그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.

생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.
1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비
주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. 버퍼를 유출 하는 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 첫째, 흡수 성 조직으로 유출된 버퍼를 닦아냅니다. 다음, 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 염소를 사용 합니다.
<ol><li>준비 하려면 혈액 컬렉션 진공관, 25 G x 1 바늘과 3 mL 주사기를 사용 하 여 튜브의 뚜껑을 puncturing 의해 특정 상업 세포의 용 해 버퍼의 1.6 mL 4 mL EDTA 진공 튜브로 주사. 참고: 진공 튜브의 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 진공 유지 되어야 합니다.</li>
	<li>실 온에서 버퍼 사용까지 포함 된 진공 튜브를 저장 합니다. 참고: 튜브는 적어도 1 년의 준비 후 안정.</li>
</ol>2입니다. 나 추출에 대 한 버퍼의 준비
<ol><li>나 추출에 대 한 버퍼를 준비 하려면 랙에서 두 1.8 mL, 두 4.5 mL, 그리고 한 3.6 mL 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>Pipetting, 960 µ L 자석 유리 입자 (MGPs) 깨끗 한 1.8 mL 튜브와 라벨이 MGPs. 그것은 그것을 pipetting 전에 완전히 MGP 정지를 Resuspend 하 여 추가 합니다. 참고:는 MGPs는 튜브의 하단에 신속 하 게 수집 하는 경향이 있다.</li>
	<li>Pipetting, 워시 버퍼의 4 mL 나 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 의해, 추가 하 고 WB-1로 그것을 분류. 주의: 워시 버퍼 나 자극성은 guanidinium 염화를 포함 합니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오.</li>
	<li>워시 버퍼 II 깨끗 한 3.6 mL 튜브 1.5 mL를 pipetting에 의해 추가 하 고 WB 2로 그것을 분류.</li>
	<li>Pipetting, 여 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 워시 버퍼 III의 3 mL를 추가 하 고 레이블을 WB-3로.</li>
	<li>깨끗 한 1.8 mL 튜브에 차입 버퍼의 100 µ L pipetting으로 추가 하 고 레이블을 EB로.</li>
	<li>사용 될 때까지 실 온에서 aliquoted 버퍼를 저장 합니다. 참고: 튜브는 그들의 준비 후 적어도 1 달 동안 안정.</li>
</ol>3. 바이러스 감염의 징후와 증상을 가진 환자에서 혈
주의: 환자에서 전체 혈액을 수집 하는 때 적절 한 실험실 안전 조치를 취할. 장갑과 안경 착용. 환자 격리에서는, biosafety 수준 4 절차를 따르시기 바랍니다.
<ol><li>환자에서 정 맥 전 혈을 수집 작은-내경 확장 튜브와 나비 바늘과 혈액 컬렉션 진공관 포함 하는 세포/바인딩 버퍼를 사용 합니다. 하향 위치에 환자의 팔을 휴식 하 고 컬렉션 튜브 나비 바늘 보다 낮은 위치. 환자의 정 맥에 나비 바늘을 삽입 하 고 작은-내경 확장 혈액 컬렉션 진공관을 연결할. 참고: 이것은 역류를 방지 합니다.</li>
	<li>혈액 수집 후 5-10 시간 튜브를 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합. 참고: 포함 하는 세포/바인딩 버퍼의 1.6 mL 혈액 컬렉션 튜브에 남아 있는 진공으로 인해 수집 된 샘플의 볼륨 자동으로 됩니다 1.6 mL.</li>
	<li>70% 에탄올을 사용 하 여 튜브의 외부를 소독.</li>
	<li>실 온에서 20 분 동안 튜브를 품 어. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 전체 혈액 컬렉션 튜브-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C 또는 적어도 1 달7에 대 한 37 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>단순화 된 나 추출 방법에 직접 계속.</li>
</ol>4. 간단 하 게 전체 혈액의 나 추출
<ol><li>세포/바인딩 버퍼 비활성화 수집 된 혈액, 믹스에서에서 나를 정화 진공을 틀 지 하 여 튜브의 내용을 손으로 5-10 x 튜브.</li>
	<li>신중 하 게 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 뚜껑을 방전.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 MGPs (1 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>샘플 포함 된 튜브에는 사용 하지 않는 혈액 컬렉션 튜브에서 새로운 뚜껑을 장소.</li>
	<li>튜브 긴밀 하 게 폐쇄 확인 혈액 컬렉션 튜브가 손으로 5-10 시간 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합을 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 유지 합니다.</li>
	<li>모든 MGPs는 자석으로 튜브의 측면에서 수집 되도록 손으로 튜브와 함께 자석 홀더는 몇 번을 플립. 참고: 자석 홀더는 길쭉한 자석 및 고무 밴드를 교체할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브의 뚜껑을 제거 하 고 일회용 피 펫을 사용 하 여 또는 단순히 50 mL 수집 튜브에 내용을 붓는 하 여 튜브의 내용을 삭제 합니다. 참고: 튜브 뚜껑을 닫아서 50 mL 수집 튜브에서에 어로 졸을 피하십시오.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-1 (4 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 배치 하 고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>자석 홀더, 뚜껑을 손가락으로 안전 하 게 강화 유지에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-2 (1.5 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>MGPs는 손으로 몇 초 동안 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 여 resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-3 (3 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.</li>
	<li>4.6 4.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>EB의 준비 된 약 수를 부 어 (100 µ L) 혈액 컬렉션 튜브에 직접.</li>
	<li>관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다. 참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서.</li>
	<li>혈액 컬렉션 튜브 5-10 배는 손가락으로 두 드려서는 MGPs는 EB에 resuspend. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다, 그리고 튜브-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>Resuspended MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫 (모든 다운스트림 진단 나 증폭 시험 램프/RT-램프 또는 정량/RT-정량 분석을 사용할 수 있습니다와 같은)를 사용 하 여 다운스트림 나 증폭 반응 혼합 한 방울 (5-8 µ L)를 전송. 참고: NAs는 MGPs에 충실, 다운스트림 나 증폭 반응에는 MGPs를 사용 해야 됩니다. 혼합 사용 하기 전에 MGP 정지. 혼합 후, MGPs는 튜브의 아래쪽에 수집 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴...

바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>368861</td><td></td></tr><tr><td>Plus Blood Collection</td><td>Becton Dickinson</td><td>362725</td><td></td></tr><tr><td>23G x 1 needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>LUER LOK syringe (3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly needle with small-bore extension tubing</td><td>J&amp;oslash;rgen Kruuse A/S</td><td>121714</td><td></td></tr><tr><td>1% Virkon</td><td>Nomeco A/S</td><td>849265</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>03246752001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit</td><td>Roche Diagnostics A/S</td><td>3038505001</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379189</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&amp;trade; Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>379146</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&amp;trade;-5 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette (3.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Samco&amp;trade; Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade; Nunc&amp;trade; 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid, safe, and simple manual bedside nucleic acid extraction for the detection of virus in whole blood samples

감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.

여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관7 (그림 1A), 혈액 컬렉션7 (<strong clas...

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Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

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Immunology and Infection

7.3K 조회수.  Statens Serum Institut. 여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.

비디오: Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

연구

환경과학

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

생체공학

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food irrigation, washing, etc. The classical fecal bacteria indicator does not always check for the presence of viral pathogens so the detection of viral pathogens and viral indicators is relevant in order to adopt measures of risk mitigation, especially in humanitarian scenarios and in areas where water-borne viral outbreaks are frequent.
At present, several commercial tests allowing the quantification of fecal indicator bacteria (FIB) are available for testing at the point of use. However, such commercial tests are not available for the detection of viruses. The detection of viruses in environmental water samples requires concentrating several liters into smaller volumes. Moreover, once concentrated, the detection of viruses relies on methods such as nucleic acid extraction and molecular detection (e.g., polymerase chain reaction [PCR]-based assays) of the viral genomes.
The method described here allows the concentration of viruses from 10 L water samples, as well as the extraction of viral nucleic acids at the point of use, with simple and portable equipment. This allows the testing of water samples at the point of use for several viruses and is useful in humanitarian scenarios, as well as at any context where an equipped laboratory is not available. Alternatively, the method allows concentrating viruses present in water samples and the shipping of the concentrate to a laboratory at room temperature for further analysis.

Here we present VirWaTest, which is a simple, affordable and portable method for the concentration and detection of viruses from water samples at the point of use.

VirWaTest, 물 샘플에서 바이러스 검출을 위한 사용 시점 방법

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

면역학 및 감염병학

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

생물학

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase polymerase amplification (RPA) and CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses. Target DNA is amplified and recognized by RPA and CRISPR/Cas12a separately, which triggers the collateral cleavage activity of Cas12a that cleaves a fluorophore-quencher labeled DNA reporter and generalizes fluorescence. For POC detection, portable smartphone microscopy is built to take fluorescent images. Besides, deep learning models for binary classification of positive or negative samples, achieving high accuracy, are deployed within the system. Frog virus 3 (FV3, genera Ranavirus, family Iridoviridae) was tested as an example for this DNA virus POC detection system, and the limits of detection (LoD) can achieve 10 aM within 40 min. Without skilled operators and bulky instruments, the portable and miniature RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with artificial intelligence (AI) assisted classification shows great potential for POC DNA virus detection and can help prevent the spread of such viruses.

We present a protocol that combines recombinase polymerase amplification with a CRISPR/Cas12a system for trace detection of DNA viruses and builds portable smartphone microscopy with an artificial intelligence-assisted classification for point-of-care DNA virus detection.

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM 및 딥러닝 기반의 DNA 바이러스 검출 시스템

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...