이 연구는 과학, 정보 통신 기술 및 미래 계획 (부여 번호 2013M3C8A1075908)의 교육부에 의해 투자 연구 재단의 사회를위한 R &amp; D 프로그램 (NRF)에 의해 지원되었다.

FFPE 참조 표준 셀 라인 1. DNA 추출 주 :이 절차는 DNA 추출은 아래 프로토콜에 기재된 바와 같이 FFPE 조직 DNA 분리 키트를 이용 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))에서 수행 하였다. 자동화 된 DNA 추출은 전체 DNA의 분리를위한 제조업체의 지침에 따라 이루어졌다. <ol><li> 마이크로톰 및 원래 FFPE 블록을 사용하여 수동으로 설정된 절차에 따라, 종래 DNA 추출 및 분석 신선한 섹션을 준비한다. 조직 절편 (들)에 대한 입력 샘플이 10 ㎛의 두께의 합계를 초과하지 않는 것을 확인하고 분석 표면적은 단일 섹션 600mm 2를 초과하지 않도록. </li></ol> 1.2 TPS 프로토콜 주 : 표 1에 나타낸 양 (48)은 샘플을 처리하는 데 필요한 최소에 해당하고, 절차도시는 TPS 지침에 따른다. 실험을 시작하기 전에 자동 프로그램 중에 시료의 손실을 피하기 위해 600 XG에서 원심 분리하여 튜브의 전자 FFPE 시료를 진정. <ol><li> 자동화 된 DNA 분리 악기와 컴퓨터를 켭니다. 실행 제어 소프트웨어를 열고 TPS 갑판 적재 영역으로 자동로드 트레이를 삽입합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 해당 홈통으로 시약을 분주한다. <ol><li> 샘플 캐리어 랙에 4 샘플 (BRAF (WT), BRAF V600E 50 %, 5 %, 1 %)을 놓습니다. </li><li> 열 2, 3의 골짜기에서 팁 상자를 놓고 실행을 중단 할 팁 당 하나 이상의 필터의 존재에 대한 도움말을 확인합니다. </li><li> 그들에게 3-5 번 반전 용해 버퍼 및 세척 버퍼의 적절한 혼합을 확인하고 열 4 (그림 1)의 각 골짜기에로드. </li><li> 몇 번이나 가벼운 vort에 대한 반전 후exing, (그림 1, 표 1) 표시된 곳 1 슬롯 빈 떠나, 열 5에있는 작은 골짜기에서 용출 버퍼, 자석 구슬 및 FFPE 버퍼를로드합니다. </li><li> 플레이트 캐리어 (그림 1)에 2 ㎖의 깊은 우물 판 (DWP)을로드합니다. </li></ol></li><li> 실행을 시작하기 전에 다음 최종 단계를 수행합니다 : <ol><li> 모든 튜브와 시약 골짜기를 뚜껑을 벗기다. 충분한 용량이 액체 폐기물 병에 사용할 수 있습니다 확인합니다. 고체 폐기물 병이 비어 및 생물 학적 가방 늘어서 있는지 확인합니다. 팁 꺼내기 판은 폐기물 어셈블리의 중앙에 있는지 확인합니다. </li><li> 전면 커버를 닫습니다. </li></ol></li><li> 소프트웨어를 시작합니다. NA_Prep_Main_MLSTARlet.med 파일을 엽니 다. </li><li> &quot;시작.&quot;악기 상태는 실행에 유휴 상태로 전환됩니다. </li><li> 이 실행을위한 샘플의 수를 입력합니다. 이 런 (DNA = 0)에 대해 원하는 방법을 선택합니다. 제 1 고 부피의 위치를​​ 입력매화 팁, 모든 용지함이 가득 경우 &quot;1&quot;을 선택. 모든 용지함이 가득 경우 &quot;1&quot;을 선택, 최초의 표준 볼륨 끝의 위치를​​ 입력합니다. 참고 :이 장비는 다음 사용자의 개입없이 자동 단계를 실행합니다. 상세한 흐름은도 2에 도시되어있다. 실험이 끝나면 반응물 폐기물 및 팁 폐기 조립체 내로 주입된다. </li><li> 형광 방법에 의해 정제 된 게놈 DNA를 정량. 주 : 3.3 NG / μL의 최소 농도를 포함하는 DNA 샘플 ddPCR 분석 (2 장)을 실시한다. </li></ol> 2. DNA 돌연변이 프로파일 : ddPCR 프로토콜 주 : 1) 물방울 세대, 2) 기존의 PCR 증폭, 3) 물방울 읽기 및 4) DNA 돌연변이 프로파일 : DNA 돌연변이 프로파일에 대한 프로토콜은 3 주요 단계로 구성되어 있습니다. 2.1. 물방울 세대 참고 : ddPCR의 수퍼 믹스가이 혼합 액적 생성에 필요한 시약을 포함로, ddPCR하는 것이 좋습니다. <ol><li> , 오염을 방지 같은 깨끗한 PCR 후드, 깨끗한 피펫, 낮은 단백질 결합 튜브를 사용하여, 장갑을 착용 표준 예방 조치를 따르십시오. </li><li> 인간 게놈 DNA 샘플의 최소 농도는 3.3 NG / μL 있는지 확인하십시오. 주 : 정제 DNA 시료 농도의 양은 % 돌연변이 주파수 검출의 분석에 따라 달라질 것이다. </li><li> 96 웰 PCR 플레이트에 반응 혼합물을 조립합니다. 해동과 RT에 반응 성분 평형. (각 정제 된 DNA 샘플 (66ng / 2 μL) 증류수로 20 μL를 구성하여 2 배 ddPCR의 수퍼 믹스 (10 μL) 및 (20) 프라이머 (순방향 및 역방향, 900 ㎚) 및 프로브 (250 nm의)를 결합하여 PCR 반응을 준비 ) 방울 생성기 프로토콜 당 </li><li> 분배 전에 튜브의 하단에 컨텐츠를 수집 및 균질성을 간단히 원심 분리되도록 충분히 혼합 소용돌이. 로드 (20) &amp; #181, 방울 형성​​을위한 카트리지 상 L. </li><li> 제조자의 권장 프로토콜에 따라 액적 발생기의 작동 <ol><li> 홀더의 상부 좌측에 위치 된 카트리지의 노치와 홀더에 카트리지를 삽입한다. 바닥 우물에 중앙으로 샘플을 포함하는 반응 혼합물의 20 μL, 발전기 오일의 70 μl를 추가합니다. </li><li> 카트리지의 상단에 개스킷을 부착합니다. 가스켓은 홀더의 양쪽 끝에 안전하게 걸려 있는지 확인; 그렇지 않으면, 액적 생성하기에 충분한 압력이 달성되지 않을 것이다. </li><li> 악기의 위에 녹색 버튼을 누름으로써 액적 발생기를 열고 카트리지를 삽입. 홀더 전원 (오른쪽에서 왼쪽)와 홀더 (가운데 오른쪽) 표시등이 녹색으로 둘은 올바른 위치에있을 때. </li><li> 문을 닫고 다시 악기 상단 버튼을 눌러 방울 생성을 시작합니다. 참고 : B를 누르면utton, 물방울이 생성 된 미세 유체 채널을 통해 석유 및 샘플을 그리기 출구 우물을 통해 매니 폴드 위치 자체. 그들이 축적 곳에 물방울이 잘 방울로 흐른다. 10 초는 액적 생성이 진행 중임을 나타냅니다 후 액적 표시 등 (오른쪽) 녹색으로 깜박입니다. </li><li> 액적 생성이 완료되면, 3 표시등이 녹색으로 변경; 버튼을 눌러 문을 열고 장치에서 홀더를 제거합니다. 홀더에서 일회용 가스켓을 제거하고 폐기합니다. 주 : 카트리지의 상단 웰 방울을 포함하고, 중간 및 하부 웰 잔유 소량 거의 비어. </li></ol></li></ol> 2.2. PCR을위한 준비 <ol><li> 제조자의 프로토콜 기기에 나타낸 각 시료에 대하여, 권장하는 96 웰 PCR 플레이트의 웰에 단일 상부 웰 카트리지로부터 액적 (40)의 내용을 μL 피펫. 아니TE : 멀티 채널 피펫을 사용하여 액 적을 에멀젼 전송에 적합하다. 방울의 느리고 부드러운 흡입은 전송 중에 방울 전단을 최소화하는 것이 좋습니다. </li><li> 즉시 증발을 방지하기 위해 방울을 전사 후 호일 PCR 플레이트를 밀봉. PCR 플레이트 실러와 방울 리더 바늘과 호환되는 천 공식 박 플레이트 씰을 사용합니다. PCR 플레이트 실러 설명서의 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 180 ° C의 플레이트 실러 온도와 5 초에 시간을 설정합니다. </li><li> 트레이 문을 열 수있는 화살표를 누릅니다. 96 웰면이 위를 향하도록 트레이에 지원 블록을 배치합니다. 지원 블록에 96 웰 플레이트를 놓고 모든 판 우물이 지원 블록에 정렬​​되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 천 공식 호일 씰 1 시트 96 웰 플레이트를 커버. 96 웰 플레이트 지원 블록에 고정하고, 천 공식 호일 씰으로 덮여되면, 실 버튼을 터치합니다. 트레이가 닫히고열 밀봉 시작합니다. </li><li> 가열 밀봉이 완료되면, 자동으로 문이 열리고 열 순환 용 히트 블록으로부터 판을 제거하고 열 블록을 제거한다. </li><li> 접시에 모든 우물이 호일에 우울증이 잘 각을 통해 쉽게 알 수 있음을 확인하여 밀봉되어 있는지 확인합니다. 밀봉하면, 플레이트는 열 순환에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 물방울이 제거되면, 열려면 카트리지 홀더에 래치를 누릅니다. 빈 카트리지를 제거하고 폐기. </li><li> 표 2에 설명 된 매개 변수에 따라 기존의 PCR 증폭을 수행합니다. </li></ol> 2.3 물방울 읽기 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라) 주 : 방울 핵산 표적의 PCR 증폭에 이어, 액적 리더 구 개별적 2 색 검출 시스템 (13)을 이용하여 각각의 방울을 분석한다. 우리는 일반적 FAM의 검출을하도록 설정D VIC 기자 형광. <ol><li> 주요 방울 독자에게 &quot;세척 시스템&quot;을 클릭하고 ddPCR 분석이 준비합니다. </li><li> 방울 리더에 판을로드하고 &quot;시작.&quot;액적 리더는, 각각의 샘플을 흡인 방울을 singulates 및 2 색 검출기 과거의 단일 파일에 스트림. 검출기는 양극과 음극 샘플을 열거 방울을 읽습니다. </li><li> 액적 판독이 완료되면, 도어를 열고 유닛으로부터 판 홀더를 제거한다. 홀더에서 96 - 웰 PCR 플레이트를 제거하고 폐기합니다. </li><li> 적절한 유지 보수를 위해, 액적 리더 오일을 교체하고 필요에 따라 폐기물 용기를 비우고. 미생물 성장을 방지하기 위해 폐 병에 10 % 표백제 50 ㎖를 추가한다. </li></ol> 2.4 DNA 돌연변이 프로파일 (제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라) 참고 : PCR 양성 및 PCR 음성 방울은 절대 quantific을 제공하기 위해 계산됩니다데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 디지털 형태로 타겟 DNA BRAF V600E 돌연변이의 ATION. <ol><li> 샘플, 분석, 실험에 대한 정보를 입력하는 설정을 클릭합니다. </li><li> 설정 창에서, 플레이트 (filename.qlp)을로드, 데이터를 열고 분석하는 분석을 클릭합니다. 결과 표, 잘 선택기 및 가공 데이터 / 그래픽 디스플레이 : 데이터 분석 인터페이스는 세 개의 창으로 분리된다. </li><li> 처리 된 데이터 창에서 각 대상에 대한 농도 데이터는 판지도의 우물에 나타나는 결과 표에서 표로하고 있습니다. 농도 플롯의 데이터를 시각화하기 위해 농도를 클릭합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

명 Ryuri 아,시 은혜 김과 젊은 Deug 김 ABION CRO의 직원입니다.

여기서는 특정 유전자 돌연변이 진단을위한 기준 표준 FFPE 세포주 샘플들로부터 ddPCR의 적용 및 DNA 분리를 강조. 본 연구에서는, TPS 자동화 DNA 분리 방법이 용이하고 자동화 된 적응 될 수있는 사용되며, 더 큰 규모의 실험 및 하부 가변성을 허용 동시에 48 가지 시료를 수용 할 수있다. 본 연구에서 DNA 분리의 한계 중 하나는 모든 FFPE 시료가 고유 한 표면 오염 물질, 미생물, 식물에서 서로 다를 것, ...

키 조절 유전자의 유전 적 돌연변이의 축적은 암 1에 이르는, 세포 증식, 분화, 생존 등의 정상 세포의 프로그래밍을 변경합니다. RAS-RAF-MAP 키나아제 경로는 성장 신호를 세포 반응을 매개한다. 종양 BRAF 돌연변이는 2 지나친되기 위해 암 단백 BRAF가 발생할 수 BRAF 유전자의 드라이버 돌연변이에서 발생할 수 있습니다. BRAF 유전자의 돌연변이는 또한 차례로, 성장 인자 - 매개 규제 4-6 독립적 과도한 세포 성장 및 증식에 이르게, MEK 및 ERK 3 시그널링을 통한 과민성 하류 초래한다. 여러 가지 도구는 ddPCR으로 포르말린 고정, 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인에서 정량 실시간 BRAF의 V600E 돌연변이로, DNA 돌연변이 프로파일을 사용할 수 있습니다. ddPCR 절대 정량 PCR 기반의 방법입니다종래의 실시간 정량적 PCR (qPCR의) 7,8- 비해 더 높은 정확성을 제공. ddPCR 또한 더 많은 정보를 암 연구 및 진단 9있게 DNA 템플릿 희귀 돌연변이 검출을위한 전력 및 높은 정확도를 해결 제공한다. 낮은 서식 복사 번호 10-12을 연구 할 때 기존의 qPCR에 이상 ddPCR의 추가 장점은 향상된 감도와 정확도를 포함한다. 여기서, 자동 ddPCR 의해 BRAF V600E 돌연변이의 유무를 판정 하였다 FFPE 참조 표준 세포주로부터 DNA를 추출하기위한 프로토콜이 설명된다. 데이터 분석 및 결과의 그래픽 표현을위한 소프트웨어의 사용이 또한 설명된다. 전체 절차는 상대적으로 간단하고 완전히 프로파일 링 할 샘플의 개수 및 사용 가능한 통상적 인 PCR과 ddPCR 기계의 수에 의존한다. 다음 프로토콜은 BR에 대한 표준 절차를 설명<html> AF V600E 양성 FFPE 참조 표준 세포주 (HD598, HD593, HD617, HD273 및 야생형 (WT))는 티슈 제조 시스템 (TPS) 프로토콜을 사용하여 완전히 자동화 된 장비에서 수행된다. 이어서, 절연 DNA 샘플 ddPCR 시스템을 사용 BRAF V600E 돌연변이의 존재에 대해 분석된다. 모든 샘플들이 파일링 된 후에 표적 돌연변이 분석이 수행되고 데이터가 데이터 분석 소프트웨어로 로딩되었다. 샘플의 수에 따라 / 기 공부, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 요구할 수있다. 방법론의 실험적인 구성 요소는 처리에 정확성을 필요로 <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="효모에서 핵산을 분리, 조브 과학 교육 비디오는 RNA의 상황에 대해에 대한 자세한 설명">DNA를</a> 하고rological 피펫과 피펫, 피펫의 상황에 대해에 대한 자세한 내용을 설명하는 조브 과학 교육 비디오 &quot;&gt; 96 웰 플레이트에 피펫 팅, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

우리 ddPCR 분석을 위해, 우리는 BRAF V600E 돌연변이 FFPE 참조 표준 세포주를 연구했다. 액적 리더는 노트북 컴퓨터 실행 데이터 분석 소프트웨어에 연결합니다. 각 방울은 (+) 또는 인 형광 진폭에 기초하여 정의된다. 제조자에 의해 제공된 소프트웨어는 또한 사용자 정의 컷오프는 양극과 음극 사이에 물방울 임계 값을 정의하기 위해 입력 할 수있다. 샘플의 양 및 음의 방울의 수는 복사 / μL?...

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

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Biology

13.1K 조회수.  Seoul National University.  이 비디오의 목적은 임상에서 드문 돌연변이를 검출하는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 참조 표준 셀 라인과 디지털 방울 PCR (ddPCR) 분석 자동화 된 DNA 추출을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. FFPE 샘플에서 돌연변이를 검출하는 것은 FFPE 샘플에서 ddPCR의 임상 적 유용성을 보여줍니다. 

비디오: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

연구

생물학

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

면역 형광 측정 바이오 마커 단백질 일상적인 조직 샘플에 대 한 유효성을 검사 하는 표준으로 세포의 양적 Immunoblotting

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...