이 연구는 가스 펌프 핸들, 놀이터 및 ATM과 같은 도시 환경에서 거의 청소되지 않는 표면에서 SARS-CoV-2를 감지하는 새로운 워크플로우를 제공합니다. 전염병에서, 공급은 부족합니다. 우리는 기본 실험실 설정에서 사용할 수있는 쉽게 얻을 수있는 재료와 시약 및 장비를 사용합니다.
우리는 콜드 체인없이 RNA를 보존하는 추출 방법과 억제제에 내성 검출 방법을 사용합니다. 이 프로토콜은 공중 보건의 관심사입니다. 그것은 미래의 글로벌 발발 도중 현재 COVID-19 전염병 및 그밖 전염하는 에이전트를 위한 환경 바이러스성 저수지의 평가를 위한 틀을 제공합니다.
지역 및 소셜 미디어를 통해 발표 된 직접적이고 명확한 행동을 촉구하여 시민 과학자를 모집하십시오. 소셜 미디어 핸들을 만들어 소셜 미디어 콘텐츠에 주제를 연결합니다. SMP에 대한 링크를 생성하여 개인이 온라인 형식으로 지정된 생물 안전 관련 질문에 답하여 환경 샘플링 노력에 참여할 수 있도록 여러 언어로 탐색할 수 있도록 다국어 플러그인을 제공합니다.
영어와 스페인어로 샘플링 섹션 그래픽 및 시청각 프로토콜을 포함합니다. 클라우드 컴퓨터 서비스 공급자가 촉진하는 지리 공간 응용 프로그램 프로그래밍 인터페이스를 사용하여 지리 공간 데이터를 시각화합니다. 중앙 집중식 저장, 처리 워크플로우 추적 및 물류 관리를 용이하게 하기 위해 SMP를 통해 LIMS에 제출된 데이터를 저장합니다.
샘플 키트 ID, 샘플 ID, 날짜, 시간 및 글로벌 위치 지정 시스템 좌표와 같은 사전 로드 정보를 사용하여 데이터 형식 준수를 가능하게 하고 오류를 최소화합니다. 참가자에 대한 샘플 픽업 요청 링크를 포함하며, 모든 샘플을 수집한 후에사용할 수 있습니다. 마스크와 장갑, 샘플링 프로토콜 및 생물 안전 관련 정보와 같은 필요한 개인 보호 장비를 포함하여 모든 샘플링 소모품이 포함된 키트를 작성합니다.
스와브는 1센티미터 정사각형 폴리에스테르 흡수제 면봉을 세제로 적시고 10센티미터 의 표면을 헤빙하여 가정과 도시 환경에서 거의 소독되지 않습니다. 이쑤시개에 의해, 구안디늄 티오야네이트의 200 마이크로 리터를 포함하는 미리 표지 된 튜브에 각 샘플을 잠수. 교차 오염을 방지하기 위해 제공된 마스크와 각 샘플 의 수집을 위한 새로운 장갑을 착용하십시오.
샘플링을 마친 후 제공된 손 소독제를 사용하십시오. 튜브를 실험실로 운반할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 샘플이 실험실에 도착하면 영하 80도에서 보관하십시오.
스크리닝 속도를 높이려면 풀에서 샘플을 처리합니다. 풀이 양성인 경우 각 샘플의 RNA를 독립적으로 추출합니다. 각 샘플링 키트의 샘플을 8개의 샘플 각각 50마이크로리터를 마이크로센심심분리기 튜브로 풀링하고 나머지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 절약하여 두 개의 풀로 결합합니다.
15초 동안 80마이크로리터의 클로로폼과 소용돌이를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 배양하십시오. 섭씨 4도에서 20분 동안 13, 000배 G의 원심분리기.
수성 층을 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기십시오. 나머지 인터페이스와 분홍색 액체를 영하 80도 냉동고에 보관하십시오. 이 분수는 DNA와 단백질을 포함합니다.
구니디늄 티오시야네이트 계 RNA 원유 추출 프로토콜을 사용하여 회수된 수성 층으로부터 RNA를 추출한다. 파이펫팅 손실을 고려하여 10%의 초과 부피로 실온에서 RT-LAMP 반응 믹스를 준비합니다. 샘플 반응에 RNA 5마이크로리터와 RNA 5마이크로리터를 플러스 합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 마이크로리터에 첨가하여 스파이크 된 반응에 넣습니다.
합성 SARS-CoV-2 RNA의 2.5 마이크로리터를 음수 대조군에 양성 제어 및 5마이크로리터의 물을 첨가합니다. 잘 섞어서 반응을 줄입니다. 색색 관찰의 경우 음의 결과가 분홍색으로 표시되고 긍정적 인 결과가 노란색으로 표시됩니다.
RT-LAMP 후 젤 전기 전도를 수행합니다. 샘플 수집 사이트의 분포는 여기에 표시됩니다. 키트의 대부분이 완료되었고 해당 데이터가 LIMS에 업로드되었습니다.
100%의 주파수에서 검출의 한계는 반응의 25 마이크로리터 당 500 사본이었습니다. 색색 RT-LAMP에서, 양수 샘플은 8에서 5.5로 pH 이동으로 인해 분홍색에서 노란색으로 색상을 변경했습니다. 낮은 복사 번호에서, 샘플은 결과 사다리와 같은 패턴으로 긍정을 확인하기 위해 아가로즈 젤에 실행되었다.
RT QPCR 방법은 환경 샘플로 테스트되었습니다. 모든 마스터 믹스는 양극 대조군의 낮은 카피 수 농도에서 억제제에 민감했다. 템플릿의 낮은 농도에서, 전통적인 RT PCR 방법은 거짓 긍정과 거짓 네거티브를 보여 주었다.
마지막으로, 롤링 원 증폭이라는 기술은 표적 시퀀스의 소량을 검출했다. 그러나, RNA 템플릿이 없는 상태에서 프로브의 증폭을 보였다. 샘플링이 진정으로 해당 지역 사회의 모든 구성원의 노출 위험을 나타내도록 지역 사회의 모든 부문에 도달하는 행동 촉구를 발표하는 것이 중요합니다.
이 프레임워크는 SARS-CoV-2 유전 물질을 검출합니다. 바이러스 성 생존가능성을 테스트하는 연구가 다음 단계입니다.
