이 방법은 순환 종양 DNA를 분석하기 위한 암진단 도구로 사용될 수 있다. 이 기술은 단 하나 반응에 있는 클러스터 돌연변이의 지구에 있는 다중 유전 변경을 심문합니다. 이것은 귀중한 참을성 있는 견본을 저장하는 것을 돕습니다.
이 방법은 그것의 돌연변이 단면도에 종양 부담에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 핵산 표적 서열의 절대정량화를 얻기 위해 qPCR에 대한 대안으로서 분자 분석에 적용될 수 있다. 7 밀리리터 EDTA 튜브에서 혈액 샘플을 수집합니다.
2개의 관은 플라즈마의 약 4밀리리터를 수집하는 것이 좋습니다. 혈액 시료를 820배의 중력에서 10분 동안 원심분리하여 적혈구, 백혈구 및 혈장분리를 유도합니다. 샘플링과 원심 분리 사이의 시간은 백혈구에서 방출되는 DNA로 오염되지 않은 고급 T 세포없는 DNA를 얻는 데 중요합니다.
원심 분리에 따라, 백혈구 층을 만지지 않고 상체피수집을 위해 서학적 파이펫을 사용합니다. 플라즈마의 약 2 밀리리터는 일반적으로 EDTA 튜브 당 복구됩니다. 플라스를 2밀리리터 튜브로 옮김한 후, 16번, 000배의 중력을 15도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다.
조심스럽게 펠릿을 방해하지 않고 플라즈마를 수집하고 두 밀리리터 극저온 튜브로 전송합니다. 필요할 때까지 음수 섭씨 80도에 보관하십시오. 50 밀리리터 튜브에 400 마이크로리터의 단백질제 K를 첨가하십시오.
이어서, 추출 키트로부터 1마이크로그램의 담체 RNA를 함유하는 플라즈마 4밀리리터와 ACL 리시스 버퍼 3.2 밀리리터를 첨가한다. 튜브를 닫고 30초 동안 소용돌이를 통해 혼합하여 균질성 용액을 얻습니다. 그런 다음 섭씨 60도에서 30 분 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 리세이트에 완충ACB7.2 밀리리터를 추가하여 실리카 멤브레인에 순환하는 핵산의 결합을 최적화한다. 15~30초 동안 소용돌이에 섞으세요. 그런 다음 5 분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다.
컬럼과 20밀리리터 익스텐더를 진공 펌프에 부착합니다. 사용하지 않은 부분을 닫아 진공 포부를 허용합니다. 튜브를 잠시 원심분리한 후 튜브 익스텐더에 혼합물을 조심스럽게 도입하십시오.
그런 다음 진공 펌프를 켜고 용하가 열을 통해 완전히 그려질 수 있도록 합니다. 튜브 익스텐더를 제거하고 폐기합니다. 다음으로 600마이크로리터의 버퍼 ACW1을 열에 적용합니다.
버퍼 ACW1이 컬럼을 통해 그려지면 ACW2 버퍼750 마이크로리터를 추가하고 마지막으로 96~100%의 마이크로리터 750을 추가합니다. 그런 다음 열을 깨끗한 2 밀리리터 수집 튜브와 원심분리기를 3분 동안 최고 속도로 배치하여 에탄올을 제거합니다. 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 넣은 후 뚜껑을 열고 섭씨 56도에서 10분 동안 배양하여 멤브레인을 완전히 건조시킵니다.
인큐베이션 후 컬럼을 깨끗한 1.5 밀리리터 저결합 튜브에 넣습니다. 0.04%의 나트륨 아지드를 장착한 RNase 가 없는 물 36마이크로리터를 조심스럽게 적용하십시오. 그런 다음 뚜껑을 닫고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.
핵산을 털어내려면 1분 동안 다시 최고 속도로 원심분리기를 합니다. 그런 다음 필요할 때까지 음수 섭씨 20도에 보관하십시오. 먼저 반응 성분을 깨끗한 PCR 후드의 실온에 해빙하고 평형화합니다.
그런 다음 RNase 및 Dnase 프리 증류수에서 프라이머와 프로브를 20배 혼합하여 각 프라이머를 18 마이크로몰라 농도로, 각 프로브는 5개의 마이크로몰라 농도로 준비합니다. 모든 개별 PCR 반응의 경우, 2회 ddPCR 슈퍼믹스10마이크로리터, 프라이머 와 프로브 믹스 20배의 마이크로리터 1개, 증류수 20마이크로리터에 DNA 샘플의 최대 10나노그램을 결합하여 샘플 믹스를 준비한다. 균질성을 보장하기 위해 반응 혼합물을 철저히 소용돌이시다.
그리고 간략하게 원심분리기를 분배하기 전에 튜브 의 바닥에 있는 내용을 수집합니다. ddPCR 카트리지를 홀더에 삽입하고 20 마이크로리터의 샘플 반응 믹스를 카트리지의 중간 우물에 적물물 생성을 할 수 있습니다. 70 마이크로리터의 액적 발생기 오일을 하단 우물에 넣습니다.
개스킷이 있는 카트리지를 물방울 발생기에 삽입합니다. 물방울은 카트리지의 상단 우물에서 생산됩니다. 카트리지에서 40 마이크로리터를 천천히 부드럽게 흡인시키고 96웰 PCR 플레이트에 분배합니다.
증발을 피하기 위해 물방울을 옮은 직후 플레이트 실러를 사용하여 알루미늄 호일로 최종 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. 우물 바닥에 있는 내용을 수집하기 위해 접시를 간단히 원심분리합니다. 열 사이클러에서 기존의 PCR 증폭을 실행합니다.
달리기가 완료되면 접시를 잠시 원심분리하여 우물 바닥에 있는 내용물을 수집합니다. PCR 증폭 후, 소책자 판독기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 PCR 양수 및 PCR 음수 방울을 계산합니다. 다음은 드롭오프 ddPCR 분석기의 최적화 단계에서 얻은 대표적인 결과입니다.
이 이미지는 100% 돌연변이 DNA, 5% 돌연변이 DNA 및 100% 야생형 DNA를 포함하는 반응에서 돌연변이 DNA 및 야생형 DNA의 검출을 보여줍니다. 본 이미지는 KRAS 및 EGFR 드롭오프 ddPCR 분석으로 분석된 플라즈마 샘플의 예를 보여 주며, 단일 뉴클레오티드 및 다중 대체체의 검출을 KRAS 2의 KRAS 및 EGFR 엑슨 19에서 삭제하는 것을 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법의 중요한 단계인 액적 생성에 특별한 주의를 기울여 각 단계에서 신중하게 진행하는 것이 중요합니다.
개발 후, 이 기술은 액체 생검을 사용하여 종양 돌연변이 분석을 최적화하기 위하여 암 연구 분야의 연구원 그리고 임상의를 위한 도로를 포장했습니다.
