The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + 죽이는 선택 <ol><li> 세포주 <ol><li> 안정적 NHE 결핍 세포를 형질 감염 (예, CCL39 유래 PS120 세포주 16) 섬유 모세포 세포주에서 효율적인 형질 전환 수율 및 선택을 생산할 예정 포유 동물 발현 벡터 및 형질 전환 방법의 조합을 사용. 참고 : 여러 해 동안 인산 칼슘 침전 (19)가 좋은 형질 전환 수율로 사용되었다. 여기에는 리포 펙 타민 같은 상용 시약에 의해 최근 대체되었습니다, 형질은 제조업체의 지침에 따라 수행된다. </li></ol></li><li> 솔루션 <ol><li> 아래 설명 세 멸균 솔루션을 준비합니다. 여과 (0.22 μm의) 이러한 솔루션을 소독. <ol><li> 50 mM의 CL NH 4, 70 mM의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 5 밀리미터 GL 구성된 NH 4 + 로딩 용액을 준비 (PH 7.4)ucose 및 pH가 7.4에서 15 mM의 MOPS. </li><li> 120 mM의 염화 콜린 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 7.0에서 15 mM의 HEPES 이루어지는 세정액 (PH 7.0)을 준비한다. </li><li> pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 구성된 복구 솔루션 (PH 7.4)을 준비한다. </li></ol></li></ol></li><li> CO 2가 훼손 될 수 해당 버퍼링 될 것이다 5 %로서, - 선택을 시작하기 전에 ( &quot;무료&quot;인큐베이터 CO 2 라) 외부 탱크로부터 추가 CO 2, 37 ℃에서 사용될 수있다 세포 배양기를 얻기 산성화. 약 2 × 108 세포 (전형적으로 약 20 합류 100mm 플레이트)에 관심 업 NHE 발현 세포주를 증폭. </li><li> H는 절차를 죽이는 + : <ol><li> (3)에 로딩 용액에 1 시간 동안 관심 NHE 세포를 발현 세포를 부화CO 2 - 무료 인큐베이터에서 7 ° C. </li><li> 로딩 솔루션을 대기음 후 상기-세정액에 두 번 씻어 내야합니다. 산성화를 생성하는 가파른 NH 4 + 구배의 생성을 저해 할 잔여 세포 외 NH 4 (CL)을 제거하기 위해 효율적으로이 단계를 수행합니다. </li><li> 흡인 린스 매질을 제거하고 프리 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 다시 복구 솔루션에서 한 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 일반 배양 배지 (7.5 % FCS 전형적 DMEM)와 복구 매체를 장착하고 (5 % CO 2 및 95 %의 공기가 공급되는 습한 공기 조건에서 37 ° C)를 표준 배양 조건에서 세포를 성장한다. </li></ol></li><li> 안정적인 클론이 등장 할 때까지 일주일에 두 번 선택의이주기를 반복합니다. 참고 : 세포 배양 및 선택 조건에 관한 특별한주의하십시오. 작품의 달은 오 더 경향이 오염에 의해 파괴 될 수있다문화와 반복 세포 조작의 긴 기간 후 ccur. <ol><li> 여기서, 클론을 증폭하고 상기와 같은 개별적 2-3 절에서 설명한 이들의 특성, 또는 특성화 전에 세포 집단을 생성하기 위해 이들을 함께 풀로 여부를 선택한다. </li></ol></li><li> 카운터 선택 부모의 산에 민감한 표현형 (그림 1B)에 복귀 한 수 사람들을하여 산성화 방지 세포를 유지하기 위해 가끔 선택 (약 2 주에 1 회)를 적용합니다. </li></ol> 2. 세포 내 pH 측정 2.1) 형광의 pH 이미징 <ol><li> 490 nm에서 흥분 할 때의 pH 민감하고 제조 업체의 프로토콜 다음 445 nm의 isosbestic 점을, 소유 비율 계량 pH 민감성 형광 염료 BCECF / AM을 사용합니다. <ol><li> 또한, 제조 업체의 프로토콜 다음 다른 pH 민감성 프로브를 사용합니다. </li></ol></li><li> 영상 설정 콘을 사용하여고감도 비디오 카메라에 결합 도립 현미경 sisting. 450 nm의 여기에 적합한 석영 중립 밀도 필터와 결합 490 nm의 협 대역 간섭 필터 세트를 착용. <ol><li> 가능하면 비도 모두 λ1 및 / 또는 λ2를 들면, 어느 포화 또는 너무 낮게 설정된 기저 형광 값을 피하기 1에 가까워 지도록, λ1과 λ2 위해 설치 필적 형광 값 필터 및 조명 조건의 적절한 세트를 사용. 이 세포 내 pH가 변화하고 있지만 비율이 검출되지 수 있습니다으로 다음 중요한 유물을 얻을 수 있습니다. 참고 :이 시스템에 적절한 발광 파장 (BCECF 535 ㎚)에서 빠른 관류, 시간 경과에 두 개의 상기 파장에서 여기 및 인수를 사용하도록 설정해야합니다. 소프트웨어는 자동 데이터 수집 및 저장을 가능하게하여 시스템을 장비. </li></ol></li></ol> NHE 앞으로 활동 2.2) 측정 (압출 성형세포질에서 양성자) <ol><li> NH 4 + 로딩 용액에 1 시간 배양 세포 산성화 CO 2의 부재 (단계 1.4 참조). </li><li> 마지막 5 분 동안 용액에 BCECF-AM (5 μM 최종 농도)를 첨가하고 세포 외 프로브를 제거 NH 4 + 로딩 용액을 헹군다. </li><li> 현미경 세포를 마운트하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. 세정액 (위 참조) 관류. 이 산성화에 대응 형광의 드롭을 초래한다. </li><li> pH가 안정화되면, 리 + / H +, 나트륨 + / H의 + 또는 K + / H +로 교환하여 pH 매개 회복율을 측정하기 위해 아래에 주어진 임의의 솔루션을 관류. 각 솔루션은 잠재적 인 커플 링 양이온 H + 교환을 테스트 할 포함되어 있습니다. 그 중 하나가 이동하는 경우, 이는 corresp 것이다 495 nm에서의 형광 증가를 초래한다번째 세포 내 pH를 높이려면 : pH가 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 125 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES </li></ol> NHE 역 활동의 2.3) 측정 참고 : 여기 원리는 횡단 이온 그라디언트를 반전하는 것입니다. <ol><li> 측정에 앞서, 관심있는 세포 내 양이온과로드 셀 (아래 참조). </li><li> BCECF / AM (단계 참조 2.2.2)와 5 분 동안 그들을 품어; 그들을 씻어 비디오 현미경을 탑재합니다. </li><li> 로딩 솔루션을 관류하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. </li><li> 베이스 라인 안정화, 이미지 세포가 세포 외 산성 매체가 120m를 포함 관류하는 pH를 변화 후M의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 6.5에서 15 mM의 MES에. </li><li> LiCl을 로딩, pH를 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어지는 용액에서 2 시간 동안 세포를 배양한다. 원자 흡광 법에 의해 측정 된 세포 내 리튬은 약 60 mm의 값을 산출한다. </li><li> 나트륨 + 로딩, 1 밀리미터의 흡수를의 존재 하에서 pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어진 용액에 2 시간 동안 세포를 배양한다 나 / K ATPase의 차단합니다. 이러한 조건에서, 세포 내 나트륨 + 농도는 40 mM의 범위이다. 주 : 세포질 K + 농도가 140 mM이 범위이고 외향 K + - 지향 구배 달성하는 것이 쉽기 때문에 K + 로딩이 필요하지 않다. </li></ol> 2.4) 데이터 처리 및 교정: 주 :이 단계는 순방향 및 역방향 측정 모두에 적용된다. <ol><li> 각 실험의 끝에, 6.5와 7.4 사이의 pH 값으로 조정 된 140 mM의 KCl을 20 mM의 HEPES 및 5 μM의 nigericin의 용액으로 세포를 관류. </li><li> 텍스트 형식으로 아래의 이미지에서 형광 측정과 같은 데이터 (회색 수준의 강도 수준을 나타냄) 및 수출을 수집하고 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 아래에 설명 취급합니다. </li><li> 각각의 개별 셀, 또는 다음의 식을 이용하여 관심 영역에 대한 세포 내 pH 값을 계산한다 : pH가의 pKa + (로그 (R이-Rmin을) / (R 최대 -R가)) × F의 분 (λ2) / F 최대 (λ2) </li><li> F의 분 (λ2) / F 엄마 X (λ2) 실험에 걸쳐 450 nm의 형광의 감소의 결과로, 프로브 표백 또는 누설이있는 경우 비율을 사용합니다. 그러나 이것은 매우 드문 데에 사용 된 조건에서 관찰 없습니다cribed 실험. </li><li> 교정 데이터는 각각 pH 측정의 끝에 존재하는 바와 같이 계산 된 값에 대응하는 캘리브레이션에 사용되는 pH 값에서 다른지를 확인한다. 이 경우라면, 다음과 같은 절차를 사용하여 교정에 모두 실험적으로 결정된 pH 값 조정 : <ol><li> 다음 몫 (Q, 보정 값의 측정 값 / 차이의 차이)를 계산. 계산 된 값이 대응하는 캘리브레이션 값을 같게되도록 Q.함으​​로써 전체 데이터 세트가 부가 또는 감산함으로써 최종 조정을 곱한다. </li></ol></li></ol> 빠른 리 + 통풍 관에 의해 NHE7의 초기 요금 3. 측정 <ol><li> 멀티 웰 플레이트 상에 종자 세포 (6- 웰-24) 또는 20 이상에서 설명한 교대 nigericin / 소 혈청 알부민 (BSA) 산성화 바와 NH 4 + 로딩 기술을 사용하여이를 산성화. </li><l난&gt; 린스 플레이트 배 빠르게 상술 세정액을 이용하고, 원하는 양 (약간 km 값 이하) 1-10 mM의 리튬을 함유하는 흡수 용액의 세포와 양이온의 목적하는 농도 및 / 또는 관심의 억제제를 부화 시간. </li><li> 해당 전송 초기 속도 조건에서 작동하기 위해 짧고 일관된 흡수 기간 (일반적으로 1 분 이하)를 유지한다. 또한 흡수에 사용되는 모든 솔루션이 등장 있는지 확인하십시오. </li><li> 흡수 시간의 끝에서, 신중하게 흡수 매질을 제거하고 얼음 - 냉각 된 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 네 번 세척 하였다. (그 중 네 적합 미만 10 초) 리튬 유출을 막기 위해 가능한 한 빨리 이러한 세척을 수행한다. </li><li> 를 Lyse 25 % 질산에 세포. 25 % 질산 웰 당 250 μL를 적용하고 그 후, 피펫 팁의 단부와 각 웰 스크랩 새로운 미시간 전체 웰 현탁액을 전송하고, 적어도 1 시간 방치crocentrifuge 튜브. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 15,000 XG (실온)에서 5 분간 원심 분리하여이를 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 이동 분해물. </li><li> 원자 흡수 분광법 (21)에 의해 상층 액의 리튬 함량을 측정. 참고 : 다른 기업들이 리튬 중공 음극 램프를 장착 할 필요가 원자 흡수 분광기를 제공합니다. 이 기계는 매우 정밀한뿐만 아니라 매우 섬세으로 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol>

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	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 부위 특이 적 변이에 의해 자신의 기본 순서를 변경하지 않고 세포막에서 세포 나 + / H + 교환기를 발현하는 세포를 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 교환기 이제 특성화 될 수있다. 이 방법은 세포막에 소포 나 + / H + 교환기를 표현한다 세포주를 선택하는 양성자 세포의 세포 독성에 기초한다. 여기에는 리튬 +,</su...

대부분의 세포 내 구획 성숙, 인신 매매, 단백질이나 호르몬과로드 신경 전달 물질의 재활용을위한 핵심 매개 변수입니다 산성 내강의 pH를 표시합니다. 그것은 세포질 포성 내용 사이의 pH 구배 소포 CLC 클로라이드 컨베이어 (2)에 결합 된 액포 H + -ATPase를 (1)에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 두 녹아웃 (KO) 마우스 및 인간 환자에서, 이들 컨베이어의 중요성 3-6 유전자 돌연변이로 인한 무거운 표현형에 의해 강조되었다. 나트륨 수소 교환기 SLC9A 가족의 구성원, 또한 나트륨 + / H + 교환기 NHEs 불리는 세포 내 pH 및 세포 볼륨 조절 키 이펙터에서뿐만 아니라 상피 걸쳐 산 - 염기 당량의 vectorial 수송 것으로 나타났다 . 세포막 NHEs 외에도 세 고도로 + / H + 기, NHE 6, 7은 Na 보존9는 트랜스 - 골지 네트워크에서 초기 엔도 좀 (7)로 표현된다. 유전자의 돌연변이는 엔젤 형 또는 크리스찬 증후군 8-9, 가족 기반의 자폐증 (10)와 주의력 결핍 과잉 행동 장애 11-12로 연결되어있다. 이 교환기는 또한 알츠하이머 병의 감수성 (13)과 X-링크 된 정신 지체 연속 유전자와 같은 신경 퇴행성 문제 (14) 증후군에 참여했습니다. 함께 찍은, 이러한 연구는 두뇌 발달 및 / 또는 기능에서 이러한 세포 내 NHEs의 중요성을 강조 표시합니다. 이러한 기의 세포 내 현지화 정확한 자신의 이온 선택성 측정, 전송 방향, 운동 매개 변수 및 규제를 방지 할 수 있습니다. 세포 내 구획에서 발현 모든 컨베이어의 경우와 같이, 자신의 생화학 활동을 평가하기 때문에 완전히 생리적 역할과 mechan을 이해하는 것은 매우 어렵다ISMS는 병적 인 의미를 기본. 높은 세포질 K + 농도에 따라, 가장 일반적으로 받아 들여지는 가설은 K + 결합 된 양성자 유출 컨베이어로 작업하는 것이 었습니다. 이 정상 상태 포성 산도를 유지하기 위해 V--ATPase를 펌핑하여 양성자를 상쇄 할 수있다 등의 양자 누출의 존재가 가정되었다. 이 시각 문서의 목적은 세포막에서 이러한 소포 ​​수송차를 표현하고, (ⅱ) 이러한 수송의 기능을 측정하는 두 개의 독립적 인 방법을 보여 세포주의 유전을 선택할 수 있도록하는 방법을 설명하기 (I)이다. 세 년 전, Pouysségur과 프란은 NHE 가족 (15)의 구성원의 분자 클로닝 및 특성을 활성화 유전 적 접근 방식을 개척했다. 이 스크리닝 방법으로 세포 독성 양성자에 기초 하였다. 첫 번째 단계는 결핍 세포주를 수득 하였다어떤 나 + / H +의 교환이 전달체 가역성을 이용 세포막에서 발현. 섬유 아세포 (CCL39 세포주) 또는 리튬 나트륨 + + 미리로드 한 후 2 시간 동안 세포 외 산성 매질 (PH 6.5)에 넣었다. 이것은 기능적 나 + / H + 교환을 발현하는 세포의 죽음과 antiporter 결핍 세포 (PS120 세포주) (16)의 선택되었다. 중탄산없는 배지에서 배양하면, 이들 세포는 급성 세포 내 산성화에 매우 민감하다. 이러한 세포는 세포 급성 acidifications에 제출하는 경우 결과적으로, 세포막에서 기능적 양성자 유출기구의 발현 양 (도 17 참조)를 선택한다. 이러한 기술은 산성화 세포막에서 WT 세포 NHEs의 강제 발현을 활성화 결함 트래 피킹 세포주를 분리 할 수​​있다. 진핵 세포 나 + / H로교환기 electroneutral 있습니다 +, 그들은 채널을 측정하기 위해 큰 성공과 함께 사용 된 전기 생리 학적 방법에 의해 측정 할 수 없습니다. 이 원고 따라서 세포 내 pH 측정과 리튬의 빠른 흡수 동력학하여 교환기의 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 기본 개념은 동일한하는, 그 선택 부 위해 개발 된 많은 프로세스는 또한 작용 성 측정에 사용되는 직접 통지 흥미 롭다. 흥미롭게도,이 논문에 설명 된 접근법을 사용하여 선택된 세포주에 존재 매매 결함은 소낭 칼륨 채널 TWIK1 18과 같이 세포막에 다른 소포의 단백질보다 발현에 이르게 것을 관찰했다. 이것은 소포 막 관통 단백질 일반적인 고정 결함기구의 선택을 향해 지적한다. 그러므로 이러한 선택 절차 및 5 월의 생성 세포세포 내 구획의 막 단백질에 근무하는 과학적인 지역 사회를위한 유망한 도구를 구성한다. 뿐만 아니라 여기에 제시된 측정 기술은 다른 비 electrogenic 운송을 연구 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

엔도 솜 산성화는 시냅스 소포의 단백질 분해 및 재활용, 둔감 수용체 및 신경 전달 물질의 로딩 등의 처리, 다양한 중요하다. 이 산성화는 CLC 염화 컨베이어에 결합 된 양성자 -ATPase를,에 의해 매개되는 기술되어있다. electroneutral 양성자 수송을 고도로 보존, ​​나 + / H + 교환기 (NHE) 6, 7, 9는 이러한 구획에서 표현된다. 유전자의 돌연변이는 인간의인지 적, 신경 퇴행성 질환과 연결되어있다. 자신의 세포 내 현지화 상세한 기능 특성을 방지 것처럼 역설적으로 자신의 역할은 애매 남아있다. 이 논문은이 문제를 해결하는 방법을 나타내고있다. 이것은 세포막에서 세포를 유지하여 NHEs 급성 세포질 산성화 생존 가능한 돌연변이 세포주의 선택으로 구성. 그러므로 이온 선택성 및 활성을 측정하기 위해 두 개의 상보적인 프로토콜을 도시(ⅰ) 하나의 비디오 형광 현미경을 사용하여 세포 내 pH 측정에 기초하고, (ⅱ) 하나의 리튬의 빠른 흡수 동력학에 기초한 이러한 교환기. 이러한 프로토콜은 다른 비 electrogenic 수송차를 측정하도록 외삽 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 선택 절차는 세포 표현형으로 고정 불량 셀을 생성한다. 따라서, 이러한 세포는 세포막에서 다른 소포 막 단백질을 발현한다. 여기에 묘사 된 실험 전략은 따라서 다음 소낭 + / H + 선택에 사용 교환기 나트륨과 함께 ​​세포막에서 발현된다 다른 세포 내 단백질을 연구하기 위해 잠재적으로 강력한 도구를 구성 할 수있다.

선택 : 도 1a에 도시 된 바와 같이 H + 죽이는 선택은, 암모늄 약 염기의 확산에 기초한다. 약염기의 pH 및 세포 내에서 산의 확산 효과는 월터 붕소 및 공동 (22)에 의해 개척되었다. 우아한 아이디어는 긍정적 인 유전자 선택을위한 치명적인 산성화가 다음 자크 Pouysségur (17)에 의해 개발 된 생산하는이 현상을 사용할 수 있습니다. 이러한 프...

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K 조회수.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

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Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

전기 화학 탐지의 중수소 활동적인 동위 원소 효과 Shewanella oneidensis 미스터-1에서 세포 외 전자 전송에

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

연구

생화학

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision can be easily assessed by a comparative assay using NADH or succinate as electron donors in frozen-thawed mitochondria, in which cytochrome c (cyt c) reduction is measured. The assay relies on the effect of Na+ on the IMM, decreasing its fluidity. Here, we present a protocol to measure NADH-cyt c oxidoreductase activity and succinate-cyt c oxidoreductase activities in the presence of NaCl or KCl. The reactions, which rely on the mixture of reagents in a cuvette in a stepwise manner, are measured spectrophotometrically during 4 min in the presence of Na+ or K+. The same mixture is performed in parallel in the presence of the specific enzyme inhibitors in order to subtract the unspecific change in absorbance. NADH-cyt c oxidoreductase activity does not decrease in the presence of any of these cations. However, succinate-cyt c oxidoreductase activity decreases in the presence of NaCl. This simple experiment highlights: 1) the effect of Na+ in decreasing IMM fluidity and CoQ transfer; 2) that supercomplex I+III2 protects ubiquinone (CoQ) transfer from being affected by lowering IMM fluidity; 3) that CoQ transfer between CI and CIII is functionally different from CoQ transfer between CII and CIII. These facts support the existence of functionally differentiated CoQ pools in the IMM and show that they can be regulated by the changing Na+ environment of mitochondria.

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

This protocol describes a comparative assay, using mitochondrial complex activities CI+CIII and CII+CIII in the presence or absence of Na+, to study the existence of partially segmented functional CoQ pools.

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively in the neuron and is essential for the proper functioning of Cl- homeostasis and consequently functional GABAergic inhibition. Failure in proper regulation of KCC2 is deleterious and has been associated with the prevalence of several neurological diseases, including epilepsy. There has been considerable progress with regard to understanding the mechanisms involved in the regulation of KCC2, accredited to the development of techniques that enable researchers to study its functions and activities; either via direct (assessing kinase regulatory sites phosphorylation) or indirect (observing and monitoring GABA activity) investigations. Here, the protocol highlights how to investigate KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites - Thr906 and Thr1007- using western blotting technique. There are other classic methods used to directly measure KCC2 activity, such as rubidium ion and thallium ion uptake assay. Further techniques such as patch-clamp-electrophysiology are used to measure GABA activity; hence, indirectly reflecting activated and/or inactivated KCC2 as informed by the assessment of intracellular chloride ion homeostasis. A few of these additional techniques will be briefly discussed in this manuscript.

The present protocol highlights the application of western blotting technique to study the functions and activities of neuronal K-Cl co-transporter KCC2. The protocol describes the investigation of KCC2 phosphorylation at kinase regulatory sites Thr906/1007 via western blotting. Also, additional methods to confirm KCC2 activity are briefly highlighted in this text.

웨스턴 블로팅을 이용한 뉴런 K-Cl 공동수송체 KCC2의 기능 및 활성 연구

Potassium chloride cotransporters 2 (KCC2) is a member of the solute carrier family 12 (SLC12) of cation-chloride-cotransporters (CCCs), found exclusively ...

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

주파수 구성 요소를 사용하는 이온 채널 IV 곡선의 재현부

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

생물학

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

신경과학

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

만들기, 테스트 및 성인 뇌의 조직 조각에 칼륨 이온 선택적 Microelectrodes를 사용 하 여

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

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