이 연구는 NIH/NIAID AI112423와 벤자민 K. 첸을 NIH/NIGMS GM113885와 탈리 아 헤 Swartz에 NIH/NIAID K08-AI120806 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 아이 칸 학교 의학의 마운트 시 나이 학장의 흐름 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다.

1입니다. 대상 셀 라인의 세대
참고:이 단계는 선택 사항; 기존의 RG 대상 셀 라인을 사용 하 여, 2 단계에서 시작.
<ol><li>70% confluent 10 cm 접시 pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE10 와 pCL 10A112 (포장 플라스 미드) [10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10 mL]에 293T 세포11 의 cotransfect는 1:1 비율 (총 20 µ g)에 칼슘에 기초를 둔 transfection13사용 하 여.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 23 ° C에서 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 바이러스 표면에 뜨는 48 h 후 transfection의 10 mL를 수확.</li>
	<li>10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>적절 한 크기에 필터링 된 바이러스 상쾌한 약 수 (일반적으로 0.5-1 mL aliquots). 이러한 다음 단계에서 즉시 사용할 수 또는 수 있습니다-80 ° C에서 냉동 고 저장.</li>
	<li>바이러스 성 상쾌한의 50-100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시에는 선택의 셀 라인을 감염. 5% CO2와 37 ° C에서 세포 문화. RFP 신호 대로 24 h (40 X 확대, 532 nm 여기, 588 nm 방출) 형광 현미경에 나타납니다 하지만 최대 72 시간 소요 될 수 있습니다. 참고:이 실험에서 Jurkat 세포 사용 되었다, 그러나 다른 유형 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>10 우물의 시리즈를 설정 하 여 puromycin와 적어도 1을 잘 떠나, 각각 추가 puromycin 선택 불리고 셀 컨트롤 (5 µ g/ml에서 0.5 µ g/mL 농도의 범위 사용;이 5 월 셀 형식에 따라 다릅니다)로 치료. 세포 생존 능력 (셀 세포 puromycin 저항 없이 셀에 발생 합니다) 몇 일 동안에 비해 치료 제어 및 puromycin RFP 표현 셀만 생존의 농도 사용 하 여 모니터. 참고: transfected 세포 생존 하는 동안 untransfected 셀을 살해 하는 농도 선택 합니다.</li>
	<li>단일 셀 흐름 cytometry 정렬 또는 제한 희석 사용 하 여 (참조 단계 1.8-1.10), 단일 셀1 클론 셀 라인 (성장에 몇 주 걸릴 수 있습니다)를 개발 하는 것에서 파생 된 문화를 성장.</li>
	<li>희석 메서드를 사용 하는 경우는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 그리고 약 500 세포/ml 샘플을 희석.</li>
	<li>96 잘 접시에서 [10 %FBS 2% 페니실린 스, Jurkat 세포를 사용 하는 경우와 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체] 미디어의 50 µ L로 셀 희석의 50 µ L 플라스틱 하 고 11 웰 스를 포함 하는 미디어의 50 µ L로 1:1 직렬 희석을 수행 합니다. 최상의 결과 얻으려면 적어도 10 복제를 수행 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C) 또는 약 4 주 판의 현미경 검사 법 (40 X)을 통해 세포 성장을 모니터링 합니다. 클론 문화에 대 한 (볼 통해 현미경, 40 X)로 성장 최저 puromycin 농도에서 문화를 선택 하십시오.</li>
	<li>23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 문화 (500, 000 셀/mL는 hemocytometer로 계산)의 20 mL centrifuging와 10 %DMSO FBS의 500 µ L에서 resuspending는 aliquots를 고정 합니다. 셀-냉동 컨테이너를 사용 하 여-80 ° C에서 그것을 배치 하 고 액체 질소에 저장 합니다.</li>
</ol>2. 세포-세포 바이러스 전송
<ol><li>
대상 셀의 준비
	<ol>
<li>37 ° C 물 욕조에 그것을 두어서 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 800 x g 23 ° c.에서 5 분 동안에 혼합물을 원심 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어. 참고: RPMI 완전 한 매체 RPMI 1640, 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 단위/mL 페니실린, 및 100 mg/mL 스 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.</li>
		<li>전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 세포의 준비
	<ol>
<li>해 동 untransduced Jurkat 세포와 RPMI의 20 mL와 T-75 플라스 크에 그들 완료 중간 (단계 2.1에서에서와 같이), 200000-800000 셀/mL의 조밀도 유지 하는 문화.</li>
		<li>원심 7,500,000 셀 (800 x g 5 분) 및 그들의 보충과 nucleofection 솔루션 V 120 µ L에서 resuspend ( 재료의 표참조). Electroporation 베트 셀 전송 하 고 개 그 iCre1 DNA의 4.5 µ g을 추가 합니다. Transfect 세포 (electroporation 기반 접근을 통해 테이블의 자료를 참조 하십시오)를 적절 한 프로그램 (예:S-18)를 사용 하 여 및 다음 즉시 RPMI 매체의 3 mL에 그들을 전송 (10 %FBS).</li>
		<li>셀 5% CO2와 37 ° C에서 그들을 하룻밤 배양 하 여 복구할 수 있습니다.</li>
		<li>다음날 아침, 23 ° C에서 5 분 동안 800 x g 에서 세포를 원심 고 RPMI 완전 한 매체, 2 h 37 ° C (5% CO2)에서 시험 설치를 진행 하기 전에 복구할 수 있도록 3 mL에 그들을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
공동 문화
	<ol>
<li>(기증자 및 대상 셀)의 분석을 잘 당 50, 000 셀 (800 x g 23 ° C에서 5 분) 내려 hemocytometer 다음 스핀을 사용 하 여 셀을 계산. 1 x 106 셀/mL RPMI puromycin 없이 완전 한에 resuspending.</li>
		<li>한 접시에 추가할 기증자 세포 현 탁 액의 25 µ L 각 잘; 또 다른 접시에 대상 셀의 25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 잘 복합 테스트의 25 µ L 희석 RPMI 적절 한 농도에서 완전 한 매체에 추가 합니다. 30 분 동안 화합물과 기증자 및 대상 셀을 품 어. 참고: 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. IC50 를 알 수 없는 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 준비.</li>
		<li>전처리, 후 다른 한 접시의 내용을 pipetting으로 대상 세포 기증자 세포를 결합 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry
	<ol>
<li>2%의 최종 농도에 각 음에 paraformaldehyde (PFA)를 추가 합니다. 참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.</li>
		<li>주의: PFA 노출 된 피부와 눈에 유해한입니다. 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 고글을 착용 하 고 안전 후드에서 재고 솔루션을 처리.</li>
		<li>MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. 참고: 그것은 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.</li>
		<li>GFP 특정 채널에 형광 현미경 검사 법 (40 X) 통해 GFP 신호를 시각화 (여기 필터 400 nm와 508의 방출 필터 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 대체 프로토콜 셀 무료 바이러스 감염에 대 한
<ol><li>
대상 셀의 준비
	<ol>
<li>37 ° C 물 목욕으로 배치 하 여 Jurkat RG 기자 세포의 해 동 한 500 µ L 유리병. RPMI 완전 한 매체의 10 mL로 세포 유리병에서 플라스틱 및 다음 원심 RPMI 완전 한 중간 800 x g 23 ° c.에 5 분에서 20 ml RPMI T-75 플라스 크에 완전 한 매체의 펠 릿을 resuspend. 플라스 크 하룻밤 (37 ° C, 5% CO2)를 품 어.</li>
		<li>다음 날, puromycin (미디어의 8 mL 당 2mg/mL 주식의 1 µ L)의 0.5 µ g/mL를 추가 합니다. 200000-800000 셀/mL ( 통해 hemocytometer 계산)의 밀도 유지 하는 세포 문화.</li>
		<li>전송 분석 결과를 설정 하기 전에 하루 puromycin의 0.5 µ g/mL를 포함 하는 신선한 RPMI 매체에 200000-400000 셀/mL까지 셀을 분할 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀-무료 바이러스의 생산
	<ol>
<li>Transfect 293T 세포11 의 70% confluent 10 cm 접시 (10 %DMEM 10 ml에서 FBS) 칼슘에 기초를 둔 transfection13를 사용 하 여 개 그 iCre1 플라스 미드의 5 µ g를. 참고:이 규모는 약 2 ~ 4 96 잘 접시, 여 transfection 효율에 따라 충분 하다 바이러스의 10 mL을 생산할 예정 이다.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브로 접시에서 미디어를 pipetting와 펠 렛의 모든 세포 파편을 5 분 동안 3000 x g 에서 튜브 centrifuging 48 h에 전체 바이러스 상쾌한 수확.</li>
		<li>10 mL 주사기를 0.45 μ m 필터를 연결 합니다. 원심, 후 전체 표면에 뜨는 고 주사기를 로드. 깨끗 한 15 mL 튜브로 통해 샘플을 실행 합니다.</li>
		<li>바이러스를 사용 하 여 대상 셀 즉시 (단계 3.3) 감염 또는 동결 하 고-80 ° C (사용 전에 필요에 따라 샘플 thaw)에 바이러스를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감염
	<ol>
<li>(에서 단계 3.1.3) RG Jurkat 대상 셀의 개수를 사용 하 여 hemocytometer를 스핀 800 x g 에 잘 당 50000 대상 셀 5 분, puromycin 없이 매체 완료 resuspending 1 x 106 셀/mL RPMI에 셀.</li>
		<li>한 접시에 추가할 RG Jurkat 대상 셀의 25 µ L 각 잘; 별도 접시에 25 µ L 추가 (2 기) 각 우물에 바이러스.</li>
		<li>각 잘 추가 25 µ L 복합, 테스트의 적절 한 농도에서 미디어에 희석 합니다. 셀과 30 분에 대 한 화합물과 바이러스를 품 어. 참고: 테스트 농도 약물 마다 달라 집니다. 알려진된 IC50경우에, 위와 아래에 넣는 출발점으로 서 이것을 사용 합니다. 알 수 없는, 경우 최종 농도 10 µ M의 200 µ M 재고 매체 준비.</li>
		<li>전처리, 후 대상 셀에 우물에서 바이러스/화합물 혼합의 전체 콘텐츠 (50 µ L)를 추가 하 고 조직 문화 인큐베이터 5% CO2와 37 ° c에 40 h에 대 한 모든 것을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry
	<ol>
<li>2%의 최종 농도에 각 잘 PFA 추가. 참고: 16% 재고 솔루션에 대 한이 100 µ L 당 14 µ L 잘.</li>
		<li>MCherry와 FITC 채널 교류 cytometer 셀 읽기. GFP 신호는 GFP 채널에 형광 현미경 시각 을 통해 수 있습니다. 참고: 한 번 감염 된 세포 vs배경 위에 GFP를 표현 하는 세포의 5-20%를 볼 기대할 수 있습니다. 감염 되지 않은 세포.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. 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저자는 공개 없다.

개 그-iCre 분석 결과 바이러스 성 복제의 융해 단계를 억제 수 있습니다 약물 후보 심사에 대 한 매우 도움이 될 입증 되었습니다. 이 분석 결과 수행할 때 좋은 신호를 얻을 가장 중요 한 단계는 대부분의 바이러스 감염 분석 유사. 첫 번째 중요 한 단계는 좋은-품질 바이러스의 높은 titers 생산 하 고 있다. 이 단계에서는 293T 세포 passaged 자주 (적어도 모든 48 h x 1) 그래서 그들은 될 overconfluent와 함께...

소설 항 레트로 바이러스 치료를 위한 필요 에이즈-1의 억제제에 대 한 높은 처리량 스크린의 개발을 자극 했다. 개 그-iCre 기자 분석 결과 특히 호스트 세포 막1바이러스 막 융합을 측정 하 여 셀 감염 시스템에서 융해 단계에서 바이러스 항목의 억제제를 식별 하기 위해 개발 된다. 분석 결과 개발 되었다 바이러스 막 융합의 지점까지 에이즈-1 감염의 초기 단계에서 구체적으로 행동 하는 비 발한 억제제에 대 한 화면으로. 한 도전-셀 감염 측정은 새로운 감염을 측정 하는 것은 입력된 셀에서 차별 어렵다 그래서 초기 inoculum 감염된 기증자 세포와 ininfected 대상 셀 포함. 이상적인 시스템 분리 유전자 마커를 대상 세포 감염의 개시에 의해 유도 될 수 있다 포함 하 고 기증자 세포에 존재 하지 않습니다. 인기 있는 바이러스 내용을 바이러스 성 단백질 효소 퓨전, 연기-Vpr에 따라 분석 결과 혼합 효과적일 수 있다, 그러나 높은 처리량, 셀 심사2에 대 한 제한이 있다. 이 분석 결과 베타-lactamase (연기) 리포터 유전자를 에이즈-1 Vpr을 융합, virions로 포장 이며, 바이러스 성 막 퓨전 시 대상 세포에 전달이 포함 됩니다. 기판 CCF2 오전 대상 세포의 세포질에 로드 하 고 분열 시 형광 변화를 겪 습. CCF2 오전 기판 비싼 이며, 높은 처리 화면에 대 한 금지 될 수 있습니다. 기증자 및 대상 셀을 구별 하기 위하여 그것은 염료 레이블에 필요한 대상 인구. 마지막으로, 프로토콜 화합물의 큰 숫자를 테스트 하는 경우 부담 하 고 비용이 많이 드는 될 수 있는 몇 가지 세척 및 인큐베이션 단계를 요구 한다.
개 그-iCre 분석 결과 높은 처리량 셀 전송에서 퓨전의 억제제에 대 한 검사를 개발 하는 것이 문제에 해결책으로 개발 되었다. 이 시스템은 기판 셀으로 로드할 수 필요 하지 않습니다. 분석 결과 셀 무료 연구에도 사용할 수 있습니다 그리고 의사 형식화 된 HIV-1 개 그-iCre 바이러스 입자를 사용 하 여 다른 바이러스 성 융합 연구에. 그러나 에이즈-1 개 그-iCre 분석 결과3,,45마찬가지로 이러한 실제 바이러스 입자를 사용 하지 않는 HIV 환경을 중재-셀 퓨전 분석 바이러스 환경을 단백질 중재 세포 융합, 측정할 수 있습니다. 이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경으로 읽을 수 있습니다. 그것은 FDA 라이브러리 뿐만 아니라 purinergic 억제제1,6의 작은 도서관을 화면으로 성공적으로 사용 되었습니다. 다른 수 사관 들도 보고 바이러스 캡슐화 beta lactamase 세포질7,8 로 전송 하는 적응 하 고 최적화 된 높은 처리량 퓨전 분석 결과 사용 하 여 HIV-1 융합 저 해제 purinergic 식별 .
개 그-iCre 바이러스는 매트릭스와 에이즈-1 효소 사이트9에 의해 형벌 capsid Cre recombinase 삽입 개 그-iGFP 바이러스에 유사한 방식으로 설계 되었습니다. Cre 효소 성숙 hiv-1 프로 테아 제 초기 바이러스 입자 내에서 활성화 되 면 개 그 polyprotein 내에서 삽입 하는 전조로 이루어집니다. 따라서, Cre 납품은를 대상 셀 을 통해 바이러스 성 막 융해 과정에 효소 활성화 HIV-1 입자의 내용 전달에 의존 합니다. 프로토콜의 두 가지 버전은 여기에 제공 됩니다. 첫 번째는 에이즈-1 감염 인구를 사용 하 여 직접 셀 전송의 HIV 연구 대상 세포를 감염. 두 번째 버전 셀 무료 바이러스를 사용 하 여 셀 무료 바이러스 감염 연구. 셀 전송 분석 결과 셀은 이미 해 동 하 고 passaged 세포를 해 동 하는 날 로부터 7 일 또는 5 일 걸립니다. 경우에 세포를 해 동 하 여 passaged 셀 무료 감염 분석 결과 5 일 셀 해 동 될 필요가 있는 경우 및 3 일에서 수행할 수 있습니다. 지침은 또한 Clevers 랩10에 의해 만들어진 플라스 미드를 사용 하 여 원하는 셀 형식 (해당 되는 경우 기존의 RG 대상 셀 라인은 사용 하지 않는)에 RG (빨강-녹색) 대상 셀 라인을 생성 하 주어진 다. 적절 한 biosafety 주의 바이러스와 바이러스 표현 셀이 분석이 결과에 찍힌다는 것이 좋습니다. 우리는 BSL2 + 조직 문화 시설에서이 분석 결과의 감염 부분을 수행합니다. 셀 고정 후 표준 흐름 cytometry 및 현미경 시설에서 분석할 수 있습니다.
소설 화합물에 대 한이 분석 결과의 응용 프로그램 화면을 설명 하는 여기 HIV-1 바이러스 막 융합 (그림 1)을 억제. Purinergic 수용 체는 프로-염증 성 중재자. 우리 연구소는 비 선택적 억제제 purinergic 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 퓨전6의 행위로 설명 했다. 우리는 높은 처리량이 분석 결과의 활용 소설 HIV-1 바이러스 막 융합 억제제를 식별할 수 있는 것을 보고 합니다. Purinergic 클래스의 수용 체의 억제제 에이즈-1 바이러스 막 융합 억제제의 새로운 클래스를 나타냅니다 보여 줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5546</td>
			<td>Media for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R0883</td>
			<td>Media for Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>Serum for 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30087.03</td>
			<td>Serum for Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Penn/Strep used in both media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3073</td>
			<td>Used for Culture of Jurkat Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td>Used for Culture of 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>Used for fusion assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyjet Transfection Reagent</td>
			<td>Signagen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Used to transfect 293 Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537-100ML</td>
			<td>Used in wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone Trypsin Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>For Trypsinization of 293 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VACA-1003</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque plus</td>
			<td>GE Healthcare Life sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td>For Nucleofection of Jurkats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td>For all tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor Tips</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P3020-CPS</td>
			<td>For all tissue culture and liquid handling steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex Syringe Filter (0.45 micron)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHA033</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Slip Tip Sterile syringes</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>309656</td>
			<td>For filtration of virus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>2b</td>
			<td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Fortessa Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for flow cytometry analyss of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>Various models</td>
			<td>Fortessa 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32702</td>
			<td>Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCL10a1</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NBP2-29542</td>
			<td>Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gag-iCre</td>
			<td>Benjamin Chen Lab</td>
			<td></td>
			<td>Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

이 분석 결과 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 구체적으로 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 (GFP) 감지의 표현 하도록 설계 되었습니다. 에이즈-1 기자 바이러스 (에이즈-1 개 그-iCre)는 Cre recombinase 매트릭스와 개 그 polyprotein의 capsid 단백질 V-1 게놈으로 삽입 하 여 생성 됩니다. 다음 대상 셀에 발표 바이러스 입자로 Cre recombinase의 포장에서이 결과 라인 Cre recombinase 활성화 빨간 형광 성 단백질 (RFP) GFP 스위치 카세트를 안정적으로 표현. 기저 상태에서이 카세트만 RFP를 표현합니다. 목표 셀에 Cre recombinase의 배달, 다음 loxP 사이트에 의해 형벌 RFP, GFP 식 결과 excises. 이 분석 결과 어떤 억제제 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 셀 및 셀 감염 시스템에서 테스트를 사용할 수 있는 그리고 HIV-1 바이러스 막 융합의 비 발한 억제제로 purinergic 수용 체 길 항 근의 클래스를 식별 하는 데 사용 되었습니다.

감염 되지 않은 RG Jurkat 세포 (그림 2A, 감염 되지 않은 열) 매우 강한 RFP 신호 배경 GFP 신호 (0.3%)의 낮은 수준 전시. 개 그-iCre 감염 에이즈-1 융합 억제제 AMD3100의 존재 동안 GFP 신호 (24.9%) 증가 하면 (20 µ M)이이 신호를 감염 되지 않은 배경 수준 (0.34%)으로 데 려의 개발을 억제. 때 반전 녹음 방송 억제 물 어 같은 후 퓨전 이벤트의 억제제 (2 µ M) 사용, 신...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

a-high-throughput-cre-lox-activated-viral-membrane-fusion-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute. 우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

연구

면역학 및 감염병학

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.