이 프로토콜을 사용하면 마우스 RPE 셀의 효율적인 격리 및 배양이 가능합니다. 건강한 1차 마우스 RPE 배양은 근본적인 눈 질환의 메커니즘을 이해하는 귀중한 모델입니다. Confluent 및 실행 가능한 RPE 문화는 3 일 이내에 얻을 수 있으며 몇 주 동안 재배 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 선진국의 노인 들 중 실명의 주요 원인인 초기 연령 관련 황반 변성의 근본적인 기계장치를 이해하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 해부 단계를 시각화하는 것이 중요합니다. 세부 사항은 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다, 예를 들어, sclera가 펀치되지 않도록 안구를 처리하는 방법, 정확히 절단을 수행해야하는 곳, 그리고 그들이 열려 있도록 트립신에 눈 컵을 포함하는 방법.
프로토콜에 필요한 모든 시약을 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음, 모든 결합 조직, 혈액 및 근육을 조심스럽게 제거하여 안구를 청소하기 시작하여, 두몬트 넘버 5 포셉과 각진 가위를 사용하여 clera에 상처를 주지 않고. 눈알을 헤페스가 없는 HBSS 버퍼 3밀리리터가 포함된 신선한 접시에 옮겨 눈을 신선하고 깨끗하게 유지하고 오염을 방지합니다.
시신경을 손잡이로 사용하여 안구를 잡고 날카로운 탄소 강철 번호 11 블레이드로 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다. 두몬트 넘버 5 가위로 구멍을 뚫고 각막에 3개의 절개를 만들어 렌즈를 제거할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 시신경을 잡고 각진 가위의 기저와 함께 오라 세라타에 약간의 압력을 가하여 렌즈가 완전히 나올 때까지 가위를 발라주세요.
홍채 상피를 그대로 유지하여 잠복 중에 신경 망막과 RPE의 분리를 방지하십시오. HEPES가 없는 HBSS 버퍼에 눈을 놓습니다. 5%의 이산화탄소 식기 배양기에서 45분 동안 히알루로니다제 용액의 렌즈없이 눈을 배양하여 RPE에서 신경 망막을 분리합니다.
각 눈을 1.5 밀리리터의 차가운 HBSS HEPES 버퍼로 새 우물에 놓고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오. 세척 후, 신선한 HBSS HEPES 버퍼와 35 밀리미터 문화 요리에 각 눈을 배치합니다. 오라 세라타가 도달 할 때까지 8 센티미터 반나스 가위로 원래 절개를 통해 각막을 잘라, 다음 홍채 상피와 각막을 제거하기 위해 오라 세라타 아래로 잘라.
곡선 핀셋으로 오라 세라타를 잡고 각진 마이크로 포셉을 사용하여 신경 망막을 꺼내 RPE 층이 절단되지 않았는지 확인합니다. 그런 다음 시신경에 대한 내부 부착물을 잘라냅니다. 시신경을 자르고 각 아이컵을 1.5 밀리리터의 신선한 트립신-EDTA를 포함한 다른 12개의 웰 플레이트로 전달합니다.
아이컵이 열리고 트립신에 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 하십시오. 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도의 안구컵을 섭씨 37도에서 45분간 배양합니다. 트립신 인큐베이션 중에 분리 된 RPE 시트와 함께 각 아이 컵을 수집하고 잘 당 FBS 솔루션의 1.5 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트로 전송합니다.
RPE 시트가 트립신 솔루션에 남아 있는 경우 마이크로 파이프를 사용하여 FBS 솔루션으로 우물로 전송합니다. 각 안구는 시신경에 의해 각 안자를 잡고 RPE 시트의 완전한 분리가 이루어질 때까지 HBSS HEPES 버퍼에서 20%의 FBS1.5 밀리리터를 함유한 12개의 웰 플레이트로 아래로 흔들어 줍니다. 배양을 오염시킬 수 있는 조각이나 코로이드를 피하고, 마이크로피펫으로 RPE 시트와 RPE 클러스터를 수집하고 15밀리리터 튜브에 넣습니다.
한 튜브에 같은 마우스에서 두 눈을 당깁니다. 그런 다음 RPE 혼합물을 실온에서 2분 동안 340 x g에서 원심분리하고 상체를 폐기합니다. RPE 펠릿을 0.25%의 트립신-EDTA 의 1밀리리터 혼합물로 부드럽게 재중단하고 RPE 시트를 단일 세포로 분해하기 위해 섭씨 37도의 수조에서 1분 동안 배양합니다.
그런 다음 거품 형성을 피하면서 10번 위아래로 부드럽게 피펫을 피합니다. 갓 준비된 RPE 배지 9밀리리터를 추가하여 실온에서 2분 동안 트립신과 원심분리기를 340xg에서 희석하고 비활성화합니다. 수퍼내티를 흡인하고 5%의 FBS를 가진 RPE 배지의 150 마이크로리터에서 셀 펠릿을 조심스럽게 재보힙합니다.
다음으로, 이전에 준비된 라미닌 코팅 멤브레인 인서트의 하단 챔버에서 PBS를 제거하고 700 마이크로리터의 RPE 배지를 추가한다. 멤브레인 인서트의 상부 챔버에서 라미닌을 제거하고 RPE 셀 서스펜션 드롭 와이즈를 분할하고 챔버의 중앙에 균일하게 분배한다. 멤브레인 인서트를 5%의 이산화탄소 인큐베이터에 37°C이상 24시간 동안 배치합니다.
그런 다음 현미경 의 밑에 멤브레인 삽입을 확인하여 대부분의 RPE 세포가 삽입에 부착되고 합류가 적어도 50 %인지 확인72 시간 동안 미디어를 변경하지 마십시오. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 RPE 세포는 전형적인 RPE 크기, 형태학 및 색소 침착을 보였다. 두 개의 핵이 단단한 접합과 함께 압정 마이크로빌리 및 기저 인폴딩의 존재와 함께 고극성 RPE 단층이 1 주일 후에 관찰되었습니다.
RPE 단층의 편광은 TER 값에 의해 확인되었으며, 평균 200 ohms 센티미터 제곱보다 높은 것으로 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되었습니다. FITC 표지소 POS에서 수행된 식세포분해소에서, POS의 침몰 및 소화가 관찰되어 RPE 세포의 기능적인 컨실릭 단층의 형성을 나타낸다. 실행 가능한 문화권은 경험으로 달성되는 짧은 해부 시간이 필요합니다.
일부 RPE 세포는 신경 망막에 부착된 상태를 유지할 수 있지만 여러 RPE 시트가 부착된 상태로 유지되면 프로토콜이 성공하지 못할 것입니다. 신선한 히알루로니다스는 이 문제를 방지하기 위해 매번 사용되어야 합니다. 이러한 기능적인 1차 마우스 RPE 세포 배양은 많은 안구 질환에서 RPE의 병리학을 연구하는 귀중한 도구입니다.
예를 들어, 이 프로토콜은 황반 변성의 마우스 모델에서 RPE의 병리학을 연구할 수 있게 했다.
