이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

1입니다. RPE에 hPSC의 차별화
<ol><li>유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs. 참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다.</li>
	<li>
차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
	<ol>
<li>플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.</li>
		<li>새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포. 참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하실 멤브레인 매트릭스를 저장 하 고 한 약 수를 사용 하 여 6 잘 플레이트 코트. 코팅에 대 한 시간 또는 하룻밤 실 온에서 37 ° C에서 4 h까지 확장할 수 있다. 일시 중단 하 고 3-5 셀 보다는 단일 세포의 작은 수 풀으로 hPSCs 씨앗에 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포는 성장 전체 confluency 때 차별화 매체 (4 mL/음)와 문화 매체를 대체 (표 1, activin-A). 문화, 14 일에 대 한 변화 하는 매체 (4 mL/잘) 3 배 / 주. 참고: hPSC 플레이트 밀도 복식 약 마다 24 h. 중요 한 세포 죽음 차별화 절차의 시작으로 예상 된다. 죽은 세포와 우물에서 파편의 집계는 중간 변경 시 맨 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>하루 28 일 15에서에서 100 ng/mL 인 activin-A (표 1, 인간 activin-A)와 차별화 매체를 보충. 매체 (4 mL/잘) 변경 3 x / 주.</li>
	<li>Activin-A 보충 주 29 (표 1, 인간 activin-A)에 시작을 중지 합니다. 안료 hPSC-RPE 클러스터 (그림 1A-B)이 나타날 때까지 8-10 주에 대 한 차별화 매체에 경작 하는 셀을 계속. 참고: 클러스터 색소 세포의 볼 수 있습니다 셀 문화 접시에 작은 어두운 점으로 (그림 1A-B, 톱) 육안에 의해. 서명 조약돌 모양으로 개별 안료 세포는 현미경 20 X (그림 1A-B, 아래) 볼 수 있습니다.</li>
</ol>2. 격리와 차별화 된 RPE 세포의 문화
<ol><li>차별 매체를 제거, PBS로 한 번 씻어, 0.05 %trypsin 플러스 각 음에 콜라의 1 U / µ L의 1 mL를 추가 20-30 분 제거 트립 신/콜라에 대 한 37 ° C에서 품 어 고 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 음에 미리 따뜻하게 RPE 매체의 2 개 mL를 추가 (< c0 > 표 2). 참고: 다각형 트립 신/콜라 치료 하기 전에, hPSC-RPE 세포의 형태를 모니터링 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 충분 한 소화 후 라운드 되 고.</li>
	<li>
당겨 유리 펫 파스퇴르 분 젠 버너를 사용 합니다.
	<ol>
<li>두 손으로 잡고 오래 (9 인치) 파스퇴르 피 펫 수평, 그래서 양쪽 끝에 분 젠 버너 위에 피 펫의 얇은 부분의 길이를 약 2/3.</li>
		<li>일단 유리는 불꽃에서 부드러운 되 고, 신속 하 게 당겨 두 끝 떨어져, 마이크로 스 크레이 퍼 같은 팁은 피 펫 (그림 2)의 새로운 끝에 형성 되도록 합니다.</li>
		<li>여러 "셀 기구"를 만드는 데 여러 번 반복 합니다. 가져온된 펫 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이 하 고 셀 문화 후드에 그들을 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경, 마이크로 "셀 스 크레이 퍼"를 사용 하 여 부드럽게 분리 접시에서 안료 hPSC-RPE 클러스터를.
	<ol>
<li>부드럽게 탭 (긁어 하지 않습니다) 직접 색소 세포에는 플 로트 것입니다 최대 문화 매체에 일단 그들이 우물의 바닥에서 해리.</li>
		<li>즉시 사용 하 여 20 µ L micropipette 부드럽게 해리 hPSC-RPE 세포를 흡입 하 고 RPE 중간24미리 코팅된 6 잘 플레이트에 그들을 전송.</li>
		<li>미리 코팅 12-잘 접시의 단계 2.3.1–2.3.2 필요에 따라 여러 번 반복 하 여 각 5 ~ 103 셀 (~ 10% confluency 20 X 현미경 관찰) 배를 수집 합니다. 2 mL에 매체의 최종 볼륨을 가져와. 참고: 해리 hPSC-RPE를 방지 하기 위해 부동에서 셀, 하지 마십시오 플레이트의 움직임을 분리 과정에서 천연된 셀 매체에 떠 있지만 여전히 로컬 집중 유지 되도록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 매체 안료 단층 (그림 1C)을 형성 있도록 또 다른 6-8 주 동안에 12-잘 접시에 문화 새로 격리 hPSC-RPE 세포 (P0)</li>
	<li>3 매체 변경 x / 주. 매체를 변경할 때 기존 매체의 약 1/3 볼륨에 각 잘 두고 신선한, 미리 데워 진 RPE 매체의 2/3 볼륨 추가. 이 단계에서 12-잘 접시에 각 잘 RPE 매체의 2 mL을 사용 (따라서, 중간의 1.3 mL 때마다를 교환). 참고: P0 hPSC-RPE 세포의 단층 지붕, 셀 적극적으로 체액을 운반 하 고 단단한 접속점25에 의해 정박 제안 양식 수 있습니다. 따라서, 돔 형성 RPE 상태 성숙의 지표 이다.</li>
</ol>3. RPE Immunoblotting 운명 유효성 검사
<ol><li>확인 hPSC-RPE 세포 lysate 가수분해 억제 물 보충 포유류 단백질 추출 버퍼를 사용 하 여 칵테일. 소화 세포 파편을 삭제 하도록 4 ° C에서 15 분 13000 x g 에서 원심 분리 하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포 lysate를 품 어. Lysate의 총 단백질 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 40 75 ° C에서 Laemmli SDS 샘플 버퍼에 총 단백질의 µ g 단백질을 분리 하는 10 분에 대 한 샘플에 15 분 및 염료 앞에 도달 될 때까지 다음 150 V 90 V의 정 전압에서 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 젤의 하단.</li>
	<li>100 V 1 h 10% 메탄올 보충 사전 냉각된 트리 스-글리신 버퍼에 니트로 막에 단백질을 전송 합니다.</li>
	<li>0.1% 비 이온 세제 (TBST)와 실 온에서 1 h 5% 비 지방 건조 우유 염 분 Tris 버퍼에 막을 차단 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 블로킹 버퍼에 하룻밤 희석 주 항 체를 막 품 어. 다음과 같이 RPE 특정 마커 단백질을 대상으로 하는 항 체 희석: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1의 1:1, 000 Β-말라 로드 컨트롤을 검색 하는 1:10,000에서 β-걸에 대 한 항 체 희석.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 3 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>마우스로 fluorophore 활용된 염소 항 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 IgG 이차 항 체 희석 1:10,000 막 품 어.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 4 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>이미징 시스템 (그림 3)는 적외선을 사용 하 여 단백질을 감지 합니다.</li>
</ol>4. 검사 Immunostaining에 의해 BEST1 Subcellular 지 방화
<ol><li>2 mL PBS의 hPSC-RPE 세포를 한 번 세척 하 고 실 온에서 45 분 동안 4% paraformaldehyde 2 mL에 수정.</li>
	<li>두 번, 2 mL의 PBS로 세척 하 고 2 mL PBS의 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 2% 당나귀 세럼 45 분 비 특정 바인딩 사이트 차단와 함께 셀을 품 어.</li>
	<li>BEST1 항 체 (1: 200 희석) 실 온에서 2 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>셀 2 mL PBS 3 번을 씻는 다. 함께 품 어 fluorophore 활용 보조 IgG (1:1, 000) 실 온에서 1 h.</li>
	<li>씻어 2 mL PBS 3 번 언바운드 이차 항 체를 제거 하.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 (그림 4)에 의해 스테인드 세포를 관찰 합니다.</li>
</ol>5. 녹음 캘리포니아2 +-hPSC-RPE 전체 셀 패치 클램프에 의해에 종속 Cl- 전류
<ol><li>패치 클램프 전에 24-72 h (조약돌 모양의 안료)는 완전히 confluent 잘 (12-잘 접시)에 성숙한 P0 hPSC-RPE 세포의 분할. PBS와 중간, 세척 한 번 발음 하 고 우물에 0.05 %trypsin 플러스 1 U / µ L 콜라의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 사전 사용 하기 바로 전에 37 ° C에 트립 신/콜라 따뜻한.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고:이 단계 후 hPSC-RPE 세포는 여전히 부착 연결.</li>
	<li>1 mL micropipette 부드럽게 세척 접시, 떨어져 세포를 사용 하 여 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 소화 혼합물에 셀을 전송. 잔여 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 결합을 미리 데워 트립 신/콜라의 1 mL와 잘을 씻는 다. 참고: hPSC RPE 세포는이 시점에서 여전히 큰 덩어리에서. 활기찬 pipetting으로 셀 덩어리를 휴식 하지 마십시오. 일부 덩어리 1 mL 팁의 내부 벽에 충실 수 있습니다.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C 건조 욕조에 원뿔 튜브를 품 어.</li>
	<li>10-15 회 소화 믹스 1 mL micropipette 위아래 부드럽게 피 펫을 사용 합니다. 참고: 셀 덩어리 훨씬 작은 하지만 여전히 표시 된다. 활기찬 pipetting 하지 마십시오.</li>
	<li>위의 두 단계를 반복 합니다. 참고: 셀의 대부분 pipetting 후 단일 셀에 있어야 한다. 여전히 사용할 수 있습니다 몇 가지 작은 세포 덩어리 수 있습니다. 선택 사항: 추가 5 분 뒤에 부드러운 pipetting 37 ° C에서 원뿔 튜브 품 어. 37 ° C에서 트립 신/콜라에 총 시간 30 분 (8 + 8 + 8 + 5 = 29)을 넘지 말아야 한다.</li>
	<li>소화 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 미리 데워 RPE 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 수집을 5 분 동안 200 x g 에서 회전 합니다. 10-20 %confluency 미리 코팅된 35mm 요리에 다시 일시 중단 하 고 씨 셀 (예를 들어, 100% 10 %confluency 대 한 5 개의 35mm 요리 12-잘 접시에 confluent). 참고: 항상 피할 활기찬 pipetting 원심 분리 후에 상쾌한에 명백한 어두운 세포 파편에 의해 표현 되는 중요 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 잘 분리 된 단일 셀 시드 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다.</li>
	<li>수행 하는 전체 셀 패치 클램프18,26,,2728,29,30,31위에서 설명한 대로. 취득 단계 잠재력의 가정에서 현재 추적 (-100 + 100 0의 지주 잠재력에서 뮤직 비디오 mV) (그림 5). 참고: 내부 및 외부 솔루션의 조리법에 대해서는 표 3 과 표 4, 각각.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. 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L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate.">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction.">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환?...

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.
그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.
hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.
여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Knock-Out (KO) DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KO serum replacement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10829028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin-A</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (a modification)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 supplement</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine-penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triiodo-thyronin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR-1 medium</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER mammalian protein extraction reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>78501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE65 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRALBP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEST1 antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB300-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta Actin antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MA5-15739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SA5-35521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEKA EPC10 patch clamp amplifier</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>895040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안...

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Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

6.7K 조회수.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. 여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

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Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5' mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5' mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.

Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5' cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

연구

유전학

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to normal and pathological conditions. The goal of this protocol is to generate high-quality, large-scale transcriptome data of each endocrine cell type with the use of a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology. Such data can be utilized to build the gene expression profile of each endocrine cell type in normal or specific conditions. The process requires careful handling, accurate measurement, and rigorous quality control. In this protocol, we describe detailed steps for human pancreatic islets dissociation, sequencing, and data analysis. The representative results of about 20,000 human single islet cells demonstrate the successful application of the protocol.

Here, we present a protocol to generate high-quality, large-scale transcriptome data of single cells from isolated human pancreatic islets using a droplet-based microfluidic single-cell RNA sequencing technology.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

쌀의 경작 인구에서 고분해능 용융에 의한 돌연변이 식별

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...