인디애나 대학 질량 분광학 시설 및 대학의 유타 대사체학 핵심 시설 지원이이 프로토콜 최적화에 대 한 회원 들에 게 감사. J.M.T.에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 R35GM119557에서 국립 보건원의 지원 됩니다.

1. 달걀 컬렉션
<ol><li>성인 남성 및 원하는 genotypes의 처녀 여성을 수집 합니다. 개별적으로 3-5 일에 대 한 표준 블루밍턴 미디어와 식품 유리병에서이 동물을 나이.</li>
	<li>새로운 음식 유리병에 50 처녀 암컷과 25 남성을 전송 하 여 적절 한 matings를 설정 합니다. 참고: 최소 6 개의 독립적인 matings 설정 되어야 합니다 각 유전자 형에 대 한. 하나의 샘플 각 짝짓기 (즉, 6 개의 독립적인 matings에서 수집 된는 6 샘플)에서 수집 됩니다.</li>
	<li>
당 밀 계란-누워 모자를 준비 합니다.
	<ol>
<li>115 mL 당 밀의과 한 천의 29 g H2O 2 L 플라스 크에 700 mL와 함께 믹스.</li>
		<li>당 밀 뜨거운 접시에 한 천 혼합물을 끓인 다.</li>
		<li>70 ° c에 냉각</li>
		<li>산 믹스 (20 mL의 85% 인산 H2O; 1 L에 209 mL 프로 산 25 mL를 추가 갈색 병에 게)와 95% 에탄올에 10% p hydroxy benzoic 산 메 틸 에스테 르의 10 mL.</li>
		<li>35 x 10 m m2 조직 배양 접시의 뚜껑과 하단 부분에 당 밀 한 천 하 거 라. 참고: 하기 전에 당 밀 한 천 배지를 따르고, 반드시 뚜껑 / 35 x 10 m m2 접시의 기초 (단계 1.6에서 설명) 초파리 재고 병의 입에 snuggly 적합. 사용 하는 접시의 브랜드에 따라 기본 사용할 수 없습니다 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>증류수를 추가 하 여 붙여넣기 신선한 효 모에 활성 만들기 건조 효 모 (5 g 효 모/7 물) 혼합물까지 된다 (즉, 땅콩 버터의 일관성) 고체 표면에 쉽게 퍼질 수 있는 붙여넣기.</li>
	<li>당 밀 계란-누워 뚜껑의 표면에 누 룩 반죽의 약 1.5 g을 확산.</li>
	<li>6 온스 초파리 재고 병 22 G 바늘을 사용 하 여 플라스틱의 반대 측에 4 개의 공기 구멍을 찌른.</li>
	<li>문화 병으로 음식 유리병에서 새로 성관계 파리를 전송. 참고: 파리에서 전송 될 수 있습니다 임시 마 취 또는 병의 입에서 유리병의 상단을 급격히는 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 도청 하 여 CO2 를 사용 하 여.</li>
	<li>신속 하 게 초파리 재고 병의 입에 표면에 효 모 반죽과 당 밀 계란-누워 모자를 배치 합니다. 실험실 테이프를 사용 하 여 안전한 장소에 계란-누워 모자. 참고: 만약 파리 마 취 전에 전송 했다, 병 두어야 한다 가로 벤치탑에 모든 파리 회복 될 때까지. 파리는 완전히 모바일, 일단 당 밀 계란-누워 캡 아래쪽의 문화 인큐베이터에서 병을 놓습니다.</li>
	<li>처음 2 일 동안 하루에 적어도 한 번 반전 주식 병, 벤치탑에 대 한 병의 바닥을 두드리고, 오래 된 계란 모자를 제거 고 즉시 병의 입에 새로운 계란 모자를 배치 하 여 당 밀 계란-누워 모자를 교체 합니다. 오래 된 달걀에 누워 모자를 삭제 합니다. 참고:이 단계를 통해 여성 그들의 계란을 들고는 동기화 된 인구의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.</li>
	<li>새로운 달걀 누워 모자 주식 병으로 하루 3, 2 시간 후 교체 후 놓고 삭제 합니다. 제거 하 고 4 시간 후 두 번째 계란-누워 캡을 바꿉니다. 날짜, 시간, 및 유전자 형이 낳는 캡의 하단을 레이블을 지정 합니다. 참고: 알이 4 h 창 동안 수집 분석을 위해 사용 됩니다. 이 동기화 단계는 특정 발달 단계를 분석 하기 위한 중요 한. 계란은 몇 일 동안 이러한 방식으로 수집할 수 있습니다.</li>
	<li>원하는 온도 습도에 인큐베이터에 장소와 60 x 15 m m2 페 트리 접시에 계란-누워 모자를 삽입 합니다.</li>
	<li>계란-누워 모자 기아, 인구 밀도 또는 오염 문제에 대 한 매일 검사 합니다. 참고: 애벌레 지속적인 개발을 보장 하기 위해 적절 한 음식에 액세스할 수 있어야 합니다. 필요한 경우, 신선한 효 모 반죽 실험에 사용 될 모든 계란-누워 모자에 퍼질 수 있다. 또한, 애벌레 인구 밀도가 너무 높은 경우에, 애벌레 문화 판에서 방황 시작 됩니다. 이러한 샘플 때문에 높은 인구 밀도 및 기아 방황 하는 동안 경험의 중간 관찰 됩니다 일치 하지 않는 데이터 metabolomic 분석에 사용할 수 없습니다. ~ 80-100의 밀도 중간 두 번째 탈피 애벌레 (L2) 또는 40-50 접시 당 중간 세 번째 탈피 애벌레 (L3) 접시 당 것이 좋습니다. 가시 세균 이나 곰 팡이로 오염 된 샘플을 폐기 해야한다.</li>
</ol>2. 애벌레 샘플 컬렉션
<ol><li>원하는 단계까지 애벌레 나이. L3 유 충 수집, L2-L3 탈피에서 샘플을 다시 동기화. 재 동기화 발달 이정표15앞쪽 spiracles를 사용 하 여 앞에서 설명한 방법을 사용 하 여 일반적으로 이루어집니다. 또는, 중반 L3 애벌레 sgs3 기자 진16를 사용 하 여 동기화 수 있습니다. 참고: 이와 관련, 우리 찾을 중반 L2 애벌레 (달걀 누워 후 ~ 60 h)는이 단계에서 애벌레의 개발은 여전히 상대적으로 동기 때문에 대부분의 분석에 이상적, 신중 하 게 수집한 샘플 개발이 timepoint에 적절 한 음식 그리고 샘플 당 동물의 수는 관리 (아래 참조). 추가 동기화 단계는 L3 애벌레 L3 개발 하는 동안 발생 하는 수많은 ecdysone 펄스 신진 대사에 대 한 극적인 효력이 때문에 동기화 되지 않은 인구에 있는 아티팩트를 생성 합니다.</li>
	<li>부드럽게 리프트는 agar에서 효 모 반죽을 해 바늘을 사용 합니다. 새로운 당 밀 한 천 모자에 누 룩을 놓습니다. 참고: 대부분 애벌레 당 밀 한 천 및 효 모 반죽 사이의 인터페이스에서 먹을 것 이다.</li>
	<li>당 밀 agar의 새로 노출 된 표면에서 애벌레를 수집 하는 작은 붓을 사용 합니다. 얼음에 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 애벌레를 놓습니다. 참고: 각 발달 단계에 대 한 적절 한 샘플 크기는 다음과 같습니다: 50 먼저 탈피 하는 애벌레 (L1); 25 중반 L2 애벌레; 20 초 L3 유 충; 15 L3 중반 또는 후반 L3 유 충입니다.</li>
	<li>세척 하 고 큰 샘플 세트를 수집 하는 동안에 작은 배치 (4 ~ 6 샘플) 샘플 (2.8 통해 2.3 단계)를 고정. 샘플 튜브에 있는 애벌레를 배치의 20 분 이내 동결 해야 합니다. 참고: 다른 튜브 3 단계에서 샘플 전송을 방해할 수 있기 때문에 Eppendorf 1.5 mL 플렉스 튜브를 사용 하 여 것이 좋습니다. 샘플은 microfuge 관에서 수집 해야 합니다. 3.1 단계에서 설명한 구슬 튜브에서 샘플을 수집 하지 않습니다. 세라믹 구슬 부정확 한 질량 측정 결과 및 오염 물질을 소개 하는 샘플에 NaCl의 세척 솔루션을 유지 합니다.</li>
	<li>추가 1 mL의 얼음 처럼 차가운 0.9 %NaCl, 튜브에 뚜껑을 닫고 세로로 대칭 이동 튜브를 철저 하 게 씻어 애벌레.</li>
	<li>튜브를 다시 얼음 ~ 30 위 s. 이 시간 동안, 애벌레는 튜브의 하단 싱크대 것 이다 하지만 효 모 현 탁 액에서 남아 있을 것 이다. 모든 애벌레 느슨한 펠 릿 형성, NaCl 솔루션 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거.</li>
	<li>최종 세척 솔루션 때까지 취소 또는 단계 2.4와 2.5 단계를 두 번, 반복. 참고: 추가 세척 단계는 누 룩의 과도 한 금액을 포함 하는 수집 된 샘플 하는 경우 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에 1 분 동안 2000 × g 에서 샘플을 원심</li>
	<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 모든 잔여 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>즉시 액체 질소에 샘플을 동결. 참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>3입니다. 비드 튜브 샘플의 전송
<ol><li>각 애벌레 샘플 1.4 m m 세라믹 구슬을 포함 하는 2 mL screwcap 튜브 1.5 mL microfuge 관에서 전송 되어야 합니다. 이 전송 단계에 대 한 준비, 2 mL screwcap 구슬 튜브 (뚜껑에 표시는 4.4 단계 파괴 될 것 이다)의 측면을 에탄올 증거 마커를 사용 합니다.</li>
	<li>0.01 mg를 정확 하 게 측정 분석 균형을 사용 하 여 레이블이 지정 된 비드 튜브의 대량 포장</li>
	<li>애벌레 샘플-80 ° C에 저장, 전송 액체 질소 사전에 샘플 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>긴 집게를 사용 하 여 액체 질소에서 1.5 mL 샘플 튜브를 제거 dewar.</li>
	<li>입고 니트 릴 장갑, 잡아는 냉동 튜브, 반전, 그리고 예리하게 언된 펠 릿을 꺼내 려 벤치탑에 대 한 튜브 뚜껑을 파운드. 즉시 미리 tared 2 mL screwcap 구슬 튜브에 펠 릿을 부 어. 펠 릿을 꺼내 려 실패, 액체 질소에 튜브를 반환 하 고 반복 합니다. 참고: 애벌레 펠 릿은 모든 microfuge 관에서 분리 하지 하십시오. 권장 다른 튜브를 사용 하 여, 애벌레 알 약 샘플 분석에 대 한 수집 전에 dislodged 수 있습니다 경우 결정 합니다.</li>
	<li>빠르게 애벌레 펠 릿과 구슬 튜브의 결합 된 질량을 측정 합니다. 바로 액체 질소로 샘플 튜브를 놓습니다. 애벌레 펠 릿 질량 metabolomic 데이터를 정규화 하는 데 사용 됩니다. 참고: 프로토콜은이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다. 샘플-80 ° c.에 3 달까지 동안 저장 될 수 있다</li>
</ol>4. 샘플 추출
<ol><li>쿨러는-20 ° C 벤치탑에서 샘플 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>각 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL를 추가 합니다. 쿨러-20 ° C 벤치탑에 샘플을 반환 합니다. 참고: 호박-d4 산 내부 표준으로 제공합니다. 만 HPLC 급료 H2O와 메탄올을 사용 합니다. 때문에 메탄올 및 다른 유기 용 매 휘발성과 공기 변위 펫을 사용 하 여 정확 하 게 측정 하기 어려운,이 단계와 다음 단계를 모두에 대 한 긍정적인 변위 펫을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>빈 구슬 튜브에 2 µ g/mL 호박-d4 산을 포함 하는 prechilled (-20 ° C) 90% 메탄올의 0.8 mL을 추가 하 여 부정적인 제어를 설정 합니다.</li>
	<li>6.45 m/s 4 ° C 온도 제어 실에 있는 비드 밀 균질 화기를 사용 하 여 30 초 동안 샘플을 균질. 참고: 실패를 신속 하 고 완전 하 게 균질 애벌레 펠 릿 대사체학 분석에 가변성의 일반적인 소스입니다. 만 30 애벌레 조직을 동결를 파괴 수 있는 균질을 사용 하 여 s.</li>
	<li>쿨러-20 ° C 벤치탑에 무 균된 샘플 튜브를 반환 하 고 적어도 1 시간을 위한-20 ° C 냉동 실에 그들을 품 어.</li>
	<li>결과 침전 제거 하 4 ° C에서 5 분에 대 한 20000 × g 또는 최대 속도에서 튜브를 원심.</li>
	<li>새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한의 600 µ L를 전송 합니다. 침전을 방해 하지 마십시오. 촉진 펠 릿 되는 상쾌한 pipetting 동안 빠질 경우 모든 상쾌한 튜브를 반환 하 고 단계 4.6을 반복 합니다.</li>
	<li>진공 원심 분리기에 샘플 튜브를 놓습니다. 원심 분리기를 밀봉 하기 전에 모든 튜브는 열려 있어야 합니다. 모든 용 매 제거 될 때까지 실 온에서 샘플을 건조 (이 단계는 일반적으로 완료 ~ 16 시간 걸립니다). 참고: 필요한 경우 프로토콜 수 수 일시 중지이 단계에서. 말린된 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
</ol>5. 화학 Derivatization
<ol><li>말린된 샘플-80 ° C에서 저장, 개봉된 샘플 튜브 진공 원심 분리기에 놓고 30 분 동안 건조 합니다. 샘플 튜브를 열기 전에이 단계를 수행 해야 합니다. 참고:이 단계는 응축을 냉장고에서 제거 하는 때 microfuge 관의 외부에 제거 됩니다. 프로토콜의이 부분은 매우 민감한 H2O 하 고 여분의 주의 모든 시 약을 가능한 건조 유지 하 이동 해야 합니다.</li>
	<li>
무수 피리 딘에서 40 mg/mL methoxylamine 염 (MOX)의 솔루션을 준비 합니다. 무수 피리 딘을 사용 합니다. MOX 그리고 pyridine는 desiccator에 저장 하 고 매일 MOX 솔루션을 준비. 주의: MOX, pyridine 독성이 있다. 증기 두건에서이 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>열 총을 사용 하 여 1 mL 유리 주사기를 건조.</li>
		<li>무수 피리 딘 병에 주사기의 바늘을 삽입 합니다. 피리 딘 1 mL을 제거 하 고 포함 된 MOX의 40 mg microfuge 관에 추가.</li>
		<li>무수 피리 딘 아르곤과의 병을 플러시. 병을 밀봉 하 고는 desiccator 돌아갑니다.</li>
		<li>잠복기 600 rpm에서 10 분 동안 35 ° C에서 열 믹서에 관 하 여는 pyridine에 MOX를 분해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>무수 피리 딘 솔루션에 말린된 샘플 40 mg/mL MOX의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 s 그리고 짧게 원심 분리기에 대 한 소용돌이 (10000 x g 20에 대 한 s).</li>
	<li>열 믹서에 600 rpm에서 1 h 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>20000 × g 또는 입자 물질을 제거 하 5 분에 대 한 최대 속도 원심.</li>
	<li>250 µ L 비활성화 유리 microvolume 삽입 autosampler 유리병에 상쾌한의 25 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>40 µ L N-메 틸-N-trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) 포함 하는 1%의 추가 TMCS. 주의: MSTFA은 독성이 있습니다. 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다. 참고: 지금까지 사용 가능한 경우에이 단계는 Gerstel autosampler에 의해 완료할 수 있습니다.</li>
	<li>Autosampler 유리병에 모자를 놓고 뇌관 집게 도구를 사용 하 여 밀봉 합니다.</li>
	<li>진동 (250rpm)와 함께 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>이전 desceribed3지방산 메 틸 에스테 르 표준 (FAMES) 솔루션을 준비 합니다. 사용 하 여 주입 직전 로봇 autosampler autosampler 유리병에 FAMES의 3 µ L를 추가 합니다. 참고: FAMEs는 보존 시간 이동 보정 및 악기 성능 확인 하는 데 사용 됩니다. 사용할 수 없는 로봇 autosampler 이면 FAMEs 5.8 단계 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>6. GC-MS 검색
참고: 대부분의 경우에서 사용자 질량 분광학 핵심 시설의 도움으로이 단계를 수행 합니다. 이 프로토콜은 30 m, 5 m 가드 열 GC 열 함께 사용 하도록 설계 되었습니다.
<ol><li>무작위 샘플 주문.</li>
	<li>
GC-MS를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 mL/min를 헬륨 캐리어 가스 유량 설정 합니다.</li>
		<li>입구 온도 250 ° c.를 설정</li>
		<li>프로그램 실행 다음 온도 기울기에 GC:<ol>
<li>1 분의 보류와 95 ° C를 초기 온도.</li>
			<li>2 분의 보류와 40 ° C/min의 속도로 110 ° C에 온도 증가.</li>
			<li>250 ° C에 5 ° C/min 램프에 의해 증가.</li>
			<li>4 분의 마지막 보류와 25 ° C/min의 속도로 330 ° c 증가.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3.5 분 용 지연을 설정 합니다. 참고: 시간 GC-MS 시스템에 따라 변경할 수 있습니다. 이 단계의 목적은 손상 된 검출기에서 MSTFA 및 MOX를 방지 하기 위해입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(10: 1의 비율로 분할) GC-MS에 derivatized 샘플의 1 µ L를 삽입할. 참고: 봉우리의 강도 너무 낮은 경우 샘플의 2 µ L를 주사. 샘플의 주입 순서를 무작위로 한다.</li>
	<li>50-500 m의 대량 범위 전체 스캔 모드에서 질량 분석기를 작동/z.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>대상 또는 타겟이 불분명 한 방법 중 하나를 사용 하 여 metabolomic 데이터를 분석 합니다. 타겟된 분석 측정 하는 대사 산물, 우리는 아래 설명 하는 젖 산 측정 등의 정의 된 집합의 풍부에 집중 된다. 반면, 타겟이 불분명 한 분석 크게 두 샘플 세트 사이 변경 모든 신진 대사 기능을 식별 하는 공평한 접근을 사용 합니다. 참고: 연구소 주로 사용 하 여 무료 프로그램 MetAlign17 와 MetaboAnalyst18,19 데이터 분석에 대 한. 품질 관리, 표준화, 및 데이터 처리 단계에 대 한 적절 한 설명이이 원고의 범위 때문에, 우리는 참조 하십시오 사용자 데이터 처리20,21에 헌신 하는 더 상세한 프로토콜 22. 또한,이 분석에 필요한 단계를 설명 하는 순서도 찾을 수 있습니다 다른 곳에서8.</li>
</ol>

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<li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li>
<li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+%28pre-%29processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+inference+of+biological+patterns%2C+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li>
<li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

대사체학 중간 대사를 구성 하는 대사 반응을 조사 하는 최상의 기회를 제공 한다. 그러나이 기술의 감도 데이터 유전 배경, 발달 단서와 다양 한 환경 스트레스, 온도, 습도, 인구 밀도, 그리고 양분 가용성을 포함 하 여 렌더링 합니다. 따라서, 높은 품질과 재현성 대사체학 분석이 매우 제어 조건 하에서 샘플을 수집 하는 것. 여러 리뷰가 포인트3,,8...

과일 파리 초파리 melanogaster 중간 신진 대사를 조절 하는 분자 메커니즘을 공부 하는 이상적인 시스템으로 떠오르고 있다. 대부분 대사 경로 보존 초파리 와 인간 사이 뿐만 아니라 주요 영양소 센서 및 성장 레 귤 레이 터, 인슐린, 토르, myc, 등 비행1,2활성도 있습니다. 그 결과, 초파리 는 당뇨병과 비만에서 neurodegeneration, 암에 이르기까지 인간의 질병의 변화 기초를 탐구 하 사용할 수 있습니다. 이와 관련, 초파리 애벌레 개발 호 기성 분해, 또는 바르 부르 크 효과로 알려진 신진 대사 프로그램을 공부 하는 이상적인 프레임 워크를 제공 합니다. 마찬가지로 많은 종양 호 기성 분해를 사용 하 여 탄수화물에서 바이오 매스를 생성, 그래서 할 초파리 애벌레 활성화 촉진 발달 성장3,,45호 기성 분해. 애벌레 사이의 이러한 유사성 및 종양 물질 대사 이해 어떻게 에어로빅에 대 한 주요 모델 초파리 를 설치 분해는 레 귤 레이트 된 vivo에서.
즉석 대사 공부에 대 한 인기 모델로 떠오르고 있다 사실에도 불구 하 고 대부분 초파리 연구는 개별 대사 산물3, 트 레 할 로스, 트리 글리세라이드, ATP 등을 측정 하도록 설계 된 방법에 의존. 특정 프로토콜 각 대사 산물을 측정 하는 데 필요한, 이후 분석 결과 기초를 둔 학문은 노동 집약, 비싸고, 그 화합물 상업 키트를 사용 하 여 측정할 수 있는 쪽으로 편 파. 이러한 제한 사항에 대 한 해결책의 대사체학, 초파리 대사 공부 보다 효율적이 고 공평한 방법을 제공 분야에서 나왔다. 분석 결과 기반 연구와 달리 단일 metabolomic 분석 수 있습니다 동시에 작은 분자 대사 산물의 수백을 측정 하 고 유기 체의 대사 상태6,7에 대 한 포괄적인 이해를 제공. 이 기술은 크게 초파리 대사 연구의 범위를 확장 했다 그리고이 신흥 분야8의 미래를 나타냅니다.
Metabolomic 연구는 주로 세 가지 기술을 사용 하 여 실시: (i) 핵 자기 공명 (NMR), (ii) 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS LC), 및 (iii) 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)9. 각 접근 제공 뚜렷한 장점과 단점, 그리고 이러한 모든 기술은 성공적으로 초파리 대사 공부 하 사용 되었습니다. 때문에 실험실에서 실시 하는 연구, 극 지 대사 산물에 초점을 맞추고, 우리가 주로 GC-MS 기반 메서드를 사용 합니다. GC-MS 장점, 높은 재현성, 최대 해상도, 감도, 등의 번호와 사용자를 제공 하 고의 급속 한 식별 수 있는 표준 전자 영향 (EI) 스펙트럼 라이브러리의 가용성 변화 발견 기능10,11. 그러나 GC-ms, 샘플의 준비, 다소 복잡 하 고 세부 사항에 주의 요구 한다. 샘플 수집, 세척, 몸 무게, 고 대사 반응을 신속 하 게 냉각 하는 방식으로 냉동 있습니다. 또한, 비행 시체는 표준 균질 프로토콜에 저항 하며 최적의 대사 산물 추출 되도록 비드 밀. 마지막으로, GC-MS 분석 샘플 탐지12이전 화학 derivatization를 겪어야 한다. 이전에 게시 방법이 단계3,,1314의 모든 설명, 동안 reproducibly 고품질 데이터를 생성 하는 초보자 사용자 있도록 시각적 프로토콜 여전히 필요 합니다. 여기 GC-MS 기반 대사체학 분석 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜 reproducibly 측정 하는 중앙 탄소 물질 대사를 구성 하는 작은 극 지 대사 산물의 많은 사용자를 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

Metabolomics의 분야의 최근 발전 동물 물질 대사 공부에 대 한 강력한 유전자 모델 초파리 melanogaster 과일 파리를 설립 했다. 결합 하 여 초파리 유전자 도구의 광대 한 배열을 조사 중간 대사의 큰 swaths 하는 기능, 대사체학 접근 다이어트, 유전자 형, 생활 역사 사건과 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 밝힐 수 있다. 또한, 대사체학 연구 소설 효소 기계 장치를 발견 하 고 겉보기에 서로 다른 대사 경로 사이 이전에 알려지지 않은 연결을 밝히기 수 있습니다. 초파리 지역 사회 중이 기술을 더 광범위 한 사용을 촉진 하기 위하여 여기 우리 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)에 대 한 초파리 애벌레 샘플을 준비 하는 방법을 설명 하는 상세한 프로토콜 제공- metabolomic 분석을 기반 으로합니다. 우리의 프로토콜 애벌레 샘플 수집, 대사 산물 추출, 화학 derivatization 및 GC-MS 분석에 대 한 설명을 포함합니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 분해와 TCA 주기에서 아미노산, 당 분, 유기 산 관련된을 포함 하 여 작은 극 지 대사 산물의 관계 되는 풍부를 측정 하는 사용자 수 있게 됩니다.

젖 산 효소 dLDH 활동4, 그리고 유전자 일치 컨트롤 부족 (dLDH) 뮤턴트 중순 L2 애벌레로 수집 되었고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리. 컨트롤과 비교 될 때 돌연변이 애벌레 젖 산, pyruvate, 및 L-2-hydroxyglutarate4에 상당한 변화를 전시 한다. 스펙트럼은 애질런트 GC6890 5973i MS 시스템으로 인수 했다. GC-MS 스펙트럼의 예로 생성 우리의...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.

가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K 조회수.  Indiana University. 이 프로토콜 GC-MS 기반 metabolomic 분석 초파리 애벌레를 준비 하는 방법을 설명 합니다.

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Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조<em&gt; 초파리</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

연구

발생학

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

유전학

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

<meta charset="utf8"></head><body>질량분석법(Mass Spectrometry)을 이용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

질량분석법(Mass Spectrometry)을 이용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

생화학

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

신경과학

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화<em&gt; Drosophila</em&gt; 헤드

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

생물학

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

FRET 센서를 사용한 초파리 의 뇌 대사체 수송 모니터링

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

저자 스포트라이트: 초파리 모델을 사용한 뇌 에너지 대사 연구의 발전

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS) 초파리 애벌레 샘플의 준비-대사체학을 기반으로

요약

더 많은 비디오 탐색

대사 분석을위한 미토콘드리아 농축 분획의 제조

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

중간 규모의

질량분석법(Mass Spectrometry)을 이용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석

질량분석법(Mass Spectrometry)을 이용한 초파리 광수용체의 지질 신호 분석

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

성적 증명서와 Metabolites에서의 정화

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

유전적으로 인코딩된 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌에서 모노카르복실레이트 및 기타 관련 대사 산물 시각화

유전적으로 인코딩된 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌에서 모노카르복실레이트 및 기타 관련 대사 산물 시각화