Name: use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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우리는 본 논문에 사용 된 센서를 개발에 자신의 작품에 대한 Sarissa의 생명을 주셔서 감사합니다. 이 연구는 국립 심장, 폐에 의해 지원되었다, 및 혈액 연구소는 HL108880 (A. Staruschenko)를 부여, HL 116,264 (A. 카 울리) 및 HL 122,662 (A. Staruschenko 및 A. 카 울리)의 의과 대학 재정 지원 사업 위스콘신 연구 업무위원회 # 9306830 (O. Palygin)과 건강한 위스콘신 연구 및 교육 프로그램 # 9520217를 전진, 국립 신장 재단의 젊은 연구자 그랜트 (O. Palygin).

실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 부착 된 다음 동물 절차. 이전 승인 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)로부터 얻은 것입니다. 참고 : 센서 제조업체 지침의 검토는 실험 설계 및 사용 전에 동안 수행해야합니다. 센서를 사용하는 경우이 지침을 따르는 것은 최적의 결과를 생성합니다. 1. 센서 교정 <ol><li> 실험 시작 전에 신선한 원액을 준비한다. </li><li> 10 mM의 NAPI 버퍼, 100 mM의 NaCl을, 1 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 글리세롤을 포함하는 버퍼를 작성합니다. NaOH를 사용하여 7.4으로 산도를 조정합니다. 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li><li> -20 ℃에서 보관 콘텐츠 ATP 농도 (100 mm)를 사용하여, 버퍼 A. 90 μL에 10 μL 스톡을 첨가하여 10 mM의 ATP 신선한 교정 액을 만들 </li><li> T에의 팁 (그림 2)을 배치하여 ATP 센서를 재수2-8 ℃에서 적어도 10 분 동안 버퍼를 포함하는 그 재수 챔버. 주 : 재수 후, 센서는 20 초 동안 공기에 노출되지 않아야하거나, 센서의 감도가 감소 될 수있다. 공기에 장시간 노출이 예상되는 경우, 글리세롤의 솔루션으로 간단히 센서를 찍어. 센서는 여러 실험을 위해 사용될 수 있지만, 이들은 센서 재수 같은 날에 발생한다. 센서는 최대 24 시간 동안 완충액 A와 재수 화 챔버 내에 저장 될 수있다. </li><li> 듀얼 채널 텐쇼 (그림 3)의 전원을 켜고 녹화 시스템 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 버퍼 A. 찾는 3 ㎖ 교정 챔버로 기준 전극과 교정 챔버를 준비한다. 다음, 재수 실에서 각 센서를 가지고 조작에 부착하고 교정 실 솔루션에 삽입합니다. 참고 : 교정 실 같은 표준 실리콘 코팅 된 배양 접시를 사용합니다. 모든 교정과 일을 수행고성능 실험실 공기 테이블에 패러데이 케이지 udies는 amperometry 녹음 (그림 4) 동안 신호의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 교정은 가장 가능한 데이터 수집의 시작에 가깝게 수행됩니다. 생체 내 응용을 위해 교정을위한 최적의 시간은 동물의 수술 후 회복 기간이다. </li><li> 예 생체 내 교정 <ol><li> 10 사이클 100 mV / 초의 속도에서 +500 MV에 -500 mV 이상 센서를 순환시킴으로써 교정 챔버 내의 순환 전압 전류 법을 수행한다. 이것은 크게 센서의 감도를 향상시킨다. 10 사이클에서 관찰 된 흔적은 그림 5를 참조하십시오. </li><li> 마지막주기 후 600 MV에 센서를 극화. 센서 전류 점근선에 소멸한다. 꾸준한 독서는 최소 5 분 후에 얻을 수있다. 제로 값을 기록한다. </li></ol></li><li> 생체 센서 교정 <ol><li> 생체 열차에 순환 전압 전류를 수행하지 마십시오RS. 대신, MV +500 30 초 동안 챔버 내의 교정을 편광 센서. 그 다음에 0 MV 텐쇼를 설정하고, 센서 전류 점근선까지 상승 할 수있다. 센서 전류는 점근선에 적어도 2 분 소요됩니다. 제로 값을 기록한다. </li></ol></li><li> 연속적으로 원하는 검출 범위를 포괄 검량선을 제조 챔버로 ATP 용액의 양 세트를 추가한다. ATP가 챔버 전체에 고르게 확산로서 ATP 용액 붕괴 뒤에 처음 센서 신호에서 날카로운 피크를 생성한다. 기록 신호 값은 신호 레벨이되면. 각 ATP 첨가 후도 6a 및도 7 트레이스 안정화 각각 생체 내 연구 모두에 대한 생체 외 및 ATP의 농도를 제안했다. 주 : 분석 물 거제를 사용하여 전극의 선택성을 확인하는 것이 중요하다. 본 프로토콜은 H &lt;대한 ATP 센서와 카탈라아제의 특이성을 테스트 apyrase 사용서브&gt; 2 O 2 신호 (도 6B). 약물이 투여되는 경우, 센서와의 반응성 측정을 연구하기 전에 결정되어야한다. </li><li> ATP 센서 (제로 수준 (그림 7)로 감소한다 ATP 응용 프로그램에 의해 생성 된 전류의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖ (89 UN / mg)의 재고에서 apyrase의 3 μl를 추가합니다. </li><li> (2 O 2 응용 프로그램이 제로 독서로 감소한다 (H)에 의해 생성 된 전류) ​​널 센서의 특이성을 테스트하기 위해 2 ㎎ / ㎖의 재고 (100 UN / mg)을에서 카탈라아제의 3 μl를 추가합니다. </li></ol> 센서 연구 2. 동물 수술 <ol><li> 생체 수술 <ol><li> 이소 플루 란 (5 % 유도, 1.5 %, 2.5 유지) / 의료용 O 2 또는 다른 승인 된 방법으로 실험 동물을 마취. (12) 동물이 지속적으로 마취의 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링해야합니다 (15)를 제공합니다. 세인트수 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. 승인 IACUC 프로토콜에 따라 동물을 안락사 :합니다. 모든 비 생존 절차의 완료시 동물 (12)의 인간적인 소멸을 위해 기흉 개흉술을 유도하여 깊게 마취 동물을 안락사. </li><li> 앙와위에서 온도 조절 수술대에 쥐를 놓습니다. 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 왼쪽 신장에 부합하는 약 5cm의 정중선을 절개하고 원위 복부 대동맥을 노출. </li><li> 복강 및 상 장간막 동맥, 이러한 동맥 위의 복부 대동맥 주위에 끈을 감싸하지만 결찰하지 않습니다. 신장 동맥 아래 복부 대동맥 주위에 두 개의 합자를 감싸. </li><li> 합자 위의 복부 대동맥을 클램프. 낮은 합자 넥타이. 폴리에틸렌 관 (PE50)와 복부 대동맥을 카테 테르를 꽂다. 두 번째 대동맥 결찰로 카테터를 고정. </li><li> 클램프를 제거하고 장간막과 복강 동맥을 결찰. 신장이 완전히 희게 때까지 2-3 분 동안 실온에서 행크스 균형 염 용액 6 ml / 분으로 신장을 관류. </li><li> 대동맥의 일부를 접속 신장 및 카테터를, 절제. 목욕 솔루션으로 가득 3 ㎖ 페트리 접시에 신장을 놓습니다. 주 : 실험 프로토콜은 RT에서 수행 될 수있다. (145)의 NaCl, 4.5의 KCl, 2의 MgCl 2, 1 염화칼슘 2, 10 HEPES, NaOH로 pH를 조정 7.35 : 목욕 솔루션은 mm 단위가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 생체 수술 <ol><li> 승인 IACUC 프로토콜을 사용하여 랫트를 마취. 생체 분석을 위해 케타민와 쥐 (20 ㎎ / ㎏ 임) 및 inactin (50 ㎎ / ㎏ IP)을 마취. 동물은 계속적으로 마취 적절한 수준을 보장하기 위해 모니터링되어야한다. 안정된 호흡과 발가락 핀치 반응은 적절한 마취를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 적절한 마취 깊이는 취득 후에드, 공기 테이블에있는 온도 조절 접지면에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. 표면을 예열하고 36 ℃로 유지되어야한다. </li><li> 적절한 마취 깊이를 유지하면서, 신장에 맞춰 중간 선 절개를 약 5cm합니다. </li><li> 편향 및 전체 신장이 보이도록 피부와 피하 조직을 고정하는 봉합사를 사용한다. 움직임 아티팩트를 최소화하기 위해 신장 컵에서 신장을 놓습니다. </li><li> 혈액량을 유지 경정맥을 통하여 1 ㎖ / 100g의 / hr이고 0.9 %의 NaCl : 2 % BSA의 IV 주입을 사용한다. 소변 수집을위한 두 요관을 Cannulate. 장소 장간막과 복강 동맥 주변의 관계 및 신장 관류 압 (도 10a)의 조작을위한 원심 aortal. </li><li> 약학 제제의 적용은 생체 내 실험을하는 동안 필요하다면, 간질 카테터 삽입 (도 10B 추천 </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. 데이터 수집 설정 <ol><li> 데이터 수집 프로그램을 열고 모두 생체과 양극 긍정적으로 생체 실험에서 극성을 설정합니다. ASCII 코드로 데이터를 저장하는 프로그램을 설정합니다. </li><li> 신장에 센서의 빠른 삽입을위한 미세 조작기를 놓습니다. 참고 : 또는 센서의 원하는 위치를 달성 할 수 있도록 미세 조작기에 부착 된 더미 프로브를 사용합니다. </li><li> 생체 데이터 취득 <ol><li> / 분으로 650 μL의 일정한 속도로 대동맥을 통해 캐 뉼러 (2.1.6)에서 욕조 용액 신장을 관류. 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 센서 삽입에 필요한 신장 캡슐을 제거합니다. </li><li> 고무 밴드 신장을 통해 묶여 핀과 실리콘 코팅 접시에 부착와 신장을 고정합니다. </li><li> 그 팁에 빠져들와 페트리 접시에 신장에 가까운 기준 전극을 배치완충 용액. </li></ol></li><li> 생체 데이터 취득에 <ol><li> 신장 컵에서 신장을 놓습니다. 동물의 변형 및 연령에 따라. 느슨하게 신장 보유 컵의 크기를도 8을 사용하여 신장 컵의 크기를 두 도표. 유사 컵 그러한 micropuncture 등 16 신장 기능의 분석에 집중 다른 생리적 접근을 위해 사용된다. 신장 컵의 위치는 동물의 호흡에 의해 생성 된 기계적인 노이즈를 제거하는 것이 중요하지만, 방해 또는 신장 관류 또는 소변의 흐름을 차단하지 않아야합니다. </li><li> 데이터 수집을 수행하기 전에 복구 시간이 45 분을 허용한다. </li><li> 26-30G 바늘을 사용하여, 신장에서 센서의 위치 및 소정의 깊이에 천공 구멍을 만든다. 스며 혈액을 제거하기 위해 표면에 구멍을시킨다. 신장의 표면에 글리세롤 솔루션을 추가합니다. 이 실험 기간 동안 마르지 신장 표면을 방지 할 수 있습니다. </li&gt; <li> 재수 실에서 제 1 센서를 제거하고는 미세 조작기에 연결합니다. 신속, 20 초 이내에, 신장에서 갓 만든 구멍에 전극을 삽입합니다. 반복 널 센서 3.5-3.9 단계를 반복합니다. </li><li> 센서에서, 신장에 약 1cm를 기준 전극을 삽입합니다. </li></ol></li><li> 텐쇼의 전원을 켜고 컴퓨터에 기록 프로그램을 활성화합니다. (9) 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. (10)가 삽입 된 카테터와 생체 신장 데이터 수집의 마지막 설정을 보여줍니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 기원 또는 임의의 다른 유사한 소프트웨어에 ASCII 데이터 파일을 가져. </li><li> 농도 현재 관계 <ol><li> 전류에 선형 농도 (X- 축)을 구축하기 위해 ATP 또는 H 2 (Y시킴으로써 행한다)의 관계를 선형 피팅 / 외삽 기능을 사용하여 </suB&gt; O 2 교정 점 (도 6 및도 7). 선형 피팅 라인 : Y = MX + B </li></ol></li><li> 농도 전류 동일시 </li><li> 세포 내 ATP에 의해 생성 된 실제 전류를 얻기 위해 ATP 센서들로부터 널 센서의 측정 흔적을 뺀다. </li><li> 4.2.1에 설명 된 교정 방정식을 사용하여 nm의 amperometry에 의해 얻어진 포장 된 ATP 값을 변환합니다. &quot;X&quot;값으로 각각 조정 전류를 가져 오기 및 Y (분석의 농도)에 대한 해결하여 ATP 센서의 감산 데이터 트레이스의 농도를 결정합니다. </li><li> 필요한 경우 유사하게, 그것의 교정 식 H 2 O 2 농도를 계산한다. </li></ol>

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이 원고의 비디오 녹화 센서는 Sarissa 생명 한정판 (코번 트리, 영국)에 의해 제공되었다.

본 프로토콜은 ATP의 향상된 시간과 공간 분해능을 제공하기 위해 개발 된 생체 관류, 격리 및 생체 내에서 혈액 관류 신장을위한 H 2 O 2 신호가. 여기에 사용되는 프로토콜과 센서 간의 차이는 약리학 적 또는 생리 학적 연구 제제 중 최적 데이터 수집을 제공한다. 프로토콜 1) 센서 교정, 2) 외과 적 절차, 3) 데이터 획득 설정, 4) 데이터 분석 이루어져있다. 이들은 수많?...

(또한 본 원고에서 센서로 참조) 효소 미세 바이오 센서는 세포와 조직 생활에 동적 신호 전달 과정을 연구하기위한 유용한 도구가되고있다. 센서는 생물학적으로 관련 농도에서 세포 신호 분자의 시공간적 해상도를 증가 제공합니다. 대신 샘플링하고 장시간 간격에서 찍은 세포 외 체액을 분석하는 그들의 효소 분석 물에 반응으로, 이들 센서하여 실시간 측정 1,2- 제조, 빠르게 반응한다. 퓨린 또는 과산화수소 및 그들의 방출 역학 같은자가 분비 및 주변 분비 인자의 농도의 격자 간 고속 검출은 정상 및 병리학 적 상태 (3)에 약물의 효과에 대한 프로파일을 구축하는 데 사용될 수있다. 현재의 센서를 사용하는 애플리케이션의 대부분은 뇌 조직 슬라이스 및 세포 배양 4-10에왔다. 이 논문의 목적에 자세히 프로토콜정확하게 전체 신장의 분석을 실시간으로 농도를 측정하는 수단을 설치한다. 다음 프로토콜은 간질 ATP와 H 신장 2 O 2 신호를 연구하기 위해 개발되었다. 신장의 네이티브 환경에서 세포 외 ATP 빠르게 그 유도체 (ADP, AMP 및 아데노신)로 내인성 ectonucleotidases에 의해 이화됩니다. 여기에 사용 된 센서는 다른 퓨린 또는 ATP 분해물 11 위에 ATP에 매우 선택적이다. 이 ATP 릴리스 및 신호 함수의 상수 및 동적 농도를 정확하게 모니터링 할 수 이것은 큰 장점을 제공합니다. 간질 ATP 농도는 두 개의 마이크로 전극의 조합, ATP 센서 및 null 센서를 사용하여 측정된다. 카탈라제 애플리케이션과 함께 널 센서 간질 H 2 O 2 농도 12을 검출 할 수있다. 다음 프로토콜은 열차의 두 개의 서로 다른 디자인을 사용하여중 생체 또는 생체 내 응용 프로그램에서 최적의 특성을 가지고 RS. 두 가지 설계는 효소 센서 층에 함유 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 인산 옥시 다제의 연속 촉매 반응에 기초하고 있으며 ATP의 존재에 의해 구동된다. 생체 외 연구에 사용 된 센서의 세트, H 2 O 2, 최종 효소 반응 생성물에서, 백금 / 이리듐 (PT-IR), 와이어 전극의 산화에 의해 검출된다. 생체 내 연구를위한 센서 대신에 혈액 관류 조직을 위해 설계 중재자 코팅 된 금 전극에 2 O 2의 감소 (H)을 기반으로합니다. 이 논문에 기술 된 두 프로토콜의 방식은 그림 1에서 보여진다. 이 효소 결합 결여 제외 널 센서는 해당 센서 ATP와 동일하다. 따라서, 카탈라제 효소로 H 2 O (2)의 검출에 더하여, 널 센서 MEAsures 비특이적 간섭. ATP 농도는 널이 비특이적 간섭과 ATP 센서 신호로부터 배경 H 2 O 2를 감지 빼서 계산한다. 여러 센서는 해당 널 (null)와 결합 할 때 생체에 대한 아데노신, ionosine, 하이포크 산틴, 아세틸 콜린, 콜린, 글루타민산, 포도당, 젖산, 생체 응용 프로그램이나 아데노신, ionosine을위한 D- 세린 및 하이포크 산틴을 포함하여 다른 분석을 감지 상업적으로 이용 가능하다 센서. 정확하게 분석 물을 검출하는 센서의 기능은 적절한 교정 전후 13에 의존한다. 이 분석은 생물학적 조직의 사용 중에 발생하는 센서의 감도의 편차를 차지하는 것을 보장한다. 센서는 센서 효소 반응에서 시약으로서 사용되는 글리세롤의 저장소를 보유하고있다. 센서를 포함하는 조 글리세롤 용액에 사용되지 않는 경우, 시간이 지남에 따라 세척한다. 짧은 Recording 시간은 센서 드리프트를 최소화 할 필요가있다. 또한 크게 센서 (14)의 감도를 감소시킬 수있는 내인성 단백질 분해 효소 및 단백질 절편으로 오염 센서. 본 원고는 생체 외 및 생체 신장에 효소 제제 미세 바이오 센서의 사용을 설정한다. 실시간 분석 정량 신장 질환 및 약리 에이전트의 메커니즘에 새로운 통찰력을 공개 할 수 세포 신호 전달의 전례가없는 세부 사항을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Sensor Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&amp;nbsp; Also included with the kit is the user&#039;s choice of sensors.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe null sensor 125 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissagold null sensor 50 &amp;mu;m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>store at 2-8 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C before use</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Manual</td><td>Sarissa Biomedical</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&quot;&gt;http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Faraday cage&amp;nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual channel potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Type II Faraday cage</td></tr><tr><td>Data acquisition program</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Model R99E</td><td></td></tr><tr><td>Fiber optic illuminator</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>air table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane ventilator</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>needle</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>pins</td><td></td><td></td><td>Standard dissection pins</td></tr><tr><td>catheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylene tubing (PE50)</td></tr><tr><td>catheter tissue glue</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>suture</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>rubber bands</td><td></td><td></td><td>any 2-4 mm wide rubber bands</td></tr><tr><td>silicone</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Clear 1#</td><td></td></tr><tr><td>clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>standard dissection kit</td><td></td><td></td><td>Kit should include scalpel and dissection sissors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kidney Cup</td><td></td><td></td><td>Of own design</td></tr><tr><td>standard chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP solution</td></tr><tr><td>hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

효소 미세 바이오 센서가 널리 실시간으로 세포 외 시그널링을 측정하는 데 사용되어왔다. 그 사용의 대부분은 뇌 조각 및 신경 세포 배양에 국한되고있다. 최근에,이 기술은 전체 기관에 적용되었다. 센서 설계의 발전은 혈액 관류 생체 신장에서의 세포 신호의 측정을 가능하게했다. 본 프로토콜은 쥐의 신장 간질의 ATP와 H 2 O 2 신호를 측정하는 데 필요한 단계를 나열합니다. 두 개의 개별 센서 디자인에 대한 생체 외 및 생체 내 프로토콜을 사용한다. 센서의 두 가지 유형은 빠른 응답, 민감하고 선택적 바이오 센서를 제공하기 위해 침투 선택성 층 위에 얇은 효소 biolayer로 코팅되어있다. 침투 선택성 층은 생체 조직 내의 간섭 물질로부터의 신호를 보호하고, 효소 층은 글리세롤 키나제 및 글리세롤 -3- 진료 기관 연합의 연속 촉매 반응을 이용하는ATP의 존재 phate 다제는 H 2 O 2를 생성한다. 생체 연구에 사용되는 센서의 세트는 더 백금 / 이리듐 (PT-IR) 와이어 전극에 H 2 O 2의 산화에 의한 분석을 감지했습니다. 생체 내 연구 센서 대신 혈액 관류 조직을 위해 설계 매개 코팅 금 전극 상 H 2 O (2)의 감소에 기초한다. 최종 농도 변화를 분석 알려진 농도로 보정 한 다음 실시간 amperometry에 의해 감지됩니다. 또한, 전류 측정 신호의 특이성은 O 2와 H 2 ATP 대응 분해 같은 카탈라제 등의 효소와 apyrase의 첨가에 의해 확인 될 수있다. 이 센서는 이전과 각 실험 후 정확한 교정에 크게 의존하고있다. 다음 두 프로토콜은 ATP와 H 2의 실시간 검출에 대한 연구를 확립신장 조직에서의 O 2를, 또한 다른 생물학적 제제 또는 전체 기관에서 사용하기위한 상술 한 방법을 확장하도록 변형 될 수있다.

효소 미세 바이오 센서의 설계는 전체 신장의 분석 물질의 실시간 검출 할 수있다. 어느 생체 외 또는 생체 내 연구에서 일반적인 실험 디자인이 사용될도 1 국지적 센서에 도시되고, 수술 절차는 연구 하는가에 따라 달라 생체 외 또는 생체 내에서이다. 재현 가능한 결과, 정확한 사전 및 사후 교정을 얻으려면입니다 중요....

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.9K 조회수.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

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Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including destruction of the sample, introduction of potential artifacts, and a lack of specificity for the reactive species involved. Thus, there is a current need in the field of toxicology for non-destructive, sensitive, and specific methods that can be used to observe and quantify intracellular redox perturbations, more commonly referred to as oxidative stress. Here, we present a method for the use of two genetically-encoded fluorogenic sensors, roGFP2 and HyPer, to be used in live-cell imaging studies to observe xenobiotic-induced oxidative responses. roGFP2 equilibrates with the glutathione redox potential (EGSH), while HyPer directly detects hydrogen peroxide (H2O2). Both sensors can be expressed into various cell types via transfection or transduction, and can be targeted to specific cellular compartments. Most importantly, live-cell microscopy using these sensors offers high spatial and temporal resolution that is not possible using conventional methods. Changes in the fluorescence intensity monitored at 510 nm serves as the readout for both genetically-encoded fluorogenic sensors when sequentially excited by 404 nm and 488 nm light. This property makes both sensors ratiometric, eliminating common microscopy artifacts and correcting for differences in sensor expression between cells. This methodology can be applied across a variety of fluorometric platforms capable of exciting and collecting emissions at the prescribed wavelengths, making it suitable for use with confocal imaging systems, conventional wide-field microscopy, and plate readers. Both genetically-encoded fluorogenic sensors have been used in a variety of cell types and toxicological studies to monitor cellular EGSH and H2O2 generation in real-time. Outlined here is a standardized method that is widely adaptable across cell types and fluorometric platforms for the application of roGFP2 and HyPer in live-cell toxicological assessments of oxidative stress.

This manuscript describes the use of genetically-encoded fluorogenic reporters in an application of live-cell imaging for the examination of xenobiotic-induced oxidative stress. This experimental approach offers unparalleled spatiotemporal resolution, sensitivity, and specificity while avoiding many of the shortcomings of conventional methods used for the detection of toxicological oxidative stress.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

While oxidative stress is a commonly cited toxicological mechanism, conventional methods to study it suffer from a number of shortcomings, including ...

연구

암 연구학

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

초과/수소 과산화 수소와 NADH 생산 미토 콘 드리 아 Dehydrogenases 플 라빈을 포함 하 여 동시 측정

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

생화학

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

생체공학

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors 프로 테아 제 활동에 감지 비보에 비 침 투 적인 진단에 대 한

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

생물학

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate energy for mechanical work, such as protein trafficking and degradation, solute transport, and cellular movements. The protocol described here is a basic assay for measuring the in vitro activity of purified ATPases for functional characterization. Proteins hydrolyze ATP in a reaction that results in inorganic phosphate release, and the amount of phosphate liberated is then quantitated using a colorimetric assay. This highly adaptable protocol can be adjusted to measure ATPase activity in kinetic or endpoint assays. A representative protocol is provided here based on the activity and requirements of EpsE, the AAA+ ATPase involved in Type II Secretion in the bacterium Vibrio cholerae. The amount of purified protein needed to measure activity, length of the assay and the timing and number of sampling intervals, buffer and salt composition, temperature, co-factors, stimulants (if any), etc. may vary from those described here, and thus some optimization may be necessary. This protocol provides a basic framework for characterizing ATPases and can be performed quickly and easily adjusted as necessary.

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

We describe a basic protocol for quantitating in vitro ATPase activity. This protocol can be optimized based on the level of activity and requirements for a given purified ATPase.

자질<em&gt; 체외</em효소 특성에 대한&gt; ATP 아제 활동

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Identification of the Source of Secreted Proteins in the Kidney by Brefeldin A Injection

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes patients to CKD later in life. Kidney epithelial cells have been identified as key signaling nodes in both AKI and CKD, whereby the cells can determine the course of the disease through the secretion of cytokines and other proteins. In CKD especially, several lines of evidence have demonstrated that maladaptively repaired tubular cells drive disease progression through the secretion of transforming growth factor-beta (TGF-&#946;), connective tissue growth factor (CTGF), and other profibrotic cytokines. However, identifying the source and the relative number of secreted proteins from different cell types in vivo remains challenging.
This paper describes a technique using brefeldin A (BFA) to prevent the secretion of cytokines, enabling the staining of cytokines in kidney tissue using standard immunofluorescent techniques. BFA inhibits endoplasmic reticulum (ER)-to-Golgi apparatus transport, which is necessary for the secretion of cytokines and other proteins. Injection of BFA 6 h before sacrifice leads to a build-up of TGF-&#946;, PDGF, and CTGF inside the proximal tubule cells (PTCs) in a mouse cisplatin model of AKI and TGF-&#946; in&#160;a mouse aristolochic acid (AA) model of CKD. Analysis revealed that BFA + cisplatin or BFA + AA increased TGF-&#946;-positive signal significantly compared to BFA + saline, cisplatin, or AA alone. These data suggest that BFA can be used to identify the cell type producing specific cytokines and quantify the relative amounts and/or different types of cytokines produced.

Identifying the cell type responsible for secreting cytokines is necessary to understand the pathobiology of kidney disease. Here, we describe a method to quantitatively stain kidney tissue for cytokines produced by kidney epithelial or interstitial cells using brefeldin A, a secretion inhibitor, and cell-type-specific markers.

Chronic kidney disease (CKD) is one of the top ten leading causes of death in the USA. Acute kidney injury (AKI), while often recoverable, predisposes ...

mtHyper7을 사용한 살아있는 효모 세포의 미토콘드리아 과산화물 이미징

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 연구의 발전 - 세포 내 분석을 위한 mtHyper7 바이오센서 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

살아있는 효모 세포에서 미토콘드리아 과산화물을 위한 비율계량 바이오센서인 mtHyPer7의 이미징

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기

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