추출 피펫의 발전을위한 기금은 DRP에게 수여 내부 연구 및 개발 보조금에 의해 일부로 제공되었다.

1. 샘플 용해 <ol><li> 샘플은 액체 형태로되어 있어야합니다. 예제 단단한 경우 예를 들어 음식이나 대변을 위해, 샘플은 식염수 (PBS)를 버퍼와 같은 물이나 인산 등의 액체 매체 중단되어야합니다. </li><li> 1.5 ML 관에서 6M 구아니딘의 Thiocyanate (산도 6.5) 500 μL로 시료 500 μL를 섞습니다. </li><li> 주위 공기를 추방, 추출 피펫의 전구를 낮춰. </li><li> 전구가 천천히 확장을 허용하여, sorbent 자료를 통해, 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요. </li><li> 추출 도구는 그러한 반전 그 sorbent 구슬과 전구로 샘플 유출. </li><li> 추출 피펫 중에 샘플을 추방하지 않도록 조심하는 전구의 예제와 sorbent 구슬을 갈다. </li></ol> 2. 핵산 추출 (그림 1, 패널) <ol><li> 추출 피펫을 (하향 열기) 반전하고 원래 1.5 ML 관에 샘플을 추방. </li> &lt;리&gt; 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중하다고, 적당한 속도로, sorbent를 통해 전달 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요. </li><li> 전구 우울증에 의해 1.5 ML 관에 전체 샘플을 추방. </li><li> 오 패스 총 sorbent 네 개가 배 위에 시료를 통과, 단계 2.2 2.3 반복합니다. </li><li> sorbent 이상의 다섯 번째 패스 후, 단백질 추출 완충액 (15 ML 원뿔 튜브)의 4mL로 전체 1 ML 샘플을 추방, 튜브를 닫습니다, 그리고 나중에 사용하기 위해 별도로 설정합니다. </li><li> 최종 통과시 원래 튜브로 에탄올을 반환, sorbent 세 번 이상의 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 분리된 핵산을 씻으십시오. </li><li> 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 2.6 단계를 반복합니다. </li><li> 눌러 핵산 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. 추출 피펫 U의 일각에서 잔류 에탄올 닦아Kimwipe 노래를. </li><li> sorbent 다섯 번 이상 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8) 250 μL를 전달하여 핵산을 복구합니다. 트리스 버퍼 같은 PBS와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 압축을 푼 핵산이 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. 단백질 추출 (그림 1, 패널 B) <ol><li> 전도에 의한 단계 2.5에서 샘플 및 단백질 추출 버퍼 튜브를 섞어서 새로운 추출 피펫의 sorbent 이상이 5 ML 샘플의 약 2-3 밀리리터를 전달합니다. </li><li> 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중 같은 15mL 원뿔 튜브로 전체 샘플을 추방. </li><li> sorbent 15 배 이상의 샘플을 전달 단계 3.1 및 3.2 반복합니다. </li><li> sorbent 침대 위에 세 번, 그것의 원래 관으로 꺼내기 에탄올을 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 sorbent 및 바운드 단백질을 씻으십시오. </li><li> 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 3.4 단계를 반복합니다. </li><html><li> 눌러 단백질 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. kimwipe를 사용하여 추출 피펫의 일각에서 잔류 에탄올을 닦아주십시오. </li><li> sorbent 다섯 번 이상의 PBS 250 μL를 전달하여 단백질을 복구할 수 있습니다. PBS 버퍼와 같은 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8)와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 샘플의 단백질 함량을 포함하고 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="그림 1A" /> 1 그림. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 컨텐츠 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 보고서에 설명된 도구, 화학 및 프로토콜 필드 기반, 포인트의 케어 애플 리케이션에서 활용할 수있는 전기없는, 멀티 macromolecule 추출 시스템의 첫 번째 알려진 예제를 나타냅니다. 두 macromolecule 종류 하류 진단이나 분석 장치의 숫자에 적용할 수 있습니다. 샘플의 단백질 구성 요소 (그림 4) immunoreactive 반면 예를 들어, 분리된 핵산은 PCR 품질 (그림 2 및 3)입니다. 세계의 금욕이나 리소스가 제한된 지역에서 본 추출 시스템의 활용도가 크게 거기 사는 인구에 대한 질병의 부담을 줄일 수 있습니다. 이 추출 시스템은 또한 금욕 또는 원격 위치에서 시료 처리를위한 견고한 아직 신속하고 비용 효과적인 방법을 제공하여 전세계 질병 감시 프로그램을 도울 수 있습니다. 위에 명시된 추출 방법에 대한 하나의 중요한 요소는 그그것은 사용자가 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 크기는 초기 500 μLs (단계 1.2)보다 크거나 적은 경우에, 사용자는 이에 따라 시약의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 그것은 절대적인 볼륨을 변경할 수 있습니다 반면 샘플 크기 시약의 용적 비율이 일정하게 유지하여야합니다. 또한, sorbent여 구절의 수가 조정은 또한 사용자의 재량으로 만들 수 있습니다. 큰 샘플 볼륨이 사용되는 예를 들어, 나열된 것보다 sorbent 번 이상 (단계 2.4 &amp; 3.3) 이상의 시료를 통과하는 것은 sorbent 연락 macromolecule 유형 (핵산 또는 단백질)의 가능성을 높일 것입니다. sorbent 채도에 도달할 때까지 단락의 증가는 증가 효율성을 캡처해야합니다. 우리는 추출 도구 및 관련 화학은 단백질 추출 화학이 높은 glycosylated의 회복을 비효율적이라는 것입니다 가장 중요한 그 중 몇 가지 제한 사항을 가진 것으로 나타났습니다단백질. 하류 진단이 glycosylated 단백질을 대상으로하는 경우에이 시스템 식별에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 핵산이나 단백질 중 하나에 대한 추출 효율의 위턱과 아래턱에 제한은 아직 결정 및 최적화가 복구 효율성을 최대화하기 위해 진행하고있다. 도구의 발전이 현재의 지식 격차를 극복합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 구아니딘의 Thiocyanate </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2 - 프로파놀 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> - 4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

이러한 Enterohemorrhagic 대장균 (EHEC), Yersinia pestis의, 또는 prion 기반의 질병 등 전통과 신흥 병원균은 정부, 산업 및 전세계 의료 전문가들을위한 상당한 우려입니다. 예를 들어, 시겔라 결합 EHECs은, 약 325,000 어린이 매년 죽음에 책임이 있으며, 미국에서 일반적인 실험실 기반의 신분은 1 사용할 수없는 개발 도상국 특히 만연한 있습니다. 저렴한 비용의 개발 및 배포는 병원균이나 질병 마커의 신속한 식별 및 / 혹은 진단을 도울 현장 기반, 포인트의 케어 도구가 극적으로 질병의 진행과 환자의 예후를 변경할 수 있습니다. 우리는 전기 또는 관련 실험실 장비이없이 고체 상 추출 (SPE)에 의해 시료로부터 핵산과 단백질을 분리하기위한 도구를 개발했습니다. 격리된 macromolecules는 diagno 사용할 수 있습니다앞으로 실험실 또는 현장 기반 포인트의 케어 플랫폼을 사용하여 두 동생. 중요한 것은,이 방법은 게놈 및 proteomic 분석 확증을 통해 자신감을 제공하고, 핵산 및 해제 분할 시료로부터 단백질 데이터의 직접적인 비교를 제공합니다. 우리 절연 도구는 실리카 기반의 입자 또는 필터를 3으로 바인딩을 통해 chaotropic 소금 용액, 보통 구아니딘의 isothiocyanate에서 핵산을 분리 고체 상 핵산 분리를위한 업계 표준, 붐 기술을 활용합니다. CUBRC의 독점 고체 상 추출 화학은 핵산 분리 네에 따라 폐기물이나 흐름 죽에서,이 경우에는 chaotropic 소금 솔루션에서 단백질을 정화하는 데 사용됩니다. 포장함으로써, 소형 저렴하고 간단한 플랫폼에 화학을 잘 특징, 우리는 VAR하에 수행할 수 핵산 및 단백질 추출을위한 휴대용 시스템을 생성했습니다조건 iety. 분리된 핵산들은 안정이되었고, 단백질 함량은 즉시 개최 손 또는 기타 면역 기반 assays에 의해 분석할 수있는 동안 전원 PCR 증폭에 사용할 수있는 위치로 운반하실 수 있습니다. 분야의 질병 마커의 급속한 신분은 크게 질병 진행의 초기 단계에서 치료의 적절한 과정을 지시하여 환자의 결과를 변경할 수 있습니다. 설명된 도구와 방법은 거의 모든 전염성 요원과 함께 사용하기에 적합하며 동시에 자신의 물류 부담을 줄이면서 사용자에게 멀티 macromolecule 유형 분석의 중복을 제공합니다.

핵산 분리 : 절연 핵산은 PCR amplifiable 및 단백질 오염 무료입니다. 예제 1 : 복구 핵산은 PCR 기반 응용 프로그램에 사용하기 적합합니다. 예를 들어, 그림 2 Enterohemorrhagic E.와 관련된 시가 독소 유전자의 증폭을 보여줍니다 대장균 O157 : 추출 피펫을 사용하여 핵산 / 단백질 추출 과정에서 H7 변형 편집 판단리스트-933 (ATCC # 35150). 시가 독소의 유전자 STX 1 STX 2가 해당 제품 및 기타 Enterohemorrhagic E.에 온화한 람다 같은 박테리오 파지 및 결함 박테리오 파지에서 찾을 수있는 P R업자 5 6 7 8의 통제하에 대장균의 변종. E.의 SOS 반응의 활성화 대장균은 유도 및 / 또는 독소 생산 9 prophage로 안내합니다. 우리는 펭 외 의해 멀티 플렉스 PCR 분석의 수정된 버전을 활용했습니다. 11 문화와 아군 하수 시료 모두에서 STX 1 STX 2 유전자를 식별합니다. 레인은 그림 2에서 A와 B는 처리되지 않은 문화 샘플 (레인)의 PCR 증폭 및 처리 문화 샘플 (레인 B)의 결과를 보여줍니다. 이러한 결과는 거의 동일 의미가 처리되지 않거나 고립된 핵산의 충실도에 대한 손실이 없습니다. 우리는 다음 아군 원시 하수 (차선 D) 또는 아군 하수의 고립 핵산 (차선 E &amp; F)를 증폭. 이러한 데이터는 분리된 핵산은 아군 하수 시료에서 비 절연 핵산 대 더욱 증폭으로 이어진 것으로 나타났습니다. 따라서 자연스럽게 하수도에서 발견 PCR 억제제 중 하나는 고립에 따라 제거되었다는이나 핵산이 분리시 집중되어 있다고 결론. 이 두 가설의 조합도 가능합니다. 자외선 분광법은 다음 고립된 핵산이 비교적 자유로운 것​​을 표시하기 위해 사용되었다 OF 오염 단백질. 그림 3은 두 가지 중에 자외선 스펙트럼을 보여줍니다 대장균 O157 : H7 핵산 extractions, 라벨 절연 및 절연 B, 미리 격리라는 세균성 문화의 정규화된 스펙트럼에 비교 인치 분리된 핵산의 자외선 스펙트럼은 260 nm의 및 1.8 10 다가오고 280 nm의 흡광도 사이의 계산된 비율을 가진, 순수한 핵산의 스펙트럼 유사합니다. 이러한 데이터를 설명하는 기법을 사용하여 복구 핵산 분획이 매우 작은 오염 단백질이있다는 것을 보여줍니다. 단백질 분리 : 핵산 / 단백질 분리 실험에서 발견한 단백질은 immunoreactive 순수 단백질에 electrophoretically 동일합니다. 예제 2 : 분리된 단백질 분획은 RapidChek E.에 적용되었다 대장균 O157 측방 유동 분석 스트립 (SDIX 주식 회사). 컨트롤 E.을 품고 모든 샘플에서 긍정적인 인식을 보여 대장균<html> 하거나 STX 유도 (그림 4, 각각 차선 B와 C)없이 O157. 그림 4의 데이터는 또한 E.을 품고 그 샘플에 대한 긍정적인 결과를 보여 추출 피펫을 사용하여 핵산 그리고 단백질에 대한 처리 된 대장균 O157. 이러한 데이터는 각 시료에서 분리된 단백질은 따라서 긍정적인 반응을 촉발 immunoreactive는 것을 보여줍니다. PCR 증폭은 (같은 예제 1에서 설명) 절연 단백질 분획은 핵산을 오염은없는 걸 보여주 단백질 샘플에서 수행되었다. 이러한 실험 결과는 겔 전기 영동에 의해 모두 부정했다. 따라서, 우리는 샘플의 단백질 함량은 핵산을 오염으로부터 분리되었다고 결론 지. 이러한 결과는, 핵산 및 단백질 함량이 별도 분획화 단계에서 격리되는 핵산 분리 단계 쇼 설명한 기능과 전체에서 촬영된. T &quot;&gt; 예 3 :. 분리된 단백질은 전기 영동 10 적합 그림 5는 coomassie가 추출 피펫 및 관련 사용하여 6M 구아니딘의 isothiocyanate 격리 BSA (그림 5, 레인 &amp; C)와 BSA와 함께 로드된 8 % 아크릴 아미드 겔을 묻다 모습 프로토콜. 고립된 단백질의 전기 영 동적 이동성은 컨트롤 샘플의 그것과 동일합니다. 우리 때문에 추출 과정이 고립된 단백질의 공유 결합 구조를 변경하지 않는다는 결론. <img alt="그림 1A" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> 그림 1, 패널 : 전형적인 핵산 추출 과정의 묘사 샘플은 샘플 튜브에서 6M 구아니딘의 thiocyanate와 함께 섞어 sorbent 다섯 번 이상 전달됩니다.. 마지막 통과 후, 샘플은 단백질 추출 버퍼에 추가됩니다. sorbent 및 바운드 핵산은 에탄올로 두 번 씻어있다. 예제 다음 메니저입니다려다와 sorbent에서 eluted. <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> 그림 1, 패널 B : 전형적인 단백질 추출 절차의 묘사 단계 1, 그림 1은 두 번째 추출 피펫 15 배의 sorbent를 통해 전달되는 패널에서 단백질 분리 버퍼와 혼합 샘플.. 절차의 나머지 핵산 추출 프로토콜의 그것과 동일합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> 그림 2 :. ethidium 브로마이드 스테인드 아가로 오스 겔의 음수 그림은 멀티 플렉스 시가 독소 1과 2 유전자 증폭 실험은 엑스타시를 타서 문화 샘플 (차선 A와 B) 또는 원시 하수 샘플을 사용하여 수행되었다 대장균 O157 : H7 (차선 D, E 및 F). 샘플을 직접 PCR 반응 튜브 (차선 및 D) 또는 샘플에 추가된 것은 절연 proces를 사용하여 처리되었습니다s와 추출 핵산은 PCR 반응 튜브 (샘플 B, E 및 F)에 추가되었습니다. PCR 프로토콜 펭 외 11 시까지 설명한 하나의 수정입니다. 우리의 수정은 다른 모든 프라이머 쌍을 이탈, 오직 STX 1 (낮은 대역)과 STX 2 (상위 대역) 프라이머 쌍에 의해 증폭들을 대상으로. 레인 C는 BioRad에서 1Kb 사다리입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> 그림 3 : 중에 자외선 분광 결과 대장균 O157 : H7 핵산이 보고된 추출 피펫을 사용하여 격리 격리된 핵산은 절연 및 절연 B로 표시됩니다.. 샘플의 자외선 스펙트럼은 또한 사전 핵산 추출로 테스트되었고 사전 고립 표시됩니다. 스펙트럼은 히타치 U3010 분광 및 관련 소프트웨어 패키지를 사용하여 획득했다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; 그림 4 :. RapidChek 테스트 스트립의 컬러 사진은 그림 2에 사용되는 샘플의 단백질 함량은 추출 피펫을 사용하여 격리 및 측면 흐름 분석에 의한 immuno-반응성 위해 테스트되었습니다. 차선 교류, 세포 배양은 핵산이나 단백질 추출하지 않고 테스트 스트립에 추가되었습니다되어 처리되지 않은 컨트롤입니다. 차선는 엑스타입니다 부정적인 컨트롤과 같은 대장균 BL21 DE3 pLysS, 레인 B와 C 쇼 E. 대장균 O157 : (B) 또는 4 시간 동안 mitomycin C (C)로 치료 경과했습니다 H7. H를 통해 레인 D는 측면 흐름 테스트 스트립으로 추출한 단백질을 추가하는 결과를 보여줍니다. 레인 D와 E는 E.로부터 단백질 추출물을 사용하여 탐지되었다 중 (D)없이 또는 부정적인 컨트롤로 mitomycin C 처리 (E)와 대장균 BL21 DE3 pLysS합니다. E.로부터 단백질을 추출했을 때 FH는 결과를 보여 차선 대장균 O157은 : H7가 사용되었습니다. 단백질은 (F) 치료, 또는 2 시간 (G) 또는 4 시간 (H) Mitomycin C 처리 문화에서 추출되었다.긍정적인 결과는 이중 빨간색 라인을 생산하고 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> 그림 5 :. Coomassie의 스테인드의 사진 SDS-PAGE BSA는 추출 피펫과 기술된 프로토콜을 사용하여 용액으로부터 격리되었다. 울타리와 C는 각각 250 μg / ML 500 μg / ML의 제어 차선입니다. 레인 B와 D는 각각의 컨트롤과 같은 농도를 포함하는 솔루션에서 발견한 BSA를 묘사.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  CUBRC, Inc.. 도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...