이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

1입니다. RPE에 hPSC의 차별화
<ol><li>유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs. 참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다.</li>
	<li>
차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
	<ol>
<li>플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.</li>
		<li>새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포. 참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하실 멤브레인 매트릭스를 저장 하 고 한 약 수를 사용 하 여 6 잘 플레이트 코트. 코팅에 대 한 시간 또는 하룻밤 실 온에서 37 ° C에서 4 h까지 확장할 수 있다. 일시 중단 하 고 3-5 셀 보다는 단일 세포의 작은 수 풀으로 hPSCs 씨앗에 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포는 성장 전체 confluency 때 차별화 매체 (4 mL/음)와 문화 매체를 대체 (표 1, activin-A). 문화, 14 일에 대 한 변화 하는 매체 (4 mL/잘) 3 배 / 주. 참고: hPSC 플레이트 밀도 복식 약 마다 24 h. 중요 한 세포 죽음 차별화 절차의 시작으로 예상 된다. 죽은 세포와 우물에서 파편의 집계는 중간 변경 시 맨 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>하루 28 일 15에서에서 100 ng/mL 인 activin-A (표 1, 인간 activin-A)와 차별화 매체를 보충. 매체 (4 mL/잘) 변경 3 x / 주.</li>
	<li>Activin-A 보충 주 29 (표 1, 인간 activin-A)에 시작을 중지 합니다. 안료 hPSC-RPE 클러스터 (그림 1A-B)이 나타날 때까지 8-10 주에 대 한 차별화 매체에 경작 하는 셀을 계속. 참고: 클러스터 색소 세포의 볼 수 있습니다 셀 문화 접시에 작은 어두운 점으로 (그림 1A-B, 톱) 육안에 의해. 서명 조약돌 모양으로 개별 안료 세포는 현미경 20 X (그림 1A-B, 아래) 볼 수 있습니다.</li>
</ol>2. 격리와 차별화 된 RPE 세포의 문화
<ol><li>차별 매체를 제거, PBS로 한 번 씻어, 0.05 %trypsin 플러스 각 음에 콜라의 1 U / µ L의 1 mL를 추가 20-30 분 제거 트립 신/콜라에 대 한 37 ° C에서 품 어 고 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 음에 미리 따뜻하게 RPE 매체의 2 개 mL를 추가 (< c0 > 표 2). 참고: 다각형 트립 신/콜라 치료 하기 전에, hPSC-RPE 세포의 형태를 모니터링 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 충분 한 소화 후 라운드 되 고.</li>
	<li>
당겨 유리 펫 파스퇴르 분 젠 버너를 사용 합니다.
	<ol>
<li>두 손으로 잡고 오래 (9 인치) 파스퇴르 피 펫 수평, 그래서 양쪽 끝에 분 젠 버너 위에 피 펫의 얇은 부분의 길이를 약 2/3.</li>
		<li>일단 유리는 불꽃에서 부드러운 되 고, 신속 하 게 당겨 두 끝 떨어져, 마이크로 스 크레이 퍼 같은 팁은 피 펫 (그림 2)의 새로운 끝에 형성 되도록 합니다.</li>
		<li>여러 "셀 기구"를 만드는 데 여러 번 반복 합니다. 가져온된 펫 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이 하 고 셀 문화 후드에 그들을 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경, 마이크로 "셀 스 크레이 퍼"를 사용 하 여 부드럽게 분리 접시에서 안료 hPSC-RPE 클러스터를.
	<ol>
<li>부드럽게 탭 (긁어 하지 않습니다) 직접 색소 세포에는 플 로트 것입니다 최대 문화 매체에 일단 그들이 우물의 바닥에서 해리.</li>
		<li>즉시 사용 하 여 20 µ L micropipette 부드럽게 해리 hPSC-RPE 세포를 흡입 하 고 RPE 중간24미리 코팅된 6 잘 플레이트에 그들을 전송.</li>
		<li>미리 코팅 12-잘 접시의 단계 2.3.1–2.3.2 필요에 따라 여러 번 반복 하 여 각 5 ~ 103 셀 (~ 10% confluency 20 X 현미경 관찰) 배를 수집 합니다. 2 mL에 매체의 최종 볼륨을 가져와. 참고: 해리 hPSC-RPE를 방지 하기 위해 부동에서 셀, 하지 마십시오 플레이트의 움직임을 분리 과정에서 천연된 셀 매체에 떠 있지만 여전히 로컬 집중 유지 되도록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 매체 안료 단층 (그림 1C)을 형성 있도록 또 다른 6-8 주 동안에 12-잘 접시에 문화 새로 격리 hPSC-RPE 세포 (P0)</li>
	<li>3 매체 변경 x / 주. 매체를 변경할 때 기존 매체의 약 1/3 볼륨에 각 잘 두고 신선한, 미리 데워 진 RPE 매체의 2/3 볼륨 추가. 이 단계에서 12-잘 접시에 각 잘 RPE 매체의 2 mL을 사용 (따라서, 중간의 1.3 mL 때마다를 교환). 참고: P0 hPSC-RPE 세포의 단층 지붕, 셀 적극적으로 체액을 운반 하 고 단단한 접속점25에 의해 정박 제안 양식 수 있습니다. 따라서, 돔 형성 RPE 상태 성숙의 지표 이다.</li>
</ol>3. RPE Immunoblotting 운명 유효성 검사
<ol><li>확인 hPSC-RPE 세포 lysate 가수분해 억제 물 보충 포유류 단백질 추출 버퍼를 사용 하 여 칵테일. 소화 세포 파편을 삭제 하도록 4 ° C에서 15 분 13000 x g 에서 원심 분리 하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포 lysate를 품 어. Lysate의 총 단백질 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 40 75 ° C에서 Laemmli SDS 샘플 버퍼에 총 단백질의 µ g 단백질을 분리 하는 10 분에 대 한 샘플에 15 분 및 염료 앞에 도달 될 때까지 다음 150 V 90 V의 정 전압에서 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 젤의 하단.</li>
	<li>100 V 1 h 10% 메탄올 보충 사전 냉각된 트리 스-글리신 버퍼에 니트로 막에 단백질을 전송 합니다.</li>
	<li>0.1% 비 이온 세제 (TBST)와 실 온에서 1 h 5% 비 지방 건조 우유 염 분 Tris 버퍼에 막을 차단 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 블로킹 버퍼에 하룻밤 희석 주 항 체를 막 품 어. 다음과 같이 RPE 특정 마커 단백질을 대상으로 하는 항 체 희석: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1의 1:1, 000 Β-말라 로드 컨트롤을 검색 하는 1:10,000에서 β-걸에 대 한 항 체 희석.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 3 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>마우스로 fluorophore 활용된 염소 항 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 IgG 이차 항 체 희석 1:10,000 막 품 어.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 4 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>이미징 시스템 (그림 3)는 적외선을 사용 하 여 단백질을 감지 합니다.</li>
</ol>4. 검사 Immunostaining에 의해 BEST1 Subcellular 지 방화
<ol><li>2 mL PBS의 hPSC-RPE 세포를 한 번 세척 하 고 실 온에서 45 분 동안 4% paraformaldehyde 2 mL에 수정.</li>
	<li>두 번, 2 mL의 PBS로 세척 하 고 2 mL PBS의 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 2% 당나귀 세럼 45 분 비 특정 바인딩 사이트 차단와 함께 셀을 품 어.</li>
	<li>BEST1 항 체 (1: 200 희석) 실 온에서 2 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>셀 2 mL PBS 3 번을 씻는 다. 함께 품 어 fluorophore 활용 보조 IgG (1:1, 000) 실 온에서 1 h.</li>
	<li>씻어 2 mL PBS 3 번 언바운드 이차 항 체를 제거 하.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 (그림 4)에 의해 스테인드 세포를 관찰 합니다.</li>
</ol>5. 녹음 캘리포니아2 +-hPSC-RPE 전체 셀 패치 클램프에 의해에 종속 Cl- 전류
<ol><li>패치 클램프 전에 24-72 h (조약돌 모양의 안료)는 완전히 confluent 잘 (12-잘 접시)에 성숙한 P0 hPSC-RPE 세포의 분할. PBS와 중간, 세척 한 번 발음 하 고 우물에 0.05 %trypsin 플러스 1 U / µ L 콜라의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 사전 사용 하기 바로 전에 37 ° C에 트립 신/콜라 따뜻한.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고:이 단계 후 hPSC-RPE 세포는 여전히 부착 연결.</li>
	<li>1 mL micropipette 부드럽게 세척 접시, 떨어져 세포를 사용 하 여 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 소화 혼합물에 셀을 전송. 잔여 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 결합을 미리 데워 트립 신/콜라의 1 mL와 잘을 씻는 다. 참고: hPSC RPE 세포는이 시점에서 여전히 큰 덩어리에서. 활기찬 pipetting으로 셀 덩어리를 휴식 하지 마십시오. 일부 덩어리 1 mL 팁의 내부 벽에 충실 수 있습니다.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C 건조 욕조에 원뿔 튜브를 품 어.</li>
	<li>10-15 회 소화 믹스 1 mL micropipette 위아래 부드럽게 피 펫을 사용 합니다. 참고: 셀 덩어리 훨씬 작은 하지만 여전히 표시 된다. 활기찬 pipetting 하지 마십시오.</li>
	<li>위의 두 단계를 반복 합니다. 참고: 셀의 대부분 pipetting 후 단일 셀에 있어야 한다. 여전히 사용할 수 있습니다 몇 가지 작은 세포 덩어리 수 있습니다. 선택 사항: 추가 5 분 뒤에 부드러운 pipetting 37 ° C에서 원뿔 튜브 품 어. 37 ° C에서 트립 신/콜라에 총 시간 30 분 (8 + 8 + 8 + 5 = 29)을 넘지 말아야 한다.</li>
	<li>소화 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 미리 데워 RPE 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 수집을 5 분 동안 200 x g 에서 회전 합니다. 10-20 %confluency 미리 코팅된 35mm 요리에 다시 일시 중단 하 고 씨 셀 (예를 들어, 100% 10 %confluency 대 한 5 개의 35mm 요리 12-잘 접시에 confluent). 참고: 항상 피할 활기찬 pipetting 원심 분리 후에 상쾌한에 명백한 어두운 세포 파편에 의해 표현 되는 중요 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 잘 분리 된 단일 셀 시드 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다.</li>
	<li>수행 하는 전체 셀 패치 클램프18,26,,2728,29,30,31위에서 설명한 대로. 취득 단계 잠재력의 가정에서 현재 추적 (-100 + 100 0의 지주 잠재력에서 뮤직 비디오 mV) (그림 5). 참고: 내부 및 외부 솔루션의 조리법에 대해서는 표 3 과 표 4, 각각.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. 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L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate.">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction.">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환?...

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.
그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.
hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.
여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.

<table><tbody><tr><td>Knock-Out (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO serum replacement</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Human activin-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (a modification)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-thyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER mammalian protein extraction reagent</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>proteinase inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 patch clamp amplifier</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation, maintenance, and analysis of human retinal pigment epithelium cells: a disease-in-a-dish model for best1 mutations

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안...

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Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

6.7K 조회수.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. 여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

신경과학

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

색소성 망막염을 모델링하기 위한 인간 환자 iPSC 유래 망막 오가노이드 생성

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and throughput of cell culture. Mature human retinal organoids are utilized to screen potential pharmaceutical treatments for the age-related retinal degenerative disease macular telangiectasia type 2 (MacTel).
We have recently shown that MacTel can be caused by elevated levels of an atypical lipid species, deoxysphingolipids (deoxySLs). These lipids are toxic to the retina and may drive the photoreceptor loss that occurs in MacTel patients. To screen drugs for their ability to prevent deoxySL photoreceptor toxicity, we generated human retinal organoids from a non-MacTel induced pluripotent stem cell (iPSC) line and matured them to a post-mitotic age where they develop all of the neuronal lineage-derived cells of the retina, including functionally mature photoreceptors. The retinal organoids were treated with a deoxySL metabolite and apoptosis was measured within the photoreceptor layer using immunohistochemistry. Using this toxicity model, pharmacological compounds that prevent deoxySL-induced photoreceptor death were screened. Using a targeted candidate approach, we determined that fenofibrate, a drug commonly prescribed for the treatment of high cholesterol and triglycerides, can also prevent deoxySL toxicity in the cells of the retina.
The toxicity screen successfully identified an FDA-approved drug that can prevent photoreceptor death. This is a directly actionable finding owing to the highly disease-relevant model tested. This platform can be easily modified to test any number of metabolic stressors and potential pharmacological interventions for future treatment discovery in retinal diseases.

Here we present a step-by-step protocol to generate mature human retinal organoids and utilize them in a photoreceptor toxicity assay to identify pharmaceutical candidates for the age-related retinal degenerative disease macular telangiectasia type 2 (MacTel).

제약 발견을 위한 인간 망막 오가노이드의 독성 스크리닝

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

생체공학

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

의학

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

생물학

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

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