저자는 비판적 원고 편집에 대 한 교수 J. Lebacq 감사 합니다. Cftrtm1Eur (homozygous F508del-CFTR (FVB/129) 마우스는 에라스무스, 로테르 담, 네덜란드, 낭 성 섬유 증 EU FP6 연구를 위한 유럽 경제 공동체 유럽 조정 작업의 지원에 의해 개발 되었다 LHHM-CT-2005-018932입니다.

연구 및 절차 연구 (시 n ° 86/609)에서 동물 사용에 대 한 유럽 공동체 규정 동의 UCL (2017/UCL/MD/015)의 동물 연구에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 조사 지침 2010/63/유럽 유럽의 회의 2010 년 9 월 월 22 일의 위원회의 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 따라 동물 실험에 대 한 정규화 됩니다.
1. 테스트 전 평가 및 관리
<ol><li>더블 루멘 비 강 카 테 터를 준비 합니다. 참고: 비 강 카 테 터는 더블 루멘 모 세관 튜브, 한 루멘 솔루션의 지속적인 관류에 대 한 사용 되 고 다른 하나는 측정 채널.<ol>
<li>폴 리 에틸렌 관 (2.0 m m 내경, 3.0 m m 외경;의 조각, 길이, 약 20 m의 중앙 단면도 열 그림 1 한) (10-15 s)를 당기기를 위한 충분히 부드러운 때까지 가스 버너의 화 염에서.</li>
		<li>적절 한 길이 (~ 15 cm)와 코 프로브 (그림 1b)에 대 한 외부 직경 (~0.1 m m)의 매우 얇은 모 세관 튜브를 떨어져 두 끝을 당겨.</li>
		<li>청소 하 고 degrease 순수 에탄올과 같은 두 개의 모세 혈관, 테이프그림 1(c) 그들을 함께 cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 함께 그들을 접착제.</li>
		<li>면도날 또는 약 8 cm (그림 1의d) 더블 루멘 카 테 터의 최적의 길이 메스 프로브의 초과 길이 멀리 잘라.</li>
		<li>주사 투과 하는 것을 확인 하 두 루멘을 통해 물.</li>
		<li>끝에서 5 mm 거리에서 마크를 적용 합니다. 참고: 프로브 삽입 됩니다, 콧구멍에 마크까지 모든 측정은 비 강 내부 같은 사이트에 있도록.</li>
		<li>건조 한 상자에 더블 루멘 카 테 터를 저장 합니다. 참고: 수 있습니다 사용된 6-10 번 적절 하 게 테스트 후 즉시 청소 하는 경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>크림 믹스를 준비 합니다.<ol>
<li>부드럽게 혼합 전해질 크림과 포화 3m KCl 해결책 1:1 비율 (볼륨/볼륨), 작은 기포의 형성을 방지. 참고: 크림 믹스 사용 됩니다 구축 측정 및 참조에 대 한 전극 교량 Ag/AgCl 전극, 그림 1에서 볼 수 있듯이.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> 그림 1 : 전극과 교량 프로브. 그림 (a) 전후 난방 그리고 (b), (c)는 더블 루멘 카 테 터 (d), 실리콘 튜브 커넥터 (e)와 전극 (f)의 두 모 세관 부분에 합류 하는 테이프 폴 리 에틸렌 튜브를 보여 줍니다. 사진 선명도, 커넥터 크림 혼합으로 가득 하지는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>솔루션 레이블</td>
			<td>솔루션 설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>기초 버퍼링 소금 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>소금 솔루션 버퍼링 염화-무료</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>10-2 M amiloride 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>10-3 M 산림 재고 솔루션</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 주식 쥐에서 코 PD 테스트를 위한 솔루션.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소금</td>
			<td>mM</td>
			<td>분자량</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화 나트륨 (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7,889</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화 칼슘이 수화물 (CaCl2.2H2O)</td>
			<td>2 월 25 일</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>마그네슘 염화 물 hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium 인산 염 (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium 인산 염 (KH2포4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 기저의 버퍼링 소금 솔루션 (솔루션 주식).
<ol start="3"><li>솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>실험 프로토콜 (표 1)에 필요한 4 개의 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>준비 하는 기저 버퍼 솔루션 (재고 솔루션; 표 2) 그리고 염화 무료 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B; 표 3) 실내 온도에서 순수한 물에 있는 소금 혼합 하 여 PH, 낮은 pH에 1 N HCl 인상 1 N NaOH를 사용 하 여 pH 7.4 (범위 7.0-7.6)를 조정 합니다. 솔루션 (275 mOsm/L)의 osmolarity를 확인 하십시오.</li>
			<li>최대 6 개월까지 최대 3 개월 또는 냉동된에 플라스틱 병에 대 한 4 ° C에서 레이블이 유리병에 저장 합니다.</li>
			<li>순수한 물 10 mL를 amiloride 염의 26.6 mg을 추가 하 여 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)를 준비 합니다. 70 ° c.에 5 ~ 10 분을 위한 혼합물이 열 Amiloride 빛에 민감한으로, 어두운 컨테이너에서 솔루션 C를 유지. 컨테이너 분류 하 고 최대 3 개월까지 4 ° C에서 저장.</li>
			<li>순수한 물 24.36 mL에 산림의 10 밀리 그램을 추가 하 여 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)를 준비 합니다. 0.1 mL aliquots 산림 재고 솔루션의 분류 하 고 최대 6 개월 동안-20 ° C에서 저장.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>신선한 솔루션 A1, B1, b 2를 준비 (표 4).<ol>
<li>신선한 솔루션 a 1을 준비 (기저 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 기저 소금 솔루션 (재고 솔루션 A)의 10 mL 한 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL을 추가 함으로써. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.</li>
		<li>신선한 솔루션 B1 준비 (염화 버퍼링 솔루션 플러스 10-4 M amiloride) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C)의 0.1 mL를 추가 하 여. 컨테이너 분류 하 고 준비의 24 시간 이내에 사용.</li>
		<li>신선한 솔루션 B2 준비 (염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 플러스 10-4 M amiloride, 10-5 M 산림) 염화 무료 버퍼링된 소금 솔루션 (재고 솔루션 B) 10 mL 및 10-2 M의 0.1 mL를 추가 하 여 amiloride 솔루션 (재고 솔루션 C) 그리고 10-3 M 산림 솔루션 (재고 솔루션 D)의 0.1 mL. 컨테이너에 레이블을 고 준비의 2 시간 이내에 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소금</td>
			<td>mM</td>
			<td>분자량</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>글 루 콘 산 나트륨 (monosodium 소금)</td>
			<td>135</td>
			<td>218.1</td>
			<td>29,444</td>
		</tr>
<tr>
<td>글 루 콘 산 칼슘 (무수 분말)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0.947</td>
		</tr>
<tr>
<td>마그네슘 황산 염 heptahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0.296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dipotassium 인산 염 (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monopotassium 인산 염 (KH2포4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136.1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 염화 무료의 버퍼 솔루션 (재고 솔루션 B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> 그림 2 : 비 강 점 막의 관류 동안 마우스의 위치. 그림에서는 (a)가 열 패드, 전압계 (b), 뒷 다리 (c)는 인접 (d), 연동 펌프는 베개 (f)의 원심 (e) 매장에서 피하 공간에 삽입 참조 전극 그리고 침대 시트 (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
2. 평가 및 테스트 기간 동안 관리
<ol><li>실험적인 체제를 준비 합니다.<ol>
<li>측정 설치 (18.8 x 37.5 cm; 한 생리 적인 온도에서 유지 두 난방 패드를 사용 하는 동안 그리고 테스트 후 저체온증을 방지 하기 위해 그림 2 는), 그리고 다른 하나 (15.5 x 15.5 c m)는 동물 시험의 끝에 복구에 대 한 배치 됩니다 상자.</li>
		<li>데이터 캡처 데이터 메모리 높은 입력된 임피던스에 연결 된 소프트웨어와 함께 로드 된 컴퓨터에서 전환 (> 1012Ω)와 고해상도 (0.1 mV) 전압계 (그림 2b).</li>
		<li>전극은 전압계에 연결 합니다. 그림 2c와 같이 긍정적인 측정 전극 비 강 카 테 터와 뒷 다리에 피하 공간에 삽입 된 카 테 터를 부정적인 참조 전극에 연결 합니다.</li>
		<li>딥 크림 믹스에서 함께 전극의 팁. 초기 전극 오프셋된 값을 확인 합니다. 값 (±) 2 mV 보다 크면 전극 거부 (이상적으로 0 mV).</li>
		<li>연동 펌프에 전환 하 고 그림 2에서 볼 수 있듯이 위치, 펌프 튜브를 삽입 합니다.</li>
		<li>비 강 관류 (그림 2d)에 대 한 선택 된 솔루션에 포함 된 유리병에 펌프 튜브의 인접 콘센트를 연결 합니다. (그림 2e) 비 강 카 테 터의 관류 루멘에 펌프 관의 원심 콘센트를 연결 합니다.</li>
		<li>비 강 카 테 터의 한 루멘 전해질 크림 믹스 10 µ L 피 펫 팁을 통해에 채우십시오. 적응을 실리콘 튜브 커넥터 (그림 1e) 카 테 터, 커넥터 크림 믹스와 커넥터 (그림 1f)에 긍정적인 전극 삽입. 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 확인 합니다. 값이 (±) 2 mV 보다 큰 다리를 거부 (이상적으로 0 mV).</li>
		<li>신선한 솔루션 a 1 비 강 카 테 터의 두 번째 루멘을 채우십시오. 유리병을 포함 하는 솔루션 10에 해당 하는 코 카 테 터의 길이 채우기 위해 A. 반대로 연동 펌프의 방향에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어 관류의 s. 참고:이 허용 기저 PD 값 10에 대 한 기록 amiloride를 적용 하기 전에 s. (그림 1) 참조 전극의 커넥터 안에 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 찍어.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스 처리를 시작 합니다.<ol>
<li>마우스 무게를 계산 하는 복 (ip) 노선17에 의해 주입에 마 취약의 정확한 복용량을 기록 합니다.</li>
		<li>26 G (0.45 x 10 m m) 바늘을 사용 하 여 주사 마 취의 유도 홍보 하는 intraperitoneally premedication: 5 mg/mL midazolam의 50 µ L의 고정된 복용량. 5 분 기다립니다.</li>
		<li>마 취 믹스를 준비 (각각, 펜타닐, medetomidine, droperidol 0.05, 0.40, 및 20 mg/kg의 최종 농도에 몸 무게와 0.375 µ g의 고정 된 복용량에서 clonidine) 최적의 고 안정적인 깊이 마 취 (단계 III, 비행기 2)17 수 있도록 . Intraperitoneally, 마 취 믹스의 볼륨을 주입 하 고 clonidine의 볼륨을 주입. 참고: 15 분 후 마우스 자 고 마 취 30 분 이상 지속 될 수 있습니다.</li>
		<li>3 cm 넓은 '베개' (그림 2f) 마우스 머리에 대 한 지원으로 (그림 2는) 난방 패드의 상단 부분을 다룰 것입니다 수 있도록 조직 흡수의 시트를 접어.</li>
		<li>생리대 흡수 하는 조직 ('침대 시트';의 시트와 커버 그림 2 g). 난방 패드에 그것의 뒤에 마우스를 놓는다. 테이프는 사지 및 꼬리 (그림 2).</li>
		<li>뒷 다리의 피하 공간에서 참조 정 맥 카 테 터 (그림 1g)을 삽입 합니다. 바늘을 제거 하 고 실리콘 튜브 커넥터 (그림 12 c e) 적응.</li>
		<li>카 테 터와 커넥터 크림 믹스 및 커넥터 (그림 1f)에서 부정적인 전극 삽입.</li>
		<li>카 테 터 및 전극으로 어떤 변위를 방지 하는 데 필요한 테이프와 수정. 기준 전극과 다리의 배치, 후 IV 카 테 터의 커넥터 내부 전극 크림 믹스에서 비 강 카 테 터의 끝을 담거 서 측정 전극 브리지 오프셋된 값을 다시 확인 합니다. (이상적으로 보다는 더 적은 (±) 2 mV) 안정적인 최종 오프셋된 값을 기록 합니다.</li>
		<li>"부드러운" 테이프에 흡수 하는 조직 ('베개' (그림 2f)과 '침대 시트';의 2 개 조각 사이 공간에서가 열 패드와 마우스 귀를 수정 (그림 2g)). 눈을 건드리지 않고 털 (뻣 뻣 한 머리카락 콧구멍 근처 성장)을 수정.</li>
		<li>구강에서 액체를 흡수 하는 혀 옆으로 (그림 3는) 이동 하 고 필터 종이 ('파이프';의 뾰족한 심지를 삽입 그림 3 b) 입에 약 1 cm. 유동성 부족 perfused 콧구멍을 흡수, 필터 종이 ('손수건';의 두 번째 조각 장소 그림 3 c) 코 끝에서 개최.</li>
		<li>입의 내부와 접촉 하 여 비 강 카 테 터의 끝을 배치 하 여 상피 잠재력의 긍정적인 제어 값을 확인 합니다. 참고: 읽기 해야 안정적이 고-10 사이의 범위 mV와-20 mV.</li>
		<li>좋은 직접 조명 아래 좋은 집게와 그것을 잡고, 섬세 하 게 비 강 카 테 터에 소개 4-까지 한 콧구멍 mm 코에서에서 6 팁. 참고: 비 강 PD 카 테 테 르는 최대한 안정 기준선 PD 값17,20를 주는 위치에 중간 비 강 외에 있습니다.</li>
		<li>마 취 약물의 주입 후 5 분 부드럽게 동물 머리 아래쪽으로 약 30 °에 의해가 열 패드를 기울기. 최대한 기초 PD 값을 모니터링 합니다.</li>
		<li>때 그것은 약 30의 기간 동안 안정적인 s, 시작 10 µ L의 일정 한 속도로 비 강 점 막 perfusing / 분, 4 버퍼 솔루션 (A, A1, B1, B2) 연속에서. 10에 대 한 첫 번째 솔루션 (단계 1.3.1.1) perfuse s 고 각 다음 솔루션 (1.4 단계) 5 분 또는 때까지 안정적인 값에 도달 했습니다. 산림 (B2) 과도 산림 응답 추락 시작 될 때 perfusing 중지 합니다.</li>
		<li>기록 데이터에 대 한 1 s 간격을 선택 합니다. 관류 시작의 시간에 데이터를 기록 하는 시작 합니다. 컴퓨터 화면에 시간의 기능으로 데이터를 표시 합니다.</li>
		<li>중지 데이터 캡처 솔루션 B2 관류의 끝에. 스프레드시트 파일로 데이터를 저장 합니다.</li>
		<li>마지막 오프셋된 값을 빼서 올바른 데이터입니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> 그림 3 : 비 강 카 테 터와 필터 종이 생리대에 마우스의 장소에 위치. 그림 옆으로 (a)는 파이프 (b), 손수건 (c)를 넣어 혀를 보여 줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 테스트 후 평가 및 관리
<ol><li>난방 장치 패드에서 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>'침대 시트'와 마우스 코를 닦아 (그림 2g).</li>
	<li>Intraperitoneally 주사 마 취 적 믹스 naloxone, 경쟁력 있는 모 르 핀 길 항 제, atipamezole, medetomidine 특정 해독 제 (2 mg/kg 체중)의 고정 된 복용량 (4 µ g)의 구성.</li>
	<li>일반적으로 1 ~ 2 시간 후 관찰 하는 전체 복구까지 복구 상자에서 작은 손 난로에 마우스를 놓는다. 참고: UCL 실험실에서 약 10% 사망률, 주로 bronchoaspiration, 테스트 기간 동안 비 강에 끼얹는다 솔루션의 관련은 관찰 성별 또는 유전자 형에 관계 없이.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서의 목적은 이온 운송업 자, 주로 CFTR 그리고 ENaC의 무결성을 테스트 하는 데 필요한 시간의 길이 대 한 자발적 호흡 생쥐에서 솔루션의 지속적인 관류에서 비 강 PD를 측정 하기 위한 적절 한 프로토콜을 설명 하는 것입니다. 프로토콜의 모든 단계 완전 동물 복구 및 좋은 품질 및 재현성 데이터도 최적화 되었습니다. 특히, 중요 한 단계는 마 취 평가 및 관리, 그리고 적절 한 동물 위치 그리?...

거의 3 년간 전기 잠재적인 차이 (PD) 측정 원심 항공1의 대표로 서 비 강 점 막에 표현 하는 막 횡단 이온 전송기의 기능 상태를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 둘 다의 꼭대기 막에 지역화 다단계 동적 테스트2,3, 코 PD 수 있습니다 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)과 상피 나트륨 채널 (ENaC) 활동의 기능 해 부 상피 세포 하 고 기도 표면 수 분에 중요 한 역할을 발휘. 비 강 PD 테스트의 주요 임상 응용 프로그램은 CF, 유럽 국가에 1 개 2500 라이브 출생의 평균 발생률과 백인 인구에 있는 가장 일반적인 치명적인 유전 질환의 진단에 도움을. 테스트는 오랫동안 감쇠, oligo 또는 모노 증상 형태 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 진단에 도움이 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증4. 더 최근에, 기본적인 CFTR의 치료 변조의 clinometric 평가5,6,7,,89,10,11 결함 ,12,,1314,,1516 새로운 CF 치료의 임상 시험에서 비 강 PD의 사용 했다. 전 임상 설정에서 테스트 새로운 CF 대상 치료18,19,,2021의 bioactivity의 조사 수 있도록 마우스17 에 적응 되었습니다. 마우스에는 기술은 이다 섬세 한, 설치류와 인간 사이 코 영역의 크기에 종 관련 해 부 차이 설치류에 nasofacial 지역에서 감각 입력의 필수적인 역할에 주로 기반으로. 그것은 훈련 되 고 숙련 된 운영자, 전용된 장비 및 공급을 요구 한다.
CF는 전 샘의 다중 조직 장애는 만성 호흡기 질환에서 임상 그림을 지배 하고있다. 질병은 인코딩 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 유전자에 돌연변이 의해 발생-규제 CFTR 염화 물 채널22. 날짜 하려면, 2000 개 이상의 CFTR 돌연변이 발견된23되었습니다. 가장 일반적인 돌연변이24,25, CF 대립 유전자의 거의 90%에서 발견 위치 508 (F508del-CFTR) 단백질의 polypeptide 사슬에서에서 페닐알라닌의 삭제에 해당 합니다. CFTR 단백질은 순전히 저항 작은 전도성 염화 물 채널 이다. CFTR 다른 전송 메커니즘, 특히 ENaC26,27을 조절 하는 상당한 증거가 있다. 결함이 전해질 수송, CFTR 종속 염화 전도도 감소 등 증가 ENaC 종속 나트륨 전도성, CF epithelia의 특징 이다. 전 결함 감소 또는 폐지 repolarization 전기 그라데이션 좋아하는 염화 경과 isoprenaline (는 β-아드레날린 길 항 제는 세포내 cAMP를 증가) 또는 산림 (는 adenylate의 추가에 의해 반영 된다 있고 주 작동 근, 임상 사용을 위해 승인 되지). 후자의 결점은 비 강 점 막 (더 부정적인 PD)와 amiloride, ENaC28을 차단 하는 뇨 제 약물에 대 한 증가 응답의 기저 hyperpolarization에 의해 반영 됩니다.
CF 마우스 모델 자주 CF 연구에 사용 되 고 CF 병 리 해 부에 귀중 한 되었습니다. 요즘, 적어도 15 모델 설명된29, 중 3 개는 되는 가장 임상 관련 F508del 돌연변이30,,3132homozygous 되었습니다. 이 세30, 로테르 담의 에라스무스 대학에서 개발 중 대학교 catholique 드 루 뱅 (UCL) 실험에서 거의 20 년 동안 사용 되었습니다. Cftrtm1Eur 모델30 CF 질병의 multiorgan 이상 공부 하 고 새로운 치료 전략18,,1920의 효능을 테스트 하는 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 21. 동안 또는 후 초기 수많은 문제가 발생할 수 있습니다 (< 24 h) 쥐에서 비 강 PD 테스트. 이 논문에서는, broncho-코에 끼얹는다 솔루션의 포부를 피하는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류 및 측정값에 대 한 유지에 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 되어 있습니다. 테스트의 끝에 동물 보호, 빠르게 반전 하는 완전 한 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약물의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 설명 이기도 합니다. 이러한 절차 자발적 호흡 마우스, 감소 테스트 관련 사망률과 같은 동물에 테스트 반복에 신뢰성 높은 측정을 허용 합니다. 비 강 PD 테스트와 야생-타입 마우스는 CF에서에서 가져온 대표적인 데이터는 표시 하 고 논의.
Murine 코 PD 테스트 프로토콜은 3 개의 회의에 보고: 평가 및 관리 하기 전에, 하는 동안, 그리고 테스트 후. 사전 테스트 평가 및 관리, 지속적인 비 강 관류에 대 한 사용 되는 솔루션의 이중 루멘 비 강 카 테 터의 준비의 프로토콜 자세히 설명 되어 있습니다. 평가 시험의 관리 부분 동안 실험 설정 및 마우스의 처리는 일 분 해 부. 마지막으로, 전체 동물 복구를 향상 시키기 위해 테스트의 끝에 동물의 관리를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Portex polyethylene tube&amp;nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD</td><td>to prepare capillary tubes for nasal probe</td></tr><tr><td>Electrode cream</td><td>Parker, Fairfield, NJ, USA</td><td>Redux cream</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrodes</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, USA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>measuring and reference electrodes</td></tr><tr><td>amiloride hydrochloride</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>A7410</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>F6886</td><td>to prepare perfusion solutions</td></tr><tr><td>Knick Portamess voltmeter</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Portavo 904 pH</td><td>to measure potential difference</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&amp;nbsp;</td><td>Elektronisch Me&amp;beta;ger&amp;auml;te, Berlin, Germany</td><td>Paraly SW112 software</td><td>to capture potential difference data</td></tr><tr><td>midazolam&amp;nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Belgium</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>to serve as anaesthetic premedication</td></tr><tr><td>fentanyl</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>medetomidine</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finland</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>droperidol&amp;nbsp;</td><td>Janssen&amp;nbsp; Cilag, Berchem, Belgium</td><td>Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>clonidine&amp;nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td><td>to serve as anaesthetic medication</td></tr><tr><td>refernce IV catheter</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, USA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>to build electrode bridges</td></tr><tr><td>forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine science Tools, Heidelberg, Germany</td><td>Dumont #5, Fine science Tools</td><td>to place the nasal catheter</td></tr><tr><td>naloxone&amp;nbsp;</td><td>Braun Medical, Brussels, Belgium</td><td>Narcan, 0.4 mg/ml</td><td>to serve as anaesthetic antagonist</td></tr><tr><td>atipamezole&amp;nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Belgium</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>to serve as a medetomedine specific antidote&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heating pads&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>to avoid hypothermia during and after the test</td></tr><tr><td>Peristaltic pump P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Sweden</td><td>18111091</td><td>to perfuse solutions in the mouse nose</td></tr><tr><td>cyanoacrylate glue</td><td>Loctite, Henkel, D&amp;uuml;sseldorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>super glue 3</td><td>to glue together two capillary tubes&amp;nbsp; for nasal probe</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Na gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconate</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>BD needle&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>BD 26G (0.45x10 mm)</td><td>intraperitoneal injection</td></tr></tbody></table>

nasal potential difference to quantify trans-epithelial ion transport in mice

비 강 잠재적인 차이 테스트 낭 성 섬유 증 (CF)의 진단에 도움을 거의 3 수십 년 동안 사용 되었습니다. 그것은의 경우에 도움이 될 감쇠, 일반적으로 나중에 진단 하는 CF와 CF 관련 장애 vas deferens, 특 발성 만성 췌 장 염, 알레르기의 선 천 성 양측 부재 등의 oligo 또는 모노 증상 형태 입증 bronchopulmonary aspergillosis, 그리고 기관지 확장 증입니다. 임상 및 전 임상 설정에서 테스트로 cf. Adapting 마우스를 테스트에 대 한 타겟된 치료 전략에 대 한 응답을 측정 하는 바이오 마커 도전 이며 관련된 사망률을 수반할 수 있습니다 사용 되었습니다. 이 문서는 비 강 카 테 터에 현장에서 지속적인 관류에 대 한 유지 하는 데 필요한 마 취의 적절 한 깊이 설명 합니다. 그것을 코에 끼얹는다 솔루션의 broncho-열망을 피하기 위해 조치를 나열 합니다. 그것은 또한 빠르게 반전 하는 전체 복구는 동물의 마 취로 이어지는 마 취 약의 해독의 조합의 관리를 포함 하 여 테스트의 끝에서 동물 관리를 설명 합니다. 대표적인 데이터는 CF와 CF와 CF 비 사이 차별 테스트 야생-타입 마우스 쇼에서 가져온. 모두, 여기에 설명 된 프로토콜 신뢰할 수 있는 측정 가능 줄이면서 동일한 동물에 여러 테스트로 서 저절로 호흡 쥐, 트랜스 상피 나트륨과 염화 물 전송기의 기능 상태의 테스트 관련 사망입니다.

CF에서 특성 이온 수송 이상을 설명 하기 위해 비 강 PD 측정 수행한 다음 위에서 설명한 F508del CF 마우스와의 브뤼셀 식민지의 유전 배경 FVB/129의 야생 유형 제어 프로토콜 Cftrtm1Eur 마우스30. 가장 일반적인 및 가장 심각한 F508del CFTR 돌연변이23,,2425, 중 하나를 품고이 임상 관련 ?...

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Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

여기, 선물이 쥐에서 코 전위차를 측정 하는 프로토콜. 테스트는 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 및 상피 나트륨 채널 같은 막 횡단 이온 전송기의 기능을 단정. 그것은 낭 성 섬유 증에 대 한 새로운 치료의 효능을 평가 하기 위해 중요 합니다.

마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.7K 조회수.  Université Catholique de Louvain. 여기, 선물이 쥐에서 코 전위차를 측정 하는 프로토콜. 테스트는 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 및 상피 나트륨 채널 같은 막 횡단 이온 전송기의 기능을 단정. 그것은 낭 성 섬유 증에 대 한 새로운 치료의 효능을 평가 하기 위해 중요 합니다.

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

연구

생체공학

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

신경과학

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

뇌의 세포 외 공간의 부피비와 비틀림을 정량화하기위한 테트라 메틸 암모늄을 이용한 실시간 이온 도입

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and the epithelial sodium channel (ENaC) function are monitored by the change in voltage across the nasal epithelium after the superfusion of solutions that modify ion channel activity. This is enabled by the measurement of the potential difference between the subcutaneous compartment and the airway epithelium in the nostril, utilizing a catheter in contact with the inferior nasal turbinate.
The test allows the measurement of the stable baseline voltage and the successive net voltage changes after perfusion of 100 &#181;M amiloride, an inhibitor of Na+ reabsorption in Ringer&#39;s solution; a chloride-free solution containing amiloride to drive chloride secretion and 10 &#181;M isoproterenol in a chloride-free solution with amiloride to stimulate the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent chloride conductance related to CFTR.
This technique has the advantage of demonstrating the electrophysiological properties of two key components establishing the hydration of the airway surface liquid of the respiratory epithelium, ENaC, and CFTR. Therefore, it is a useful research tool for phase 2 and proof of concept trials of agents that target CFTR and ENaC activity for the treatment of cystic fibrosis (CF) lung disease. It is also a key follow-up procedure to establish CFTR dysfunction when genetic testing and sweat testing are equivocal. Unlike sweat chloride, the test is relatively more time consuming and costly. It also requires operator training and expertise to conduct the test effectively. Inter- and intra-subject variability has been reported in this technique especially in young or uncooperative subjects. To assist with this concern, interpretation has been improved through a recently validated algorithm.

Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference NPD

Here, we present a standardized protocol to measure the nasal potential difference (NPD). Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and epithelial sodium channel (ENaC) function are evaluated by the change in the voltage across the nasal epithelium after superfusion of solutions that modify ion channel activity, providing an outcome measure.

코 막 Transepithelial 잠재력 차이 (NPD)의 표준화 된 측정

We describe a standardized measurement of nasal potential difference (NPD). In this technique, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ...

의학

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

표준화된 장 루프 모델을 사용하여 마우스에서 장 투과성 및 호중구 환전 이동의 기능 평가

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

면역학 및 감염병학

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

생물학

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog skin. Since then, this technique has been applied to many different tissues to study the physiological parameters of transport across membranes. The Ussing chamber method is preferable to other methods because native tissue can be used, making it more applicable to what is happening in vivo. However, because native tissue is used, throughput is low, time is limited, and tissue preparation requires skill and training. These chambers have been used to study specific transporter proteins in various tissues, understand disease pathophysiology such as in Cystic Fibrosis, study drug transport and uptake, and especially contributed to the understanding of nutrient transport in the intestine. Given the whole epithelial transport process of a tissue, not only transepithelial pathways, but also paracellular pathways are important. Tight junctions are a key determinant of tissue specific paracellular permeability across the intestine. In this article, the Ussing chamber technique will be used to assess paracellular permselectivity of ions by measuring transepithelial conductance and dilution potentials.

Intestinal epithelium confers not only nutrient absorption but protection against noxious substances. The apical-most epithelial intercellular junction, i.e., the tight junction, regulates paracellular solute and ion permeability. Here, a protocol for the preparation of mucosal sheets and assessment of the ion selectivity of tight junctions using Ussing chamber technique is described.

챔버 기술을 사용하여 기본 조직의 장 타이트 접합 장벽 및 이온 투과성의 기능 평가

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and differentiated into a pseudo-stratified epithelium in air-liquid interface conditions to quantify cyclic AMP-mediated Chloride (Cl-) transport as an index of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) function. If critical steps such as quality of nasal brushing and cell density upon cryopreservation are performed efficiently, HNE cells can be successfully biobanked. Moreover, short-circuit current studies demonstrate that freeze-thawing does not significantly modify HNE cells&#39; electrophysiological properties and response to CFTR modulators. In the culture conditions used in this study, when less than 2 x 106 cells are frozen per cryovial, the failure rate is very high. We recommend freezing at least 3 x 106 cells per cryovial. We show that dual therapies combining a CFTR corrector with a CFTR potentiator have a comparable correction efficacy for CFTR activity in F508del-homozygous HNE cells. Triple therapy VX-445 + VX-661 + VX-770 significantly increased correction of CFTR activity compared to dual therapy VX-809 + VX-770. The measure of CFTR activity in HNE cells is a promising pre-clinical biomarker useful to guide CFTR modulator therapy.

Here we describe the isolation, amplification, and differentiation of primary human nasal epithelial (HNE) cells at the air-liquid interface and a biobanking protocol allowing to successfully freeze and then thaw amplified HNE. The protocol analyzes electrophysiological properties of differentiated HNE cells and CFTR-related chloride secretion correction upon different modulator treatments.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

A Fluorescence-Based Assay of Membrane Potential for High-Throughput Functional Study of Two Endogenous Ion Channels in Two Epithelial Cell Lines

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery campaigns targeting recombinant ion channel proteins overexpressed in cells such as HEK-293 cells. However, there is increasing emphasis on the use of tissue-relevant cell lines for studying the effects of small molecule interventions. The following protocol describes the adaptation of a fluorescence-based membrane potential assay for the study of ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines. The membrane potential assay details a high-throughput assay for chloride channel activity of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in two commonly studied epithelial cell lines, Caco-2 and Calu-3. In addition, this paper describes a novel application of this system to measure the activity of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) in a high-throughput format in the same epithelial cell lines. Together, these fluorescence-based assays provide a robust and flexible platform for studying small molecule modulators, targeting two epithelial channels in a relevant cellular context.

This protocol describes a method for the study of electrogenic membrane proteins by measuring changes in membrane potential. This assay provides a platform for the functional readout of multiple ion channels endogenously expressed in epithelial cell lines.

두 개의 상피 세포주에서 두 개의 내인성 이온 채널에 대한 고처리량 기능 연구를 위한 막 전위의 형광 기반 분석

Fluorescence-based studies are suitable for high-throughput plate reader assays of cells in culture. They have been commonly employed for drug discovery ...