이 프로토콜은 다양한 천연 또는 합성 공급원의 추출물, 분획 및 화합물과 같은 다양한 유형의 샘플에 대한 예비 일반 독성 평가에 매우 유용한 도구입니다. 우리 프로토콜의 주요 장점은 매우 쉽고 저렴하며 동시에 많은 샘플에서 사용할 수 있다는 것입니다. 또한 수제 장비는 현장의 신뢰성을 향상시킵니다.
이 기술 단계에서는 확장 세포주 또는 생체 내 테스트와 같은 추가 특정 테스트를 거칠 예비 일반 독성 프로필을 기반으로 샘플을 선택하기 위한 스크리닝을 수행합니다. 이 방법은 주로 의약 및 기타 제품 화학 분야에서 생체 샘플을 스크리닝하는 데 사용됩니다. 당사의 프로토콜은 나노 시스템과 같은 다른 종류의 샘플에도 사용할 수 있습니다.
처음 수행하는 동안 Marcia Filipe와 Vera Isca가보고 된 모든 매개 변수에 대한 훌륭한 관찰 기술과 많은주의가 필요하기 때문에 인내심을 가지십시오., 우리 연구실의 박사 과정 학생들이이 절차를 시연하는 데 도움이 될 것입니다. 깔때기 모양의 용기를 검은색 지지대에 놓고 깔때기를 적절한 방향으로 돌려 레벨 표시와 탭을 확인합니다. 수제 마이그레이션 장비를 만들기 위해 두 개의 0.5 리터 플라스틱 병의 상단을 잘라 최종 높이 12cm를 얻습니다.
한쪽면에 직경 1.5cm, 각 병 바닥에서 7cm의 구멍을 만들고 두 구멍 사이에 13cm 고무 튜브를 삽입합니다. 뜨거운 접착제로 개구부를 밀봉하고 15 분 동안 건조시킵니다. 병을 평평한 표면에 놓고 물로 채워 누출이 없는지 확인하십시오.
인공 소금 용액 800ml에 소금 28g을 첨가하거나 새우 소금을 리터당 35g 농도로 소금물에 담그십시오. 모든 소금이 완전히 녹을 때까지 교반 막대와 섞는다. 샘플을 준비하기 위해 적절한 양의 각 추출물과 화합물 디메틸설폭시드 또는 DMSO를 밀리리터당 10밀리그램의 최종 농도로 용해시킨다.
그런 다음 990 마이크로 리터의 인공 식염수를 사용하여 새로운 마이크로 원심 분리 튜브에서 각 샘플 10 마이크로 리터를 희석하여 밀리리터 당 0.1 밀리그램의 최종 농도를 얻습니다. Erlenmeyer 플라스크의 흄 후드 아래에서 밀리리터당 1밀리그램 농도의 증류수에 중크롬산칼륨 용액을 준비합니다. 부화 용기에 최대 500 밀리리터 표시의 배지를 채우고 소금 용액에 한 스푼 또는 약 0.5 그램의 소금물 새우 낭종을 첨가하십시오.
컨테이너를 닫습니다. 램프를 장비 쪽을 직접 가리키도록 놓고 켭니다. 공기 공급 시스템을 장비 상단에 있는 커넥터에 연결하고 펌프를 켭니다.
소금물 새우 낭종은 격렬한 통기, 지속적인 조명 및 안정적인 온도 하에서 인공 소금 용액에서 부화합니다. 24 시간에서 48 시간 후, 알이 부화하면 공기 펌프를 끄고 nauplii가 빈 달걀 케이스에서 분리 될 때까지 기다리십시오. 부화되지 않은 알을 살아있는 nauplii에서 분리하려면 바닥의 콘센트 탭을 열고 수제 이동 장비 컨테이너의 컨테이너 중 하나에 깔때기의 내용물을 배출하십시오.
nauplii와 부화되지 않은 나머지 계란이 들어있는 용액이 튜브 레벨 아래에 있는지 확인하십시오. 장비를 인큐베이터에 4 시간 동안 놓은 다음 두 번째 용기에 잔류 염 용액을 튜브 높이 위에 넣으십시오. 알루미늄 호일을 사용하여 용기를 nauplii와 나머지 부화되지 않은 계란으로 덮고 소금 용액만으로 두 번째 용기에 램프를 놓습니다.
소금물 새우는 빛에 끌려 한 용기에서 다른 용기로 이동하여 계란과 살아있는 아르테미아 사이의 효율적인 분리로 이어집니다. 수확 용기로부터, 10 내지 15 노플리를 함유하는 900 마이크로리터의 식염수를 수집하고, 용액을 24 웰 플레이트의 하나의 웰에 둔다. 모든 샘플은 사중 확대로 테스트됩니다.
각 음성 대조군 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 양성 대조군, 인공 염 용액, 및 각각의 샘플을 웰에 넣고 플레이트를 조명 하에 24시간 동안 인큐베이션한다. 24 시간 후, 양안 현미경으로 각 우물에서 죽은 유충의 수를 12 x 배율로 등록하십시오.
100 마이크로 리터의 중크롬산 칼륨 용액을 첨가하여 나머지 살아있는 유충의 죽음을 유도하고 6 시간 동안 기다립니다. 현미경으로 각 우물의 총 죽은 유충을 세고 화면에 표시된 방정식에 따라 사망률을 결정합니다. 모든 테스트를 삼중으로 수행하고 표준 편차를 계산합니다.
마지막으로, 결과를 각각 내부 사중 확대 플러스, 마이너스 표준 편차가있는 3 개의 독립적 인 실험의 평균으로 표현하십시오. Plectranthus 종에서 추출되고 반 합성에 의해 얻어진 선택된 화합물의 구조가이 그림에 나와 있습니다. 현미경으로 본 아르테미아 살리나의 새로 부화한 노플리가 이 이미지에 나와 있습니다.
이 그래픽 이미지는 밀리리터당 0.1밀리그램의 Plectranthus 종의 메탄올 추출물 4개에 24시간 노출된 후 Artemia Salina의 사망률을 나타냅니다. 모든 추출물은 이 분석을 사용하여 일반적인 독성의 관점에서 허용가능하였다. 여기서 소금은 소금 용액 또는 공란에 해당합니다.
중크롬산 칼륨은 양성 대조군으로, DMSO는 음성 대조군으로 사용되었다. 시험된 모든 추출물은 블랭크 및 음성 대조군에 대해 등록된 것들에 필적하는 매우 낮은 사망률 값으로 매우 고무적인 결과를 보였다. 밀리리터 당 0.1 밀리그램의 5 가지 순수 화합물에 24 시간 노출 된 후 Artemia Salina의 사망률이이 그림에 나와 있습니다.
이 데이터로부터이 분석을 사용하여 5 개만이 최소한의 독성을 보여줍니다 특히 부화, 이동 및 수집의 세 단계를 기억해야합니다. 결과적으로, 우리는 다른 새우와 함께 일할 숫자를 분리했습니다. 예비 사이트는 세포 배양 또는 얼룩말 물고기와 같은 다른 사이트에 비해 간단하고 저렴한 모델 채널 독성입니다.
또한, 더 비싼 세포독성 부위가 이용될 수 있다.
