플레이트 리더에 대 한 자체 서 면된 스크립트에서 그의 지원을 위한 Wladislaw 마이어 (BMG Labtech GmbH) 감사 하겠습니다. 이 작품은 오스트리아에 의해 지원 되었다 "Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung" (FWF) 오후 (P24189) 및 박사 학위 프로그램 "DK 분자 Enzymology" (W901) 오후.

1. 디자인, 준비 및 럭 스 오 페론 대장균 에서 표현
주:이 섹션에서 사용 되는 상용 키트에 대 한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
<ol><li>대장균 에 럭 스 오 페론을 전송에 대 한 적절 한 제한 사이트와 항생제 저항 유전자의 관심 (예: pET28a; 표준 애완 동물 벡터 선택 NcoI, XhoI, 대)입니다.</li>
	<li>조각을 디자인 하 고 뇌관 깁슨 어셈블리 Photobacterium mandapamensis 27561의 DNA 순서에 따라 중복 (은행: DQ988878.2).</li>
	<li>서식 파일로 설계 된 프라이 머와 Photobacterium mandapamensis 27561의 고립 된 게놈 DNA 표준 PCR 반응 설정 (뇌관 및 조건에 대 한 보충 자료 를 참조). 참고: 격리 각각 세균성 긴장의 genomic DNA의 PCR 효능을 향상 시킵니다.</li>
	<li>스핀-열 정화를 통해 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>45 분 동안 37 ° C에서 NcoI 및 XhoI 격리 된 pET28a 벡터의 제한 소화를 수행 합니다.</li>
	<li>선형화 벡터를 정화 하 고 PCR 파편 통해 agarose 젤 전기 및 후속 스핀-열 정화.</li>
	<li>각 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 확인 하 고 프로토콜20,21에 따라 어셈블리에 대 한 최적의 수량을 계산. 참고: 어셈블리의 효능 그리고 조각 크기와 수에 따라 제조 업체의 프로토콜20,21에 따라 조정 될 수 있다.</li>
	<li>모든 조각을 PCR 튜브에 버퍼를 결합 후 어셈블리 혼합물이 1 시간에 50 ° C에서 PCR 기계에 품 어.</li>
	<li>적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 조립된 벡터 제품 변환 시스템 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1).</li>
	<li>변형 판과 DNA 격리에 대 한 새로운 접시에 행진에서 식민지를 선택 하십시오.</li>
	<li>표준 프로토콜에 따라 플라스 미드 DNA를 분리.</li>
	<li>모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 먼저 모든 조립된 조각에 대 한 뇌관 특정 사용 하 여 표준 프로토콜에 따라 식민지 PCR를 수행 합니다.</li>
	<li>또한 식민지 PCR 및 후속 agarose 젤 전기 이동 법, 올바른 어셈블리와 올바른 DNA 시퀀스를 확인 하려면 DNA 시퀀싱에 대 한 모든 격리 된 어셈블리 벡터를 준비 합니다.</li>
	<li>적절 한 대장균 으로 대장균 세균성 플라스 미드 전이 대 한 표준 변환 프로토콜에 따라 확인 된 플라스 미드를 변환 고수익 단백질 생산 (e.g.,E 대장균 BL21) 시스템. 참고: 직접 식 프로토콜 아래 계속. 더 이상 스토리지, 글리세롤 재고 준비 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 수정 된 E. 콜라이 긴장의 표현
<ol><li>LB 매체의 적절 한 볼륨의 접종에 의해 하룻밤 문화 (ONC) 식에 대 한 준비 (예를 들어, 100 mL) 조립된 플라스 미드 또는에서 직접 변형 대장균 BL21 셀의 이전 준비 글리세롤 재고는 변환 플레이트입니다. 대 (50 mg/mL, pET28a의 항생제 저항 유전자)의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.</li>
	<li>주요 식 문화는 ONC의 8 mL를 (예를 들어, 파운드 매체의 800 mL) inoculate 고 대 (50 mg/mL)의 800 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>셀 밀도의 0.6-600 세 도달할 때까지 37 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 주요 문화를 품 어 0.8 (약 2.5 h).</li>
	<li>부 화 온도를 28 ° c.를 감소 시키십시오</li>
	<li>0.1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 단백질 발현을 유도. 참고: 경험적 테스트 28 ° C를 온도 감소 높은 가벼운 강렬 했다 보였다.</li>
	<li>그들은 (약 1 시간)을 빛나는 시작 될 때까지 세포를 관찰 합니다. 참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 (최대 48 h) 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 발광 세균 긴장의 표현
참고: 세균성 발광 긴장 성장과 빛 생산에 대 한 특정 성장 매체/인공 바다 물 매체를 필요합니다.
<ol><li>인공 바다 물 매체, 구성된 두 별도로 준비 중간 구성 요소를 준비 합니다. 참고: 인공 바다 물 매체의 준비는 원래 프로토콜22에서 적응 시켰다. 다음 금액은 1 L 액체 매체 또는 1 L 한 천 매체.<ol>
<li>인공 바다 물 매체에 대 한 다음 소금에 무게: 28.13 g NaCl, 0.77 g KCl, 1.60 g CaCl2 · 2 H2O, 4.80 g MgCl2 · 6 H2O, 0.11 g NaHCO3및 3.50 g MgSO4 · 7 H2o.</li>
		<li>증류수 1 L을 추가 하 고 모든 구성 요소를 분해.</li>
		<li>다음과 같은 재료에 무게 파운드 매체에 대 한: 10 g 효 모 추출 물, 10 g 펩, 그리고 한 천 배지, 추가 20 g 한 천.</li>
		<li>수돗물의 250 mL을 추가 하 고 구성 요소를 분해 합니다.</li>
		<li>두 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 별도로 미디어를 준비.</li>
		<li>한 천 배지, 압력가 마로 소독 후 직접 인공 바다 물 매체의 750 mL 250 mL 파운드 매체의 결합 및 접시를 준비.</li>
		<li>압력가 마로 소독 후 직접 또는 냉각 하는 때 액체 매체에 대 한 인공 바다 물 매체의 750 mL와 파운드 매체의 250 mL를 결합 합니다. 참고: 인공 바다 물 매체 혼 탁 한 소금 강 수를 통해 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인공 바다 물 매체 한 천 배지에서 세균성 발광 긴장을 행진 하 고 24-30 ° c.에서 밤새 품 어 참고: 오랜 시간 저장 세균성 긴장의 세균성 문화의 글리세롤 주식 동결을 통해 정상적으로 이루어집니다. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다.</li>
	<li>접시에서 단일 식민지와 인공 바다 물 매체를 100 mL를 접종 하 여는 ONC를 준비 합니다. 24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 ONC 밤새 품 어.</li>
	<li>ONC의 8 mL와 인공 바다 물 매체의 800 mL 접종</li>
	<li>24-30 ° C와 인큐베이터 셰이 커에 120 rpm에서 세균성 세포를 품 어. 참고: 발광 박테리아의 빛의 강도 프로필 온도와 강하게 변화 한다. 각 세균성 긴장의 빛 생산의 규제 메커니즘에 따라 발광 후 약 1-6 h 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>그들은 (대략 1-6 h) 빛나는 시작 때까지 세균 세포 배양을 관찰 합니다. 참고: 식의 목적에 따라 셀 다음 날까지 재배 되 고 수확 후 또는 셀 수 있습니다 그들은 빛나는으로 흔들어 보관. 세포와 어떤 단백질의 정화를 수확 하는 것은 표준 절차에 따라 할 수 있습니다.</li>
</ol>4. Vivo에서 활동 분석 결과 세균 발광 긴장 및 변형된 대장균 변종에 대 한
참고: 긴장의 장시간 저장은 일반적으로 글리세롤 주식 세균성 문화의 동결을 통해 acieved. 긴장 한 천 배지 녹고 후 성장에서 지연 위상으로 인해 액체 문화에 대 한 사용 하기 전에 모든 변종에 대 한 균일 한 시작 조건을 보장 하기 위해서 처음에 줄무늬 항상 한다.
<ol><li>행진 원하는 발광 박테리아 스트레인 또는 수정 된 대장균 한 천 배지에서 변형 및 28 ° C에서 밤새 품 어. 참고: 외피 온도 스트레인 스트레인에서 변화할 수 있다 고 경험적으로 평가 될 수 있다. 발광 박테리아 긴장을 비교할 수 있게 되며 수정 된 대장균 변종, 성장 조건 동일 해야 합니다.</li>
	<li>한 천 배지에서 단일 식민지로 각각 스트레인와 매체의 3 mL를 접종 하 고 28 ° C에서 약 1-2 h의 인큐베이터 흔드는 180 rpm에서 세포를 품 어.</li>
	<li>1시 10분의 셀 밀도 측정 650에서 액체 문화 희석 nm. 비율과 0.05의 OD650 1 mL 문화에 대 한 볼륨을 계산 합니다. 참고: 이후 플레이트 리더 분석 결과 650에서 셀 밀도 결정할 것입니다 긴장의 빛 방출에 의해 간섭을 유발 하지 않도록 nm.</li>
	<li>문화와 매체의 계산된 볼륨 24 잘 블랙 벽 접시 유리 바닥에 플라스틱. 수정 된 대장균 에 대 한 변형, 대 (pET28a 벡터의 항생제 저항)의 1 µ L와 IPTG (유전자 발현의 유도)의 1 µ L 샘플을 추가. 뚜껑을 측정 하는 동안 증발을 피하기 위해 접시에 놓습니다. 참고: 전체 럭 스 오 페론을 포함 하는 pET28a 벡터 대장균 문화에 의해 손실 얻이 되지 않습니다 보장, 대에 추가 되어야 합니다 각 대장균 샘플 격판덮개 우물에 대장균 의 빛 생산을 보장 하기 셀 측정 될 수 있다, IPTG에 의해 유전자 발현을 유도 해야 합니다. 누화 및 측정 간섭을 피하기 위해, 유리 아래쪽와 투명 한 뚜껑 잘 플레이트 블랙 벽으로 최상의 결과 보였다. 그럼에도 불구 하 고, 크로스 토크는 관찰 될 수 있다 하 고 잘 위치를 신중 하 게 선택 해야.</li>
	<li>플레이트 리더에 측정을 시작 합니다. 참고: 플레이트 리더 프로토콜은 특별히 개발 된 스크립트 기반으로이 분석 결과 대 한 ( 보충 자료참조)을 결합 하 여 두 측정, 흡 광도, 생물 발광. 데이터 포인트는 측정와 28 ° c.의 일정 한 온도 사이 영구 떨고와 매일 10 분 수집</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widder, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+in+the+Ocean:+Origins+of+Biological+Chemical,+and+Ecological+Diversity.">Bioluminescence in the Ocean: Origins of Biological Chemical, and Ecological Diversity.</a> Science. 328 (5979), 704-708 (2010).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence,+Microbial.">Bioluminescence, Microbial.</a> Encycl Microbiol. , 45-61 (2009).</li><li>Ulitzur, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+tetradecanal+as+the+natural+aldehyde+in+bacterial+bioluminescence.">Evidence for tetradecanal as the natural aldehyde in bacterial bioluminescence.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 76 (1), 265-267 (1979).</li><li>Kurf&#252;rst, M., Ghisla, S., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+postulated+structure+of+the+primary+emitter+in+the+bacterial+luciferase+reaction.">Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81, 2990-2994 (1984).</li><li>Dunlap, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+and+genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence.</a> Biolumin Fundam Appl Biotechnol. 1, 37-64 (2014).</li><li>Meighen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Bioluminescence:+Organization,+regulation,+and+application+of+the+lux+genes.">Bacterial Bioluminescence: Organization, regulation, and application of the lux genes.</a> FASEB J. 7, 1016-1022 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+Photobacterium+leiognathi+non-fluorescent+flavoprotein+with+limited+sequence+identity+to+bacterial+luciferase.">Crystallization of Photobacterium leiognathi non-fluorescent flavoprotein with limited sequence identity to bacterial luciferase.</a> J Mol Biol. 224, 523-526 (1992).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G., O'Kane, D. J., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+flavoprotein+related+to+the+subunits+of+bacterial+luciferase.">Crystal structure of a flavoprotein related to the subunits of bacterial luciferase.</a> EMBO J. 12 (5), 1767-1774 (1993).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+structural+features+of+the+luxF+protein+and+the+subunits+of+bacterial+luciferase:+Evidence+for+a+(&#946;&#945;)8+fold+in+luciferase.">Common structural features of the luxF protein and the subunits of bacterial luciferase: Evidence for a (&#946;&#945;)8 fold in luciferase.</a> Protein Sci. 3, 1914-1926 (1994).</li><li>Moore, S. A., James, M. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+refinement+of+the+non-fluorescent+flavoprotein+from+Photobacterium+leiognathi+at+1.60+&#197;+resolution.">Structural refinement of the non-fluorescent flavoprotein from Photobacterium leiognathi at 1.60 &#197; resolution.</a> J Mol Biol. 249, 195-214 (1995).</li><li>Kita, A., Kasai, S., Miyata, M., Miki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+flavoprotein+FP390+from+a+luminescent+bacterium+Photobacterium+phosphoreum+refined+at+2.7+&#197;+resolution.">Structure of flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum refined at 2.7 &#197; resolution.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 52 (1), 77-86 (1996).</li><li>Bergner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biochemical+properties+of+LuxF+from+Photobacterium+leiognathi.">Structural and biochemical properties of LuxF from Photobacterium leiognathi.</a> Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1854 (10), 1466-1475 (2015).</li><li>Defoirdt, T., Boon, N., Sorgeloos, P., Verstraete, W., Bossier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+and+quorum+quenching+in+Vibrio+harveyi:+Lessons+learned+from+in+vivo+work.">Quorum sensing and quorum quenching in Vibrio harveyi: Lessons learned from in vivo work.</a> ISME J. 2 (1), 19-26 (2008).</li><li>Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+bacterial+bioluminescence.">Genetics of bacterial bioluminescence.</a> Annu Rev Genet. 28, 117-139 (1994).</li><li>Kelkar, M., De, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+based+in+vivo+screening+technologies.">Bioluminescence based in vivo screening technologies.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 592-600 (2012).</li><li>Waidmann, M. S., Bleichrodt, F. S., Laslo, T., Riedel, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+luciferase+reporters:+The+Swiss+army+knife+of+molecular+biology.">Bacterial luciferase reporters: The Swiss army knife of molecular biology.</a> Bioeng Bugs. 2 (1), 8-16 (2011).</li><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioluminescence living lights, lights for living. , (2013).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEB NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction. , (2015).</li><li>Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Microbiological Media, Third Edition. , (2004).</li></ol>

저자는 공개 없다.

P. mandapamensis 27561의 전체 럭 스 리브 오 페론 구성 하는 4 개의 파편을 포함 하는 식 플라스 미드의 건설 깁슨 복제를 통해 달성 되었다. 이 대장균 기반 럭 스 유전자 발현에 빛을 방출 하는 대장균 세포 수 있습니다. 쿼럼 규정과 표준이 성장 조건 감지 피하이 시스템의 상당한 장점이 있습니다.
깁슨 복제 전략을 사용 하 여의 장점은 여러 선형 DNA 파편, 높은 유연성 및 특정 제한 사이트18,19,20에 대 한 필요의 쉬운 조립입니다. 이 메서드는 쉽게는 럭 스 오 페론, 단일 유전자 또는 유전자 클러스터를 제외 하 고 또는 새로운 유전자를 소개 또는 또 다른 한 긴장에서 유전자 교환를 변경할 수 있습니다. 이 방법의 응용 프로그램에 대 한 전제 조건 각각 럭 스 오 페론 유전자 시퀀스의 가용성 이다. 발광 박테리아의 작은 수에 대해서만 각각 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서 알려진 사용할 수 있습니다. 이 시퀀스의 많은 샷건 시퀀싱을 사용 하 여 생성 된 때문에 조각화 됩니다. 27561 조사 P. mandapamensis 의 경우 럭 스 오 페론의 완전 한 DNA 순서는 알려진 NCBI 유전자 데이터베이스 (은행: DQ988878.2).
깁슨 어셈블리의 프로토콜에서 하나의 중요 한 단계는 단일 조각의 DNA 농도의 계산 이다. 0.2-사용을 권장 했다 제조업체의 어셈블리 프로토콜에서 0.5 pmols 및 4-6 조각20,2120 µ L의 총 볼륨. 우리의 경우, 어디 luxCDABFEG ribEBH 는 4 조각으로 이루어져, 농도 및 총 볼륨 되었고 0.1 pmol 45 µ L, 각각, PCR 제품의 수익률에 따라. 한편으로, 농도 감소 하 고 다른 한편으로, 볼륨 증가 했다. 그럼에도 불구 하 고, 어셈블리 유효 하 게 매우 작용 하 고 DNA 시퀀싱 확인 첫 번째 시도에서 올바른 삽입. 이 찾기 쉽게 수정된18,,1920수 우리의 조사에 대 한 강력 하 고 적절 한 방법으로 깁슨 어셈블리 확인.
새로 설립된 된 플레이트 리더 분석 결과 메서드를 취급 하 게 쉬운 이다. 그것은 새로운의 간단한 기본 분석 가능 (유엔-) 알려진 또는 발광 세균 긴장과 제공 이미 빛 생산 (예를 들어, 낮은 세포 밀도에 발광에 지연)의 규제 메커니즘에 첫 번째 힌트. 또한, 함께 빛 생산 성장 조건 단순히 성장 매체 또는 온도 변경 하 여 쉽게 평가할 수 있습니다.
플레이트 리더 측정 28 ° c.에 수행 되었다 이 특이 한 설정에 대 한 이유는 30 ° C 이상의 온도 또는 심지어 전혀 성장 및 발광 리드 발광 세균성 긴장의 온도 감도 이다. Note, 플레이트 리더는 활성 냉각 시스템 누락의 제한 시간 동안 정의 된 온도 유지 수 있습니다. 따라서, 온도 측정 온도 수 있다.
개념의 증거로 서 발광 긴장 대장균 구문의 비교 P. mandapamensis (그림 5) 한 손으로 및 참조 측정 (그림 4)에 다른 한편으로 수행 및 확인 이 새로 설립된 된 시스템의 신뢰성입니다. 또한, 장기 측정 빛 방출 (그림 6)의 장 수를 보장합니다. 하지만 한 OD 값이 어디 적절 한 희석에 측정을 위해 필요한 것 사용 되는 측정 장치 (현재의 경우에서 약 15 h)의 특성에 따라 특정 광학 밀도, 위의 신뢰할 수 있는 고려 하는 검출기의 선형 범위입니다. OD 값에서이 높은 분산 확인이 오랜 시간 측정 신뢰할 수 없습니다. 따라서, 10 h 같은 짧은 측정은 여기 보고 실험 설정을 사용 하 여 것이 좋습니다.
설립된 플레이트 리더 분석 결과의 한계는 그림 7에서 볼 수 있습니다. 어려움은 측정의 적절 한 설정을 찾는 것입니다. '' 값 이득 사진 승수 관 (PMT)의 감도 조정합니다. 이득은 높은 이득 률은 신호 증가 의미 PMT에 신호 증폭 이다. 이득이 너무 낮게 설정 되어, 신호 대 잡음 비 증가 및 "낮은" 빛나는 발광 박테리아의 빛 강도 수 없습니다 하는 경우 어떤 더 많은 (표시 되지 않음 데이터 0에 가까운 신호)를 측정. 발광 분석 결과에 도전은 모든 세균성 긴장에 대 한 측정 결과 악기의 범위 내에서 머물 그래서 이득을 설정 하는 것 이다. 또한, 발광의 측정 범위는 측정 간격 시간에 따라 달라 집니다 (예를 들어, 2000000 1의 최대 s).
이득 2800, 경험적으로 테스트 하 고 특정 플레이트 리더가이 방법의 설립에 사용에 대 한 선택 이었다는 설정 했다. 사용된 이득 설정 허용 최대 방출된 빛의 녹화는 발광 하 여 대장균 시스템, P. mandapamensis 27561, P. mandapamensis s 1는 오버플로 없이 하지만 긴장 P. mandapamensis TH1 및 에 대 한 Harveyi V. 14126 이득 너무 높았다. 따라서, 이러한 후자의 변종 검출 한계를 초과 하 고 진짜 최대한 빛의 강도 측정할 수 없습니다. 이 기술적 제한 성장 조건 및 셀 밀도 비교할 수도 있지만 최대 발광에 높은 변화를 표시 하는 발광 박테리아의 비교를 방지 수 있습니다.
사용된 잘 플레이트 내에서 분석 된 세균성 긴장의 위치 경험적으로 평가 될 수 있다. 유리 바닥으로 검은 잘 접시 사용 되었다, 비록 샘플 사이 누화 관찰 되었다. 특정 긴장의 빛의 강도 너무 높은, 모든 이웃 웰 스 (예: 공백) 잘못 된 긍정적인 빛 배출량 표시 됩니다. 따라서, 그것은 개별적으로 또는 서로 특정 공간 분리와 함께 두 개의 다른 긴장을 측정 하는 것이 중요입니다.
많은 대장균 변종 럭 스 오 페론의 부분을 포함 하는 알려진 수정 되며 주로 응용 프로그램 지향15,,1617이미 있다. 여기에 설명 된 방법을 기초 연구, 예를 들어 각 럭 스 유전자를 별도로 분석의 가능성을 목표로 합니다. 생물 발광의 연구는 오랜 역사를가지고, 있지만 여전히 많은 관련 질문 있습니다. 제외 또는 럭 스 오 페론에서 유전자를 도입, 교환 다른 긴장에서 유전자 luxAB 유전자 또는 단백질을 분석 하 여 단지, 대장균 시스템 및 판의 추가 응용 프로그램을 처리 하기 쉬운에 포함 독자 분석 결과, 규제 프로세스 및 럭 스 유전자의 기능에 더 많은 정보를 얻을 수 수 있습니다.

살아있는 유기 체 (생물 발광)에 의해 빛의 방출은 박테리아, 곰 팡이, 곤충, 선 충, 생선, 그리고 오징어1에 매혹적인 과정입니다. 발광 빛 방출 chemiluminescent 반응 있는 화학 에너지는 (부분적으로) 변모 빛 에너지 ("차가운 빛")에서 나온다. 발광 박테리아 heterodimeric 효소 luciferase catalyzes 긴 사슬의 지방 족 알데하이드, 490 nm2, 에서 최대 발광 함께 해당 산 tetradecanal 등 monooxygenation 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2.jpg"> 그림 1 : 세균 luciferase의 일반적인 반응 계획. (LuxAB) 세균성 luciferase catalyzes 긴 체인의 monooxygenation 알데하이드 (채널3(채널2)n조) 이용 하 여 플 라빈 mononucleotide (FMNH2)과 분자 산소 (O2), 저조한 제품 감소 오래 산 (채널3(채널2)nCOOH), 플 라빈 mononucleotide (FMN), 물 (H2O), 그리고 가운데 490에 빛의 방출 체인 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
이 산화 동안 풀어 놓인 에너지는 상태 발광 소4역할 FMN-4a-수산화 발생 합니다. 세균 생물 발광, 즉 LuxCDABEG, 에 관련 된 단백질은 럭 스 오 페론에 의해 인코딩되고 매우 다양 한 세균성 긴장2,5이상의 보존. 유전자 거 와 luxB 는 heterodimeric luciferase;에 대 한 인코딩 luxC의 luxD의및 luxE의 유전자 제품은 복잡 한; 지방산 reductase의 구성 요소 그리고 luxG 플 라빈 reductase6인코딩합니다. 다양 한 발광 Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) 추가 luxF 유전자를가지고. LuxF는 특이 한 플 라빈 파생 6-(3'-(R)-myristyl homodimeric 단백질은 보고 되었다)-FMN (myrFMN)7,,89,10,11 ,12. 추가적인 유전자 확인 된 리 보 플 라빈 합성 (예: ribEBH)에 대 한 책임은 또한 규제 유전자 보고 되었습니다, 그 생물 발광, 특히 비 브리 오에 대 한 쿼럼 감지 규칙에 있는 역 fischeri 브리 harveyi6,13. 높은 보존된 유전자 순서에도 불구 하 고 발광 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광2,5,14의 규정 특성에 높은 변화를 표시 .
몇 가지 수정 긴장 또는 부분을 포함 하는 플라스 미드 또는 전체 럭 스 operons 알려져 있습니다 기자 시스템 생물 발광을 이용. 발기인 활동을 결정 하는 등 다양 한 응용 프로그램 환경 또는 식품 샘플, 생물 발광 공명 에너지 전송 (브 레트), 세균 오염 모니터링 vivo에서 화상 진 찰 진 핵 유기 체에서 감염의 pyrosequencing, 고 등 설립된15,,1617를 했다. 흥미롭게도, 3 가장 자주 사용 되는 시스템은 북미 반딧불 (Photinus pyralis), 선 충 (Photorhabdus luminescens)의 장 병원 체 그리고 바다 팬 지 (Renilla에서 파생 된 발광 기자 reniformis). 그 시스템의 세균성 근원 하지만 럭 스 유전자와 operons 세균성 근원에서를 사용 하 여 응용된 연구16에 대 한 더 많은 관심을 얻고 있다. 세균성 근원에서 생물 발광 단백질의 덜 풍부한 응용 프로그램은 주로 낮은 안정성 그리고 박테리아의 발광 단백질 그들의 해양 서식 지에 관련이 있을 수 있습니다 파생 된. 해양 서식 지의 발광 박테리아는 표준 실험실 조건 하에서 cultivable있지 않습니다. 이 박테리아는 특정 성장 매체와 같은 인공 바다 물 중간 및 낮은 성장/부 화 온도 (예를 들어, 28 ° C) 조건 필요합니다.
럭 스 오 페론 특성 또는 단일 럭 스 의 비교를 단순화 하기 위해 유전자의 다른 발광 세균성 긴장, 럭 스 오 페론 식 및 분석 표준화 하는 방법의 범위는 필수입니다. 따라서, 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균)으로 전체 럭 스 리브 오 페론을 통합의 아이디어는 나왔다. 이 위해 깁슨 어셈블리 특정 제한 사이트에 대 한 필요 없이 하나의 벡터에 다중 선형, 겹치는 파편을 통합 하는 유용한 도구가 될 입증. 이 방법은 또한 적당 한 DNA 삽입은 너무 큰 때 ( luxCDABFEG-ribEBHe.g.,P mandapamensis 27561; ~ 9 kb 오 페론 크기) PCR을 통해 증폭 될. 럭 스 오 페론 여러 겹치는 조각으로 분리 될 수 있습니다 한 식 플라스 미드로 조립 그리고 마지막으로 시퀀스 확인 어셈블리 제품 직접 적절 한 대장균 으로 변형 될 수 있다 높은 수율에 대 한 시스템 단백질 식18,,1920. 뿐만 아니라 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 취급 하 게 쉬운, 세포 성장 및 발광 빛 방출의 녹음을 결합 하는 간단한 방법을 설립 남아 있었다. 여기 설명 하는 방법을 현장에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 빛 방출 수 있습니다.
럭 스 유전자와 럭 스 오 페론 순서와 한편으로, 인공 발광 대장균 , 다양 한 발광 박테리아의 규정의 분석 시스템 P.의 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하 mandapamensis 27561 고 다른 손, 결합 세포 밀도와 발광, 녹음 현장에서 새로 개발된 된 플레이트 리더 분석 결과 다양 한 세균성 럭 스 시스템에 대 한 더 많은 정보를 얻을 수 있도록 도와줍니다. 이 기본적인 특성 및 luciferases 및 관련된 효소의 비교 향상 된 안정성 및 활동 대안 이미 설립된 기자 시스템을 발생할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>E2621S</td><td>for 10 rxn&lt;br/&gt; dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad</td></tr><tr><td>Phusion Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0721</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193S/R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>Monarch DNA Gel Extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>#T1020S</td><td>for 50 rxn</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td>for 250 rxn</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>24-well black sensoplate with glass bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>662892</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Omega plate reader&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMA/Mars Analysis Software</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Version 2.20</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2010</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard Incubator Shaker</td><td>Infors AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ measurement and correlation of cell density and light emission of bioluminescent bacteria

세균성 종의 상당수는 빛을 방출 수 있습니다. 그들의 모든 공유 같은 유전자 클러스터, 즉 럭 스 오 페론. 이 유사성에도 불구 하 고 이러한 박테리아 성장 동작, 빛 방출의 강도 또는 생물 발광의 규정 특성에 극단적인 변화를 보여줍니다. 여기에 제시 된 방법은 플레이트 리더를 활용 하 여 시간이 지남에 따라 녹음의 세포 성장 및 발광의 발광 강도 결합 하 여 새로 개발된 된 분석 결과입니다. 결과 성장 및 발광 특성 쿼럼 감지 규칙 등 각 세균성 긴장의 중요 한 기능에 연결할 수 있습니다. 다양 한 발광 박테리아의 특정 매체 (예: 인공 바다 물 매체)를 요구 하 고 온도 정의. 쉽게 처리, 비 발광 표준 연구 박테리아 대장균 (대장균), 다른 한편으로, 수 수 재배 저렴 하 게 실험실 규모에서 높은 수량. 럭 스 전체 포함 하는 플라스 미드를 도입 하 여 대장균 을 이용 오 페론 실험 조건 단순화할 수 하 고 또한 미래의 응용 프로그램에 대 한 많은 가능성을 엽니다. 모든 럭 스 유전자는 대장균 식 스트레인을 활용 하 여 표현의 깁슨 복제를 통해 한 식 플라스 미드의 건설과 7 럭 스 유전자와의 3 개의 갈비뼈 유전자를 포함 하는 4 개의 파편의 삽입에 의해 달성 되었다 pET28a 벡터에 럭 스 리브 오 페론. 대장균 기반 럭 스 유전자 발현을 유도 하 고 발광 대장균 인 이소프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 추가 통해 제어 수 셀. 이 시스템의 장점은 쿼럼 규제 제한 및 비표준 성장 조건에 따라 복잡 한 중간 작곡과 같은 감지를 피하기 위해 온도 정의 합니다. 이 시스템은 럭 스 오 페론에서 각 유전자의 새로운 유전자, 다른 한 세균성 긴장에서 luxAB 유전자 교환도 추가 또는 여 럭 스 유전자와 그들의 상호 작용의 분석을 수 있습니다 또는 단백질 복합물, luxCDE등을 분석.

럭 스 오 페론- luxCDABFEG -유전자 순서는 매우 다양 한 변종2,,514이상 보존 됩니다. 플라스 미드의 디자인에 대 한 시퀀스 정보 Photobacterium mandapamensis 27561 발광 박테리아 스트레인에서 찍은 및 유전자 순서는 동일을 유지 했다 고, 또한, 단일 유전자 사이 noncoding 시퀀스 고려 되었다. 적용 된 깁슨 복제 전략에 대 한 도식 개요는 그림 2에 묘사 된다. 20-40 자료 쌍 시퀀스를 중첩 총, luxCDAB, luxF, luxEG, 및 ribEBH, 4 개의 조각은 생성 했다. 깁슨 어셈블리20의 모든 단계를 수행한 후 DNA 시퀀싱 모든 조각을 포함 하는 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 했다. 최종 조립 제품 pET28a의 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 벡터 지도 그림 3에서 묘사 된다. 이 수정된 pET28a 벡터의 중요 한 장점의 활용은 대장균 성장 조건 표준화와 IPTG로 유도 제어.
발광 박테리아와 해당 셀 밀도의 발광 측정, 플레이트 리더 기반 방법 개발 되었다. 플레이트 리더에 대 한 방법 빛 강도와 세포 밀도 대 한 단일 측정 스크립트를 결합 하 여 생성 되었습니다. 이 새로운 스크립트 사용 세650 의 측정 및 빛의 강도 사용자에 대 일 분 마다 정의 (예를 들어, 10 h) 각각 분석에 사용 되는 박테리아의 생성 시간을 조정 해야 하는 기간. 광학 밀도의 측정 650에서 수행한 nm 빛 방출 간섭을 유발 하지 않도록. 증거로 서의 개념 및 건강 대장균 세포의 올바른 성장 동작을, 참조 측정 수행 했다. 그림 4 대장균 BL21 셀, 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 및 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 pET28a 벡터를 포함 하의 비교에에서 삽입 되 게 됩니다. 후자의 스트레인에 대 한 아무 IPTG는 빛 내 쏘 기 때문에 시키는 T7 발기인의 분석에 추가 되었습니다. 모든 3 개의 기준 측정 3 개의 성장 단계 (지연, 지 수, 및 고정 단계)와 자형 성장 곡선을 표시합니다. 발광, 럭 스 리브 오 페론 삽입 시작 하지만 측정 달리 pET28a 벡터에 포함 된 대장균 BL21 셀만 30 분, 비 유발 셀 후 방출은 식 IPTG과 빛의 추가 의해 유도 된다 만 약 5 h 후 광택을 훨씬 낮은 발광 표시 시작 (ca. 4-fold) 유도 시스템에 비해.
그림 5 이 대장균 에 발광 박테리아 스트레인 P. mandapamensis 27561, 파운드 매체 또는 인공 바다 물 매체 표현 럭 스 오 페론의 빛 강도 제공 하는 성장 곡선의 비교 소설을 사용 하 여 제자리에 방법 설립. 이러한 박테리아, 비교 측정 외피 온도 28 ° c.의 수행 했다 이 온도 감소 파운드 매체 인공 바다 물 매체 뿐만 아니라 발광 세균 변종 낮은 온도 대 한 변형 수정된 대장균 의 성장 속도 중요 한. P. mandapamensis 27561 보여줍니다 대장균보다는 훨씬 더 높은 세포 조밀도이 온도 의존성 그림 5A에 표시 됩니다. 또한, 대장균 변종에 파운드 매체 세대 수 자연 발광 박테리아 변종에 대 한 더 높은 세포 밀도의 인공 바다 물 매체는 선호 하 고 생물 발광에 대 한 필수. 그림 5B와 같이 기록 된 셀 밀도 각각 빛 농도와 연관. 주목할 만한, 발광 대장균 세포 도달 비슷한 비록 높은 농도 다른 시간 지점에서 기록 된 두 파운드 매체 뿐만 아니라 인공 바다 물 매체에서 방출 맥시 마를 빛. 이 관찰, 달리 P. mandapamensis 27561 파운드 매체에서 매우 감소 된 성장 속도 함께 가능한 하지만 세균성 세포 모두 (그림 5B)에서 빛을 방출 하지 않았다. 인공 바다 물 매체, P. mandapamensis 27561 대장균보다 낮은 200의 거의 요인은 초당 약 1 × 104 카운트에서 발광의 최대를 표시 됩니다. 그림 5 C 상대 빛 단위를 생물 발광 마약에 의해 정규화 됩니다 나타냅니다. 이 결과 확인 했다는 플라스 미드의 삽입 포함 된 럭 스 오 페론 E. 콜라이 성공 하 고 기능에 뿐만 아니라 또한이 대장균 수정 긴장은 더 높은 발광으로 유효한 대안 수익률 및 마리나 박테리아, 복잡 한 해 수 등의 세균성 생물 발광의 제한 없이 중간 및 낮은 온도.
또한, 대장균 기반 럭 스 리브 유전자 발현 이상 24 h의 장기 측정 발광 (그림 6)의 장 수를 분석을 수행 되었다. 발광 19.5 h에 대 한 지속, 점진적으로 감소 어디 세균성 긴장 (예를 들어, P. mandapamensis 27561) 보다 훨씬 더 오래 10 h 후 매우 낮은 빛 방출의 결과로 관찰 되었다.
개발된 분석 결과의 한계를 설명 하기 위해 그림 7 3 발광 세균성 긴장, 즉 s 1 Photobacterium mandapamensis Photobacterium mandapamensis TH1, 비 브리 오의 측정 결과 보여 줍니다. harveyi 14126. 첫 번째 변형 (S1)에 대 한 메서드는 아주 잘 작동 하 고 거의 2 x 106의 최대한 생물 발광 강도 보여줍니다. 다른 두 변종 (TH1 및 14126), 둘 다에 의해 생성 된 빛의 강도 사용된 악기 설정의 검출 한계를 초과 했기 때문에 최대한 빛의 강도 확인할 수 없습니다. 이 두 종자의 개발된 방법 (스크립트)에 대해 정의 된 이득 값은 너무 높게 설정 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 발광 활동의 개시는 서로 비교할 수 있습니다. P. mandapamensis TH1 P. mandapamensis S1 시작 빛나는 약 1 시간 후에 OD650 값 0.1-0.2, 각각. 반면, harveyi 대 14126 후 약 5.5 h 1.0의 OD650 값에 빛을 방출 하기 시작 합니다. 발광의 관찰된 발병 OD 생물 발광에 있는 지 수 증가 동반 된다. V. harveyi 14126의 생물 발광 기초가 쿼럼 규제를 감지 하 고 따라서 특정 세포 밀도 그림 713에 명확 하 게 관찰 될 수 있는 럭 스 오 페론의 정품 인증을 허용 알려져 있다. 이 결과이 소설 현장에서 플레이트 리더 분석 결과 발광 박테리아를 쉽게 비교 하 고 또한 대략 쿼럼 규제를 감지 하는지 여부를 확인 하 여 이러한 긴장의 규제 메커니즘을 정의할 수는 될 수 하는 것을 보여 줍니다. 여부를 관찰 했다.
그림 8 의 대장균 BL21 세포 은닉 IPTG와 유도 후 럭 스 오 페론을 포함 하는 조립된 pET28a 플라스 미드의 식 문화는 예를 보여 줍니다. 유도 후 약 1 h, 후 대장균 세포 블루-그린 색상으로 빛나는 시작 합니다. 그림 8 A 보여줍니다 대장균 식 문화 촬영 빛에서과 어둠 속에서 같은 문화를 제공 하는 그림 8B . 그림 8 C 한 천 배지 세균성 생물 발광의 동일한 블루-그린 색상 특성에 어둠 속에서 빛나는 P. mandapamensis S1과 인공 바다 물 매체의 묘사.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3.jpg"> 그림 2 : 복제 전략 적용된 깁슨의 도식 대표. (I) 단계: 겹치는 뇌관 (색된 화살표; ca. 20-40 자료 쌍 중복) 설계 되었습니다. 겹치는 뇌관 어 닐 링 시퀀스 한 조각의 각각 5'과 3' 지역 및 인접 한 세그먼트의 각각 3'와 5' 영역 구성 포함 됩니다. 단계 (II): 어셈블리에 대 한 설계 조각 표준 PCR 반응을 통해 생성 됩니다. 단계 (III): 대상 벡터 제한 소화 (예를 들어, NcoI, XhoI)에서 오는지 이다. 단계 (IV): 모든 조각 및 선형화 벡터 DNA 농도 깁슨 (제조 업체의 프로토콜)에 따라 어셈블리에 대 한 적절 한 농도 조정 하려면 결정 해야 합니다. 단계 (V): 모든 조각이 있고 최적화 된 DNA 농도와 선형화 벡터 깁슨 어셈블리 마스터 믹스 (T5 exonuclease, DNA 중 합 효소와 DNA 리가)와 함께 결합 되어 1 h. 50 ° C에서 알을 품는 단계 (VI): 어셈블리 제품 변형 적절 한 대장균 에 표준 프로토콜에 따라 고수익 플라스 미드 복제 (예를 들면, 대장균 TOP10 또는 XL-1) 스트레인. 단계 (7 세): 플라스 미드의 정확한 어셈블리를 확인 하려면 조립된 플라스 미드의 DNA 연속 수행할 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig2v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2.jpg"> 그림 3 : 벡터 지도 pET28a 포함 하는 럭 스 리브 오 페론. P. mandapamensis 27561의 럭 스 리브 오 페론은 원래 유전자 순서 (luxCDABFEG ribEBH)에 pET28a의 다중 복제 사이트에 삽입 됩니다. 금지 사이트 복제에 사용 되는 NcoI 및 XhoI 있습니다. 파편은 오 페론의 깁슨 어셈블리에 사용 되는 오렌지에서 luxCDAB , luxF 녹색에서, 파란색에 luxEG 및 ribEBH 라벤더;에 유전자는 조각의 별도 상자로 표시 됩니다. 각 유전자는 오 페론의 사이 noncoding 시퀀스 적용된 복제 전략에 포함 됩니다. 최종 플라스 미드의 크기 pET28a 전체 럭 스 리브 오 페론을 포함 하는 14,625의 기본적인 쌍입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2.jpg"> 그림 4 : 성장 곡선 및 참조 긴장의 가벼운 강렬의 비교. 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 10 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 대장균 BL21 셀 (회색 사각형), 대장균 BL21 셀 포함 하는 빈 pET28a 벡터 (회색 원), 그리고를 대장균 BL21 셀 럭 스 리브 오 페론 삽입 (블랙 다이아몬드)와 pET28a 벡터를 포함 분석 했다 대장균 세포의 올바른 성장 동작을 확신 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2.jpg"> 그림 5 : 성장 곡선의 비교와 럭 스 오 페론의 빛 강도 표현 대장균 (사각형) 및 P. mandapamensis 27561 (원) 파운드 매체 (오픈 기호) 또는 인공 바다 물 매체 (채워진된 기호). 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 모든 실험은 28 ° c.의 외피 온도에 수행 되었다 (A) 광학 밀도 (OD) 측정 650 파운드 매체 및 인공 바다 물 매체에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널) 비교 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널) nm 10 분 마다 수행 했다. 650에서 셀 밀도 결정을 생물 발광 간섭을 피하기 위해 nm. (B) 빛의 강도 (생물 발광 [건의/s])의 측정은 수행 10 분 마다 10 h. 대장균 럭 스 오 페론 식 (왼쪽된 패널)는 파운드에 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 패널)에 비해 중간과 인공 바다 물 매체입니다. (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD) 대장균 (왼쪽된 패널) 및 P. mandapamensis 27561 (오른쪽 창)에서 표현 하는 럭 스 오 페론의 정상화 생물 발광 셀 밀도 의해 결정 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig5v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2.jpg"> 그림 6 : 성장 곡선의 비교 및 대장균 의 빛 강도 24 h. 위한 럭 스 유전자 발현을 기반으로 650에서 OD 및 초당 계산의 생물 발광 강도 마다 10 분 이상 28 ° c.에 24 h를 측정 했다 모든 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 의미 값입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 또한, 상대 빛 강도 (RLU/OD) 생물 발광 세포 밀도 의해 정규화 되어 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig6v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2.jpg"> 그림 7 : 발광 박테리아의 비교 평가 규정을 감지 하는 잠재적인 쿼럼. 발광 및 셀 밀도 10 h 10 분 마다 측정은 각 4 개의 기술 복제와 3 개의 생물 복제의 평균 값을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. Photobacterium mandapamensis TH1의 측정 (사각형 검정), 브리 harveyi 14126 (회색 원)와 Photobacterium mandapamensis S1 (회색 다이아몬드);에 비교 했다 (A) 묘사 650에서 광학 밀도 (OD) nm, (B) 빛 강도 (생물 발광 [건의/s]), 그리고 (C) 상대 빛 강도 (RLU/OD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig7v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57881/57881fig8.jpg"> 그림 8 : 생물 발광 한 천 배지와 액체에서. (A) 5 L 플라스 크 2 L 파운드 매체와 주사 대장균 BL21 셀 pET28a 럭 스 오 페론 플라스 미드 빛에서 촬영을 표현. (B)는 같은 문화 (A)와 같이 어둠 속에서 촬영. 그림 A와 B는 식의 유도 후 약 2 시간을 촬영 했다. 어둠 속에서 촬영 하는 P. mandapamensis s 1의 질주 된 문화 (C) 인공 바다 물 매체 한 천 격판덮개. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57881/57881fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

11.5K 조회수.  Graz University of Technology. 발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

비디오: In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

유전학

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

생물학

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

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Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In circadian rhythms research, for example, clock gene fusions with firefly luciferase give rise to robust rhythms in cellular bioluminescence that persist over many days. Technical limitations associated with photomultiplier tubes (PMT) or conventional microscopy-based methods for bioluminescence quantification have typically demanded that cells and tissues be maintained under quite non-physiological conditions during recording, with a trade-off between sensitivity and throughput. Here, we report a refinement of prior methods that allows long-term bioluminescence imaging with high sensitivity and throughput which supports a broad range of culture conditions, including variable gas and humidity control, and that accepts many different tissue culture plates and dishes. This automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) also allows the observation of spatial variations in luciferase expression across a cell monolayer or tissue, which cannot readily be observed by traditional methods. We highlight how the ALLIGATOR provides vastly increased flexibility for the detection of luciferase activity when compared with existing methods.

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Genetically encoded luciferase is a popular non-invasive reporter of gene expression. Use of an automated longitudinal luciferase imaging gas- and temperature-optimized recorder (ALLIGATOR) enables longitudinal recording from bioluminescent cells under a wide range of conditions. Here we show how ALLIGATOR may be used in the context of circadian rhythms research.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

일주기 리듬 연구를 위한 인간 장 장내 생물 최적화

Monitoring Circadian Oscillations with a Bioluminescence Reporter in Organoids

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse repertoire of cellular and physiological processes ranging from sleep-wake cycles to metabolism. This clock mechanism entrains the organism based on environmental changes and coordinates the temporal regulation of molecular and physiological events. Previously, it was demonstrated that autonomous circadian rhythms are maintained even at the single-cell level using cell lines such as NIH3T3 fibroblasts, which were instrumental in uncovering the mechanisms of circadian rhythms. However, these cell lines are homogeneous cultures lacking multicellularity and robust intercellular communications. In the past decade, extensive work has been performed on the development, characterization, and application of 3D organoids, which are in vitro multicellular systems that resemble in vivo morphological structures and functions. This paper describes a protocol for detecting circadian rhythms using a bioluminescent reporter in human intestinal enteroids, which enables the investigation of circadian rhythms in multicellular systems in vitro.

저자 스포트라이트: In vitro Investigations of Circadian Rhythms in Multicellular Systems(다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 시험관 내 조사)

Circadian rhythms, which exist in most organisms, regulate the temporal organization of biological processes. 3D organoids have recently emerged as a physiologically relevant in vitro model. This protocol describes the use of bioluminescent reporters to observe circadian rhythms in organoids, enabling in vitro investigations of circadian rhythms in multicellular systems.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

Most living organisms possess circadian rhythms, which are biological processes that occur within a period of approximately 24 h and regulate a diverse ...

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

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발광 생물 세균 이미징

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링