그래밍 효율 Hand2 (GHMT)25의 추가 함께 개선 되었습니다. 이러한 초기 연구 이후 많은 출판물을26,27,,2829, 요인 추가 전사와 재활 요소 칵테일 변경 증명 하고있다 chromatin 한정자30,31, microRNAs32,33또는34 향상을 리드 하는 작은 분자 프로그래밍 효율 및 성숙 유도 cardiomyocyte 같은 셀 (iCMs ).
여기 우리는 높은 효율 iCMs 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에서 생성 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 우리 이전 보여주었다 GHMT 칵테일 1 미르와 미르-133 (GHMT2m)의 추가 함께 크게 개선 하 고 더욱 향상 프로-거리 경로 변형 성장 인자 (TGF-β) β 신호를 포함 하 여 신호 또는 관련 단백질 키 니 아 제 (바위) 신호 통로 저해35. 이 프로토콜을 사용 하 여, 우리 보여 심장 분 T (cTnT)를 표현 하는 세포의 약 60%, 약 50% α-actinin, 표현 및 높은 구타 셀 수 빠르면 하루 11 프로그래밍 요소와 치료의 변환에 따라 관찰 될 수 있다 TGF-β와 내가 입력 수용 체 억제제 A-83-01. 또한, 이러한 iCMs 갭 정션 단백질 connexin 43 등을 표현 하 고 자연 스러운 수축 및 칼슘 과도. 이전 연구에 비해 효율을 프로그래밍 향상을 표시이 심장 후 경색에 남아 있는 생 세포 인구에서 CMs를 재생성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>Charles River&#039;s Laboratory</td><td>027</td><td>For MEF isolation</td></tr><tr><td>Platinum E (PE) Cells</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>For retrovirus production</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022.FS</td><td>Component of iCM, PE, and Growth media</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>Component of iCM, PE, and Growth media</td></tr><tr><td>Donor Horse Serum</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>MEM Essential Amino Acids, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate Solution, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>Component of iCM media and for calcium imaging</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>MEM Vitamin Solution, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Component of iCM media</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Component of iCM, PE, and Growth media</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-Glutamine Supplement)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Component of iCM, PE, and Growth media</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Component of PE media</td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Component of PE media</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>For detaching cells from culture dishes</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R&amp;amp;D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Treat cells to inhibit TGF-&amp;beta; signaling - promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>For coating dishes to plate MEFs</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Plasmid containing reprogramming factor</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>For viral induction. Use at a concentration of 6 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Vacuum Filter + bottles (0.22 &amp;micro;m pores)</td><td>Nalgene</td><td>&amp;nbsp;569-0020&amp;nbsp;</td><td>For filtering media</td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Bd Vacutainer Labware&amp;nbsp;</td><td>309654</td><td>For viral filtration</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m Filters</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>For viral filtration</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainers</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>For MEF isolation and Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Solution</td><td>BD</td><td>554722</td><td>For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>perm/wash buffer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>For washing cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>For washing cells</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>For flow cytometry and calcium imaging</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G9023</td><td>For blocking cells for Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>For blocking cells for Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Mouse Troponin T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Mouse &amp;alpha;-actinin</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry</td></tr><tr><td>Rabbit Connexin 43</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Rabbit Troponin I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, mouse</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>1:200 Flow Cytometry</td></tr><tr><td>27-color ZE5 Flow Cytometer&amp;nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>For FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>For fixing cells for IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>For permeabilization of cells for IF</td></tr><tr><td>EVOS&amp;trade; FL Color Imaging System</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>For IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>glucose</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>For disruption calcium transients in iCMs - use at 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>For increasing number of calcium transients in iCMs - use at 1-2 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk Confocal microscope</td><td>3i</td><td></td><td>For calcium imaging</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dishes</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6 well cell culture plates</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12 well cell culture plates</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24 well cell culture plates</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

suppression of pro-fibrotic signaling potentiates factor-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts into induced cardiomyocytes

다른 하나의 체세포 형식의 트랜스-차별화 모델링 하 고 인간의 질병 치료 엄청난 잠재력이 있다. 이전 연구 결과 나타났습니다 그 마우스 배아, 피부, 및 심장 섬유 아 세포 기능 유도 cardiomyocyte 같은 세포 (iCMs)로 재설정 될 수 있습니다 cardiogenic 녹음 방송 요인 Mef2c, GATA4, Hand2 등의 overexpression 통해 고 Tbx5 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 그러나, 이러한 이전 연구는 상대적으로 낮은 효율을 나타났습니다. 부상 다음 심장 기능을 복원 하기 위해 심장 프로그래밍 제어 메커니즘 효율과 성숙 iCMs의 향상을 해명 한다.
우리는 이전 프로 거리 신호를 크게 저해 재활 효율을 증가 입증. 여기, 우리는 최대 60%의 재활 효율을 달성 하는 방법 선발. 또한, cytometry, immunofluorescent 이미징 및 칼슘 이미징 재활 효율과 재설정된 섬유 아 세포의 성숙 척도를 포함 하는 여러 가지 방법을 설명 합니다. 여기 상세한 프로토콜을 사용 하 여, 기계 연구 수 이루어져야 심장 프로그래밍의 긍정적이 고 부정적인 레 귤 레이 터를 결정. 이러한 연구는 재활 효율성과 성숙, 인간의 심장 질환 치료 소설 세포 치료로 이어질 수 있는 홍보 하는 대상으로 수 신호 경로 식별할 수 있습니다.

그림 1B에서 위에 설명 된 재활 전략을 사용 하 여, 약 심장 분 T를 표현 하는 세포의 70%와 심장 α-actinin, cytometry 하루 9에 의해 계량을 표현 하는 세포의 약 55 %iCMs 생성 GHMT2m의 변환에 따라 (그림 2A , B). 또한, 대부분의 세포 표현 심장 분 T, 분, 그리고 심장 α-actinin으로 갭 정션 마커 Connexin 43 하루 14 다음 변환 (<strong c...

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Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

프로 거리 신호 억제 유도 Cardiomyocytes에 마우스 미 발달 섬유 아 세포의 프로그래밍 요소 중재 Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K 조회수.  University of Colorado Anschutz Medical Campus. 여기 선물이 overexpression Mef2c, GATA4, Hand2, Tbx5, 미르-1, 그리고 미르-133 (GHMT2m) TGF-β 신호 전달의 억제와 함께 통해 기능 cardiomyocytes에 기본 미 발달 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 강력한 방법. 우리의 프로토콜 생성 박동 cardiomyocytes 일찍 최대 60 %7 일 후 변환 효율.

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Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative strategies for treatment of heart disease. This conversion has been achieved by forced expression of defined factors such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T). Traditionally, iCMs are generated by a cocktail of viruses expressing these individual factors. However, reprogramming efficiency is relatively low and most of the in vitro G,M,T-transduced fibroblasts do not become fully reprogrammed, making it difficult to study the reprogramming mechanisms. We recently have shown that the stoichiometry of G,M,T is crucial for efficient iCM reprogramming. An optimal stoichiometry of G,M,T with relative high level of M and low levels of G and T achieved by using our polycistronic MGT vector (hereafter referred to as MGT) significantly increased reprogramming efficiency and improved iCM quality in vitro. Here we provide a detailed description of the methodology used to generate iCMs with MGT construct from cardiac fibroblasts. Isolation of cardiac fibroblasts, generation of virus for reprogramming and evaluation of the reprogramming process are also included to provide a platform for efficient and reproducible generation of iCMs.

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

연구

발생학

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for differentiating hiPSCs into cardiomyocytes (hiPSC-CMs), endothelial cells (hiPSC-ECs), and smooth muscle cells (SMCs) are often limited by low yield, purity, and/or poor phenotypic stability. Here, we present novel protocols for generating hiPSC-CMs, -ECs, and -SMCs that are substantially more efficient than conventional methods, as well as a method for combining cell injection with a cytokine-containing patch created over the site of administration. The patch improves both the retention of the injected cells, by sealing the needle track to prevent the cells from being squeezed out of the myocardium, and cell survival, by releasing insulin-like growth factor (IGF) over an extended period. In a swine model of myocardial ischemia-reperfusion injury, the rate of engraftment was more than two-fold greater when the cells were administered with the cytokine-containing patch comparing to the cells without patch, and treatment with both the cells and the patch, but not with the cells alone, was associated with significant improvements in cardiac function and infarct size.

We present three novel and more efficient protocols for differentiating human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells and a delivery method that improves the engraftment of transplanted cells by combining cell injection with patch-mediated cytokine delivery.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. Y-27632 is a highly potent inhibitor of Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (RhoA/ROCK) and is used to prevent dissociation-induced cell apoptosis (anoikis). We demonstrate that Y-27632 pretreatment for human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs+RI) prior to implantation results in a cell engraftment rate improvement in a mouse model of acute myocardial infarction (MI). Here, we describe a complete procedure of hiPSC-CMs differentiation, purification, and cell pretreatment with Y-27632, as well as the resulting cell contraction, calcium transient measurements, and transplantation into mouse MI models. The proposed method provides a simple, safe, effective, and low-cost method which significantly increases the cell engraftment rate. This method cannot only be used in conjunction with other methods to further enhance the cell transplantation efficiency but also provides a favorable basis for the study of the mechanisms of other cardiac diseases.

In this protocol, we demonstrate and elaborate on how to use human induced pluripotent stem cells for cardiomyocyte differentiation and purification, and further, on how to improve its transplantation efficiency with Rho-associated protein kinase inhibitor pretreatment in a mouse myocardial infarction model.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

생화학

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell fate determining and maturing factors. We previously set out to define the minimal set of factors necessary for instructing red blood cell development using direct lineage reprogramming of fibroblasts into induced erythroid progenitors/precursors (iEPs). We showed that overexpression of Gata1, Tal1, Lmo2, and c-Myc (GTLM) can rapidly convert murine and human fibroblasts directly to iEPs that resemble bona fide erythroid cells in terms of morphology, phenotype, and gene expression. We intend that iEPs will provide an invaluable tool to study erythropoiesis and cell fate regulation. Here we describe the stepwise process of converting murine tail tip fibroblasts into iEPs via transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR). In this example, we perform the reprogramming in fibroblasts from erythroid lineage-tracing mice that express the yellow fluorescent protein (YFP) under the control of the erythropoietin receptor gene (EpoR) promoter, enabling visualization of erythroid cell fate induction upon reprogramming. Following this protocol, fibroblasts can be reprogrammed into iEPs within five to eight days. 
While improvements can still be made to the process, we show that GTLM-mediated reprogramming is a rapid and direct process, yielding cells with properties of bona fide erythroid progenitor and precursor cells.

Here we present our protocol for producing induced erythroid progenitors (iEPs) from mouse adult fibroblasts using transcription factor-driven direct lineage reprogramming (DLR).

리니지 Reprogramming 성인 마우스 구와 Erythroid 창시자에의 직접

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Assessing Cardiac Reprogramming using High Content Imaging Analysis

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a reprogramming technique. Cardiac reprogramming provides a strategy to generate new cardiomyocytes. By introducing core cardiogenic transcription factors into fibroblasts; fibroblasts can be converted to iCMs without transition through the pluripotent stem cell state. However, the conversion rate of fibroblasts to iCMs still remains low. Accordingly, there have been numerous additional approaches to enhance cardiac reprogramming efficiency. Most of these studies assessed cardiac reprogramming efficiency using flow cytometry, while at the same time performed immunocytochemistry to visualize iCMs. Thus, at least two separate sets of reprogramming experiments are required to demonstrate the success of iCM reprogramming. In contrast, automated high content imaging analysis will provide both quantification and qualification of iCM reprogramming with a relatively small number of cells. With this method, it is possible to directly assess the quantity and quality of iCMs with a single reprogramming experiment. This approach will be able to facilitate future cardiac reprogramming studies that require large-scale reprogramming experiments such as screening genetic or pharmacological factors for enhancing reprogramming efficiency. In addition, the application of high content imaging analysis protocol is not limited to cardiac reprogramming. It can be applied to reprogramming of other cell lineages as well as any immunostaining experiments which need both quantification and visualization of immunostained cells.

We present a protocol to quantify directly reprogrammed induced cardiomyocyte-like cells (iCMs) in vitro using high content imaging analysis. This method allows us to quantify the efficiency of cardiac reprogramming in an automated manner and to directly visualize iCMs.

The goal of this protocol is to describe a method for quantifying induced cardiomyocyte-like cells (iCMs), which are directly reprogrammed in vitro by a ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

생물학

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

생체공학

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

GCaMP3 리포터와 심장 특정 칼슘 플럭스를 측정하여 심장 재프로그래밍의 체외 평가

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...