We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

여기에 설명 된 프로토콜은 신생아 마우스를 사용합니다. 동물 관리 및 실험은 노스 캐롤라이나 대학 부문 실험 동물 의학 (DLAM), 채플 힐에 의해 설립 된 지침에 따라 수행된다. 버퍼 및 미디어 1. 준비 <ol><li> 섬유 아세포 (FB) 매체를 준비 : 100 ㎖ 태아 소 혈청 (FBS), 6 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 500 ml의에게 IMDM 미디어를 보충합니다. </li><li> 100㎖의 M199 배지 및 50ml의 FBS와 400 mL의 DMEM 배지를 보충 : ICM 매체를 준비한다. </li><li> B27 매체를 준비 : 10 ML의 B27 매체와 490 ml의 RPMI 1640 미디어를 보충합니다. </li><li> 플랫-E 배양 배지를 준비 : 50 ㎖의 FBS, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다. </li><li> 플랫-E 형질 전환 매체를 준비 : 50 ㎖의 FBS 및 5 ml의 비 필수 아미노산과 500 ml의 DMEM 미디어를 보충합니다. </li><li> 홍보epare 젤라틴 24 웰 플레이트를 코팅 : 24 웰 플레이트의 잘 0.5 ml의 0.1 % 젤라틴 용액을 추가, 바로 사용하기 전에 최소 10 분, 흡인 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 라벨링 FACS 완충액을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하는 10 ㎖의 FBS와 2 ml의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다. </li><li> MACS 완충액을 선별을 제조 : 2 mM의 최종 농도에 도달하기 위해 2.5 g의 BSA 및 2 ㎖의 EDTA (0.5 M)과 500㎖의 DPBS를 보완. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 전달합니다. </li><li> 형질 전환을 위해 배 HBS 버퍼를 준비 : 280 mM의 염화나트륨 (8.1816 g)을, 10 밀리미터의 KCl (0.37275 G), 1.5 밀리미터 나 2 HPO 4 (0.10647 G), 12 mM의 포도당과 500 ml의에게 HEPES 버퍼 (50 mm)를 보완 (1.08096 g의 ). 7.05-7.12하여 pH를 조정하기 위해 약 650 μL 10 N의 NaOH를 추가합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다. </li><li> 형질 2.5 M CaCl2를 솔루션을 준비 : 18.376 g의 칼슘을 추가CL 2-50 ML의 DDH 2 O 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 필터와 저장소를 통해 필터링합니다. </li><li> ICC (면역 세포) 고정 버퍼를 준비 : 4 %의 최종 농도에 도달하기 위해 35 ML의 DPBS에 5 ml의 파라 포름 알데히드 (PFA, 32 %)를 첨가. </li><li> ICC의 투과성으로 버퍼를 준비한다 : 0.1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS 0.1 mL의 트리톤 추가. </li><li> ICC 블로킹 완충액을 제조 : 5 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS에 5g 소 혈청 알부민 (BSA)을 추가한다. </li><li> ICC 염색 버퍼를 준비 : 1 %의 최종 농도에 도달하는 100 ㎖의 DPBS로 1g의 BSA를 추가한다. </li></ol> 신생아 마우스 심장 섬유 아세포의 2 세대 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 절편 배양 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성 <ol><li> 청소 신생아 αMHC-GFP 형질 전환 마우스 75 % 에탄올 (P2에 P1). 멸균 가위로 머리를 잘라. 그런 다음 다른 하나의 겨드랑이 아래에서 수평 절개를합니다. 멸균을 사용하여무딘 구부러진 집게는 심장을 해부하고 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 포함하는 24 웰 플레이트 잘 하나에 배치합니다. <ol><li> 또한, 수평 절개 한 후 심장을 짠다. </li></ol></li><li> 형광 현미경으로 마음에 GFP 발현을 확인합니다. GFP 발현이 심장 특이 적 프로모터이다 αMHC 프로모터에 의해 구동되기 때문에 부정적인 마음이 어떤 형광 희미 동안, 형질 전환 마우스의 심장, 녹색 (15)에 있어야합니다. </li><li> 60mm 센터 웰 배양 접시에 3 ~ 4 GFP 긍정적 인 마음을 가지고 멸균 가위와 집게로 작은 조각 크기가 1mm 미만 3로를 말하다. </li><li> 2 ml의 FB 매체와 한 10cm 접시에 3-4 다진 마음을 놓습니다. 조직을 3 시간 동안 정착하자. </li><li> 천천히 심장 조직을 포함하는 요리 8 ml의 예열 FB 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안 조직을 방해하지 마십시오. </li><li> 3 일 미디어를 교체합니다. </li><li> 7 일, aspir에문화 매체를 먹고 DPBS로 세포를 씻어. 각 접시에 3 ml의 0.05 % 트립신을 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 다이제스트. </li><li> 트립신을 해소하기 위해 5 ml의 FB 미디어를 추가합니다. 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 분리. 위로 더 기계적으로 조직을 떼어 놓다 아래로 미디어를 피펫. </li><li> 세포를 수집하고 심장 조직 절편의 오염을 방지하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링 한 후 5 분 동안 200 XG에서 회전하여 세포 펠렛. </li><li> 세척 세포는 한 번 맥 버퍼 및 세포 분류에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 효소 분해 방법에서 심장 섬유 아 세포를 생성 <ol><li> 수확 GFP 2.1.1와 같은 긍정적 인 마음입니다. 10 ml의 얼음처럼 차가운 DPBS와 10cm 접시에 모든 마음을 전송합니다. </li><li> 혈액을 제거하고 얼음처럼 차가운 DPBS로 한번 씻어 살균 집게와 심실을 짜내. </li><li> 다른 조직과 지방의 자유를 마음을 낸다. </li><li> 여전히 느슨하게 연결되어 약 4 조각으로 각각의 심장을 잘라. </li><li> 20 미만 마음, 8 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 - EDTA와 15 ML 원뿔 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양합니다. <ol><li> 20-30 마음이있는 경우, 10 ml의 따뜻한 0.05 % 트립신 EDTA로 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 마음을 전송하고, 15 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li></ol></li><li> 트립신을 취소하고 HBSS 또는 (20 ~ 30 하트) 10 ml의 따뜻한 II 형 콜라겐 (0.5 ㎎ / ㎖) (20 미만 마음이) 5 mL를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 소용돌이가 4-6 주위에 속도 수준에서 1 분 vortexer를에 튜브 (액체가 뚜껑까지하지 않는 경우, 속도는 괜찮습니다). </li><li> 3 ~ 5 분 동안 37 ℃로 물을 욕조에 튜브를 품어. </li><li> 1 분 동안 튜브를 소용돌이. </li><li> 조직 조각이 정착 될 때까지 중력에 의해 1 분 동안 퇴적물은 5 ml의 차가운 FB 매체를 포함하는 새로운 튜브에 액체를 수집합니다. </li><li> 반복 2.2.6-2.2.10 3-5 번 단계를 반복합니다. </li><li> 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링하여 모든 모음을 결합단일 세포 현탁액을 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기. </li><li> 재현 탁 (10) ML의 맥 버퍼에있는 세포, 4 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기. </li><li> 선택적 : 1 ml의 RBC 용해 완충액 (150 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA)과 혈액 세포에 resuspend 세포가 많이 존재한다면, 10 ㎖의 MACS로 희석시키고, 1 분간 얼음 위에 유지 버퍼 및 5 분 200 XG에 원심 분리기. MACS 버퍼와 한 번 더 씻는다. </li></ol></li><li> 맥에 의해 Thy1.2 + 섬유 아 세포의 분리 (자기 활성화 된 셀 정렬) <ol><li> 트리 판 블루 염색을 통해 생존 세포 수를 결정합니다. <ol><li> 단계 2.2.14에 10 ml의 세포 현탁액 10 μL 세포를 꺼냅니다. 10 μL 0.4 % 트리 판 블루 용액을 섞는다. </li><li> 혈구에 혼합물을 추가합니다. 이 3 ~ 5 분간 방치 한 후 현미경으로 즉시 검사 할 수 있습니다. 파란색과 생존 세포에 염색 된 죽은 세포는 흠이다. </li><l난&gt; 혈구의 네 1mm 코너 사각형의 모든 가능한 세포를 계산합니다. 생존 세포 수를 결정 광장 × 2 (희석 배수) 당 평균 횟수가 4 × 10 10 (세포 현탁액의 전체 볼륨을) ×. </li></ol></li><li> 이하 1 × 10 7 세포의 경우, 90 μL 10 μL의 Thy1.2 마이크로 비드와 재현 탁 세포는 맥 버퍼를 냉각. 이상 1 × 10 7 세포가 비례하는 경우 더 많은 구슬을 추가합니다. 잘 혼합하고 30 분 동안 냉장고 (2-8)에 품어. </li><li> 10 ml의 맥이 버퍼와 스핀 샘플 5 분 200 XG에 추가; 다시 10 ml의 맥 버퍼와 원심 분리기로 한 번 씻는다. </li><li> MACS 버퍼에 2 ml의 부피를 가져와. </li><li> 맥 구분 후드에서 설정합니다. 분리기에 LS 열을 삽입합니다. 맥 컬럼에 버퍼 3 ㎖ 그것을 평형에 적용됩니다. </li><li> 평형 LS의 칼럼을 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 마다 버퍼 2 ML의 맥 3 회 반복한다. </li><li> T 오프 LS 열을 가라그 세퍼레이터는 MACS 새로운 50 ㎖ 튜브에 버퍼 2 ㎖로 3 회 용출. </li><li> 5 분 동안 200 XG 스핀. </li><li> 10 ㎖의 FB 배지에서 재현 탁 세포는 세포를 계산하고 적당한 농도로 플레이트에 시드. 이식편 배양 방법에서 생성 된 섬유 아세포를 들어, 시드 세포 밀도는 약 2-3 × 104 세포 / 웰로 24 웰 플레이트 일 수있다. 효소 분해 방법에서 발생하는 섬유 아세포를 들어, 세포 밀도는 약 4 ~ 5 × 10 4 세포 / 웰 24 웰 플레이트 될 수 있습니다. </li></ol></li></ol> ICM 재 프로그래밍을위한 레트로 바이러스의 3 세대 참고 : 무균 조건 하에서 BSL2 생물 안전 캐비닛에서 다음 단계를 수행합니다. 형질 감염된 세포, 피펫 팁 및 튜브의 적절한 폐기는 환경과 건강 위험의 위험을 방지하는 것이 좋습니다. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신과 10 μg의 / ㎖의 B 보충 플랫-E 미디어에서 플랫 - E 세포를 유지5 % CO 2, 37 ℃에서 lasticidin. </li><li> 하루에 2 일, 퓨로 마이신과 블라스트가없는 플랫-E 배양 배지로 매체를 교체합니다. </li><li> 0 일에서 10cm 요리 약 형질 전날 플레이트 당 4 ~ 5 × 10 6 세포로 플랫 - E 세포를 분리. 세포는 ~ 형질의 날에 80~90% 합류해야한다. </li><li> 1 일에, 이전에 형질 전환에 1 시간 내에서 세포에 형질 미디어로 변경 문화 미디어. 다음과 같은 형질의 절차는 다음과 같습니다 <ol><li> 상업 키트를 사용하여 형질 <ol><li> 20 ㎕를 형질 감염 시약 (리포 펙 타민 등) 500 μL를 혼합 감소 된 혈청 배지 (예를 들어,의 Opti-MEM). 혈청 미디어 감소 다른 500 μL에 레트로 바이러스 플라스미드의 10 μg의 추가. 5 분 동안 실온 (RT)에서 각각의 혼합물을 배양한다. </li><li> 천천히 형질 전환 혼합물에 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 이 단계는 15 ~ 30 초 정도 걸릴 수 있습니다. (솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다) 실온에서 20 분 동안 혼합물을 품어. </리&gt; <li> 세포 현명한 혼합물 드롭을 추가합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 하룻밤 품어. </li></ol></li><li> 인산 칼슘을 사용하여 형질 감염. <ol><li> 40 ㎕의 2.5 M CaCl2를 440 μL가 DDH 2 O 후 레트로 바이러스 플라스미드의 20 μg의 (총 부피 500 μL가되도록 DDH 2 O의 양을 조절)를 추가 혼합한다. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 HBS 배 500 μl를 추가합니다. </li><li> HBS 와동과 한편 HBS에 칼슘-DNA 혼합물을 적가 추가 할 수 있습니다. 이 단계는 각 샘플에 대해 30 초 주위에 걸립니다. 그래서 최대한 동시에 3-4 샘플을한다. </li><li> 더 이상 시간이 침전물을 차지하게됩니다 큰 침전물 적은 세포로 연결을위한 3 분의 보육 RT에서 품어. </li><li> 혼합물이 세포에 적가하고 20 배 현미경으로 관찰 추가합니다. 미세 침전물 (작은 것들의 많은 좋은하지만 몇 가지 큰 사람이 잘되지 않습니다) 볼 수 있어야합니다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 밤새 품어. </lI&gt; </ol></li></ol></li><li> 하루에 2 일, 문화 미디어 데워진 8 mL를 세포에 미디어를 변경합니다. 24 시간 동안 품어. </li><li> 3 일 및 4 일째, 0.45 ㎛의 공극 크기의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통해 여과, 10 mL의 멸균 일회용 주사기를 사용하고 50 ㎖ 튜브에 전사함으로써 접시에서 배양 상등액을 모은다. 매 8 mL의 바이러스 함유 뜨는에 레트로 바이러스 침전 용액 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 섞어 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 5 일에, 30 분 동안 4 ℃에서 1,500 × g에서 바이러스 액을 스핀. 바이러스 입자는 튜브의 바닥에 흰색 펠렛에 나타납니다. </li><li> 상층 액을 버린다. 5 분 동안 1,500 × g에서 원심 분리하여, 잔류 용액을 스핀 다운. 펠렛에 침전 된 레트로 바이러스 입자를 방해하지 큰 관심을 가지고, 흡인에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다. </li><li> 매 8 mL의 바이러스 상층 액 100 μL의 DPBS 버퍼와 레트로 바이러스 펠렛을 재현 탁. 나누어지는얼음에 바이러스. 즉시 사용 또는 -80 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 심장 섬유 아세포 4. 재 프로그래밍 <ol><li> 10 ml의 ICM 매체에 10 ㎎ / ㎖ 폴리 브렌 솔루션의 4 μL를 추가로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 폴리 브렌의 최종 농도는 4 μg의 / ㎖이다. </li><li> 섬유 아 세포와 시드 24 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL ICM 미디어 포함 폴리 브렌를 추가합니다. </li><li> 이식편 문화 또는 효소 절단 방법에서 4-5 × 10 4 세포에서 각 웰 포함 중 2 ~ 3 × 104 세포에 10 μL의 레트로 바이러스를 추가합니다. 바이러스의 양에 비례 다른 배양 플레이트 또는 접시에서 세포 수 증가와 함께 증가한다. 바이러스 감염을 허용하는 24 ~ 48 시간 동안 37 ° C를 배양기에서 접시를 넣습니다. 심장 리 프로그래밍에 대한 타임 라인은도 1에 도시된다. </li><li> 바이러스 성 전달 후, 500 μL 일반 ICM 매체와 바이러스를 포함하는 미디어를 교체합니다. </li><li> 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. 바이러스 성 형질 도입 세포의 긍정적 인 선택을위한 세포를 대상으로 2 μg의 / ㎖에서 퓨로 마이신 보충 ICM 미디어를 추가 할 수 있습니다. 사흘 동안을 유지합니다. 그 후, 1 μg의 / ㎖의 농도로 배지에서 ICM 퓨로 마이신을 유지한다. </li><li> 사흘 바이러스 감염 후, 인큐베이터에서 밖으로 판을 가지고 GFP 발현을 관찰하기 위해 거꾸로 형광 현미경 (20X) 아래에 배치합니다. 주 : 열흘 바이러스 감염 후에, 세포를 FACS 분석 및 리 프로그래밍의 효율을 결정하는 ICC 분석을 위해 채취 될 수있다 (단계 5 및 6). </li><li> 열네 일 바이러스 감염 후, B27 미디어와 ICM 미디어를 교체합니다. 3 일 미디어를 변경합니다. 자발적인 박동 세포 궤적 세 (효소 분해 방법과 세포) 또는 바이러스 성 전달 후 네 (절편 배양 방법과 세포) 주에서 나타날 수 있습니다. </li></ol> 재 프로그래밍 효율 5. 면역 세포 화학 분석 <ol><li> 린스 세포세 번 PBS 차가운 얼음; 여분의 용액을 제거. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC 고정 버퍼를 추가합니다. 15 ~ 20 분 동안 실온에서 세포를 수정. </li><li> PBS로 3 회 세포를 씻어. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 ICC의 투과성으로 버퍼를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS로 3 회 세포를 씻어. </li><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 버퍼를 차단 0.5 ml의 ICC 추가, 1 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> ICC 염색 버퍼로 희석 일차 항체. 잘 200 μL 각 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C를 품어. 항체 희석 요인은 재료에 나열되어 있습니다. </li><li> 다음날, PBS로 3 회 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포에 200 μL 차 항체 솔루션을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 3 회 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 솔루션 각 웰에 DAPI를 포함하는 설치 150 μl를 추가합니다. 1 분 동안 핵을 염색 할 수 있습니다. 그때둥근 유리 커버 슬립과 잘 각각을 커버하고 부드럽게 공기 방울을 제거하기 위해 집게로 바닥면에 미끄럼을 누릅니다. </li><li> 과잉 솔루션을 기음과 샘플 이미징을위한 준비가되어 있습니다. D14에서 표현 재 프로그램 세포 심장 마커 cTnT를하고 αActinin을 보여주는 대표 이미지는 그림 2B에 표시됩니다. </li></ol> 재 프로그래밍 효율의 6 FACS 분석 <ol><li> 철저히 DPBS 한 번 세포를 씻으십시오. 각 웰에 0.3 ml의 트립신 (0.05 %)를 첨가하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 부드럽게 세포를 해제 용이하게하기 위해 판을 누릅니다. 현미경으로 세포의 분리를 확인합니다. 대부분의 세포가 분해 될 때 각 웰에 1 ml의 외과 버퍼를 추가합니다. 피펫까지 추가로 기계적으로 세포를 떼어 놓다에 이르기까지. </li><li> 잘 잘 96 웰 깊은 우물 판에 24 웰 플레이트에 세포를 전송합니다. 4 ℃에서 5 분 200 XG에 스핀 세포를 수집합니다. </li><li> 한 번 씻을 세포FACS 버퍼입니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 세포를 재현 탁 100 μL 고정 / 투과성으로 솔루션을 추가합니다. </li><li> 1X 세척 솔루션, 펠렛로 두 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1X 세척 버퍼에 GFP 및 cTnT에 대한 일차 항체 솔루션을 준비합니다. 철저히 50 μL 항체 솔루션으로 각 샘플을 재현 탁하고 30 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 각 샘플에 알렉사 플 루어 488 복합 당나귀 항 - 토끼 IgG의 알렉사 플 루어 647 복합 당나귀 안티 - 마우스 IgG를 포함하는 50 μL 차 항체 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 1X 세척 솔루션, 펠렛에 한 번 세포를 씻으하고, 상층 액을 제거합니다. </li><li> 400 μL 고정 버퍼 (1 % PFA와 DPBS)에 재현 탁 세포. 셀 스트레이너 캡 외과 튜브에 세포를 전송합니다. 샘플 외과 검출을위한 준비가되어 있습니다. 재 프로그래밍 efficienc의 대표 FACS 분석Y는 pMxs - 퓨로 마이신-MGT는도 2a에 도시 또는 퓨로 마이신 선택하지 않고 구성 사용. </li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+direct+fibroblast+reprogramming+to+cardiomyocytes+using+calcium+activity+as+a+functional+measure+of+success.">Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).</li><li>Chen, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+using+Gata4,+Mef2c,+and+Tbx5.">Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5.</a> Circ Res. 111, 50-55 (2012).</li><li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+MYOCD,+SRF,+Mesp1+and+SMARCD3+enhance+the+cardio-inducing+effect+of+GATA4,+TBX5,+and+MEF2C+during+direct+cellular+reprogramming.">Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming.</a> PLoS One. 8, e63577 (2013).</li><li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state.">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).</li><li>Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+with+the+MyoD+transactivation+domain.">Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain.</a> Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142, 375-386 (2010).</li><li>Inagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cardiomyocyte-like+cells+in+infarct+hearts+by+gene+transfer+of+Gata4,+Mef2c,+and+Tbx5.">Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5.</a> Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).</li><li>Islas, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+ETS2+and+MESP1+transdifferentiate+human+dermal+fibroblasts+into+cardiac+progenitors.">Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).</li><li>Jayawardena, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+in+vitro+and+in+vivo+direct+reprogramming+of+cardiac+fibroblasts+to+cardiomyocytes.">MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes.</a> Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).</li><li>Muraoka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-133+promotes+cardiac+reprogramming+by+directly+repressing+Snai1+and+silencing+fibroblast+signatures.">MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures.</a> Embo J. 33, 1565-1581 (2014).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors.">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141, 4267-4278 (2014).</li><li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiac+fate.">Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).</li><li>Protze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+transcription+factor+screening+for+reprogramming+of+fibroblasts+to+cardiomyocyte-like+cells.">A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).</li><li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro.">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Molecules+Enable+Cardiac+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+with+a+Single+Factor,+Oct4.">Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4.</a> Cell Rep. , (2014).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+Gata4,+Mef2c,+and+Tbx5+Influences+the+Efficiency+and+Quality+of+Induced+Cardiac+Myocyte+Reprogramming.">Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming.</a> Circ Res. , (2014).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes.">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485, 593-598 (2012).</li><li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor.">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652 (2012).</li><li>Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+thymosin+beta4+and+cardiac+reprogramming+factors.">Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors.</a> Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).</li><li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+transcription+factors+is+critical+for+cardiac+reprogramming.">Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. , 116-216 (2015).</li><li>Srivastava, D., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+factors+for+cardiac+reprogramming.">Critical factors for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. 111, 5-8 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜을 사용하는 경우 성공적인 ICM 생성을위한, 전체 효율에 영향을 미치는 중요한 요인은 몇 가지가있다. 특히 섬유 아세포의 개시 조건으로 레트로 바이러스 부호화 MGT의 품질이 크게 리 프로그래밍의 효율에 영향을 미칠 수있다. 그것은 가능한 한 신선하고 건강한 섬유 아 세포를 생성하는 것이 중요하다. 이식편 후 7 일이 접시에 플레이 팅 하였다 전에 이식편 배...

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.
Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31. 
Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1088">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">anti-cardiac troponin T</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">MS-295-PO</td>
			<td style="width:191px;">1:200 for FACS and 1:400 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-GFP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11122</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti- aActinin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7811</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Connexin43</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6219</td>
			<td>1:500 for&#160; ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anit-Mef2c</td>
			<td>Abcam</td>
			<td style="width:200px;">ab64644</td>
			<td>1:1000 for ICC&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Gata4</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:200px;">sc-1237</td>
			<td>1:200 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Tbx5</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-17866</td>
			<td>1:200 for ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 488&#8211;conjugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor 647&#8211;conjugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>1:500 for both FACS and ICC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Cytofix/Cytoperm kit for intracellular staining</td>
			<td style="width:236px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:200px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rhod-3 Calcium Imaging Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">R10145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thy1.2 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-049-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectashield solution with DAPI</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td style="width:200px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F-2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">25-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PRMI1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IMDM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">10-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">30-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11130-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">11668500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">blasticidin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11139-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">puromycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polybrene</td>
			<td>Millipore</td>
			<td style="width:200px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:236px;">Fisher</td>
			<td style="width:200px;">BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CaCl2</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">paraformaldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td style="width:200px;">15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Retrovirus Precipitation Solution</td>
			<td>ALSTEM</td>
			<td style="width:200px;">VC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4%Trypan blue solution</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)</td>
			<td style="width:236px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">21022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.45 &#956;m cellulose acetate filter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">190-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well plates</td>
			<td style="width:236px;">Corning</td>
			<td style="width:200px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:200px;">172958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">60mm center well culture dish&#160;&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:200px;">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 Well Clear V-Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td style="width:200px;">P9639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:236px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:200px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:200px;">5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortexer MINI</td>
			<td style="width:236px;">VWR</td>
			<td style="width:200px;">58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EVOS&#174; FL Auto Cell Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:200px;">AMAFD1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:200px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:461px;">Round glass cover slip</td>
			<td style="width:236px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:200px;">72195-15</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved generation of induced cardiomyocytes using a polycistronic construct expressing optimal ratio of gata4, mef2c and tbx5

유도 된 심근 세포로 심장 섬유 아세포 (CFS)의 직접 변환 (ICMS)는 심장 질환의 치료를위한 대안 전략을 제공함으로써 재생 의학을위한 큰 잠재력을 보유하고있다. 이 변환은 Gata4 (G), Mef2c (M) 및 Tbx5 (T)로 정의 요인의 강제 식으로 이루어졌다. 전통적으로, ICMS는 이러한 개별 요소를 표현 바이러스의 칵테일에 의해 생성됩니다. 그러나, 효율을 재 프로그래밍하는 것은 상대적으로 낮고 시험관 대부분 G, M, 섬유 아세포가 곤란 리 프로그래밍 메커니즘을 연구 할 수있게, 충분히 재 프로그램되지 않은 T-형질. 우리는 최근 G, M의 화학 양론이, T 효율적 ICM의 프로그래밍에 대한 중요 것으로 나타났습니다. M하고 MGT 폴리 시스 트론 벡터 (이하 MGT라고 함) 상당히 증가 리 프로그래밍 효율을 이용함으로써 달성 G 및 T의 낮은 수준의 상대 수준이 높은 G, M, T 최적의 화학 양론과 시험 관내에서 향상된 품질 ICM. 여기서 우리는 심근 아세포에서 MGT 구성체 ICMS를 생성하기 위해 사용 된 방법의 상세한 설명을 제공한다. 심근 아세포, 프로그래밍 및 리 프로그래밍 프로세스 평가 용 바이러스의 생성은 분리 ICMS의 효율적이고 재생 가능한 생성을위한 플랫폼을 제공하기 위해 포함된다.

프로그래밍 단계는. 그림 1에 개략적으로 요약된다 MGT 전달 후, 세포를 재 프로그램에서 GFP 발현은 초기 형질 세포의 3 퓨로 마이신 선택이 3 일에서 시작하고 2 주 동안 유지되는 날이 검출 될 수 있다면 PMX-순수하지 않아 -MGT 구조가 사용됩니다. 14 일에 10 일까지, cTnT를하고 αActinin 같은 심장 마커의 발현이 시작 섬유 아 세포가 심장 세포를 향해 재 프로그래밍을 겪고 있음을 나타내?...

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Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Gata4, Mef2c 및 Tbx5의 최적 비율을 표현하는 폴리 시스 트론 구조를 사용하여 유도 된 심근의 향상 발전

Direct conversion of cardiac fibroblasts (CFs) into induced cardiomyocytes (iCMs) holds great potential for regenerative medicine by offering alternative ...

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K 조회수.  University of North Carolina, Chapel Hill. We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming. 

비디오: Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

연구

발생학

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

류마티스 관절염 환자의 관절에서 분리 된 섬유 아세포와 같은 활막을 사용하여 유도 - 만능 줄기 세포의 생성

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their potential applications in cardiac research, including drug discovery, disease modeling, tissue engineering, and regenerative medicine. However, cells produced by existing protocols display a range of immaturity compared with native adult ventricular cardiomyocytes. Many efforts have been made to mature hPSC-CMs, with only moderate maturation attained thus far. Therefore, an engineered system, called biowire, has been devised by providing both physical and electrical cues to lead hPSC-CMs to a more mature state in vitro. The system uses a microfabricated platform to seed hPSC-CMs in collagen type I gel along a rigid template suture to assemble into aligned cardiac tissue (biowire), which is subjected to electrical field stimulation with a progressively increasing frequency. Compared to nonstimulated controls, stimulated biowired cardiomyocytes exhibit an enhanced degree of structural and electrophysiological maturation. Such changes are dependent upon the stimulation rate. This manuscript describes in detail the design and creation of biowires.

The cardiac biowire platform is an in vitro method used to mature human embryonic and induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CM) by combining three-dimensional cell cultivation with electrical stimulation. This manuscript presents the detailed setup of the cardiac biowire platform.

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...