작품은 NIH 교부금 AI57159 (SCH)을하고 AI72346 (AMvO)을 지원했다. SCH는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.

유리 커버 슬립 작용화 퓨전 분석에 사용되는 평면 이중층은 dextran의 수산화 필름에서 지원됩니다. Dextran은 평면 이중층과 유리 표면 사이에 스페이서 역할을합니다. 이것은 유리 표면에 붙어되는 것을 막 구성 요소를 방지할 수 있으며 바이러스 입자의 내용이 융합시 탈출 수있는에 공간을 제공합니다. 유리 coverslips 우리가 화학적으로 결합 dextran에 유리 (Elender, 외. 1996) 수 실란 에폭시와 치료를 통해 작용하고 있습니다. <ol><li> 세라믹 얼룩의 랙에 25mm coverslips을 마련하고, JAR 또는 비커에 선반을 배치. </li><li> 실험실 등급 유리 세제의 10 % 용액으로 컨테이너를 채웁니다. 30 분 초음파 청소기의 컨테이너를 놓습니다. </li><li> 1M postassium 수산화와 용기와 coverslip 걸이 탈이온수과 함께, 그리고 리필 린스. 다른 30 ​​분 동안 목욕 sonicator에 컨테이너를 반환합니다. </li><li> 아세톤과 에탄올을 사용하여 청소 절차를 반복합니다. </li><li> 물, 건조에 coverlips을 씻어. </li><li> 마지막으로, 3 분 산소 플라즈마 스트리퍼 coverslips를 청소하십시오. </li><li> 마지막 청소 단계는 다음 silanization 단계에있는 유리가 균일하게 친수성 ​​및 반응하고, 표면을 산화. </li><li> 이소프로판올 3 - glycidoxypropyltrimethoxy 실란의 0.2 % 용액을 준비합니다. 5 분 동안이 솔루션에 coverslips 젖어. </li><li> 실란 솔루션을 취소하고 이소프로판올에 coverslips 여러 번 씻어. </li><li> coverslips 지금 실란의 레이어 코팅 있지만, 그들은 유리에 covalently 결합하는 실란 수 있도록 치료해야합니다. 한 시간 만이라도 섭씨 27 도의 온도로 설정된 오븐에 coverslips를 놓습니다. </li><li> coverslips가 치료하는 동안, dextran 500 밖으로 무게와 30 % W / V 솔루션을 준비합니다. 물을 예열하면 해체를 지원합니다. 우리는 coverslip마다이 솔루션의 약 1 ML을 사용합니다. dextran이 해소되면, 진공 건조기에서 솔루션을 defoam. </li><li> silanized coverslips은 치료가 완료되면, 세라믹 랙에서 그들을 제거하고 플라스틱 냉동실 상자의 안쪽에 그들이 평평하게 주선해드립니다. dextran 솔루션 ~ 1 ML 각 coverslip의 상단 표면을 커버하기 위해 1 ML의 피펫을 사용합니다. 냉장고 상자를 닫고 24~36시간을위한 조용한 장소에 둡니다. </li><li> 플라스틱 집게로 coverslips 쥐고 있지만, 초과 dextran을 부어 및 세라믹 랙에 그들을 대체합니다. 물속에 coverslips 여러 번 씻어하고 coverslips는 48 시간 동안 물에 담그다 수 있습니다. 항아리는 부드럽게 테이블 톱 회전에 흥분 수 있습니다. </li><li> 80 섭씨와 진공 건조기에 저장하도록 설정 오븐에 coverslips 건조. </li></ol> 리포좀 준비 지원 지질 bilayers는 dextran 기능화 coverslip에 liposomes를 adsorbing에 의해 형성됩니다. 막 파열 및 표면에 평평하게 퍼져 때까지 둘은 서로 함께 adsorbed liposomes 퓨즈. <ol><li> 분석에 사용되는 일반적인 리포좀 제형은 1,2로 구성되어 dioleoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (DOPC), 1 - oleoyl - 2 - palmitoyl - SN - glycero - 3 - phosphocholine (POPC), 콜레스테롤, 보빈 뇌 Disialoganglioside (GD 1A) 및 N - ((6 - (biotinoyl) 아미노) hexanoyl) 4:4:2:0.1:5의 비율 X10 -5에서 -1,2 - dihexadecanoyl - SN - glycero - 3 - phosphoethanolamine. 모든 구성 요소는 클로로포름 또는 클로로포름과 메탄올이 솔루션에 저장됩니다. </li><li> 유리 시험관에 각 구성 요소의 볼륨을 전송하여 지질의 두 micromoles을 포함하는 혼합물을 준비합니다. 아르곤 또는 질소 가스 스트림에서 용매를 증발. 두 시간 동안 진공 건조기에서 테스트 튜브를 떠나하여 남아있는 용매를 제거합니다. </li><li> HNE 버퍼 400 microliters (5 MM의 HEPES, 145 MM NaCl, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 말린 지질 필름을 Resuspend. </li><li> 플라스틱 microcentrifuge 관에 정지를 전송합니다. 온수 욕조에 액체 질소 욕조와 해동의 현탁액을 고정. 이 동결 / 해동 사이클에게 네 번 반복합니다. </li><li> 100 nm의 폴리 카보 네이트 막 필터와 지질 압출기를 조립하고, 지질 정지 25 번 돌출. 서스펜션은 압출 후 더 투명으로 나타납니다. </li><li> Liposomes은 그들이 준비하는 일에 사용해야합니다. 사용하기 전까지 그들은 상온에서 저장할 수 있습니다. </li></ol> Microfluidic 흐름 셀 준비 간단한 microfluidic 흐름 세포는 석영 슬라이드와 기능화 coverslip 사이의 이중 스틱 테이프를 sandwiching에 의해 이루어집니다. <ol><li> 20x20x3 mm 석영 슬라이드를 구합니다. 반대편에 두 1mm 구멍을 드릴 수있는 다이아몬드 버를 사용합니다. </li><li> 이중 스틱 테이프의 시트에서 20mm 광장 컷하고, 면도날을 사용하여 중앙에서 15 X 2mm 부분을 도려. </li><li> 하나 테이프 백업의 측면, 그리고 쿼트 테이프를 준수에서 필Z 슬라이드. 기능화 coverslip에 반대편을 준수합니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜빙의 두 20cm 길이를 잘라 석영 슬라이드에있는 구멍에 그들을 삽입합니다. </li><li> 5 분 에폭시 접착제로 흐름 전지를 밀봉합니다. </li><li> 버퍼와 접착제가 치료가, 총리 흐름 전지 및 튜브. </li><li> 지원되는 지질 이중층은 채널로 리포좀 현탁액의 약 80 microliters를 그림으로써이 단계에서 형성된 수​​ 있습니다. </li></ol> 바이러스 입자 라벨 <ol><li> H3N2 인플루엔자는 (X - 31) 일반적으로 융합 분석에 사용하지만, 다른 독감 종자와 다른 바이러스가 성공적으로 사용되었습니다. </li><li> 바이러스는 hemifusion과 기공 - 형성의 검출을 허용하는 두 개의 서로 다른 형광 염료로와 표시됩니다. </li><li> 20 MM 솔루션을 만들기 위해 HNE 버퍼에 sulforhodamine B (SRB)을 디졸브. 바이러스 정지 10 microliters와 염료 용액 20 microliters을 결합, 20 시간 동안 실온에서 둡니다. 이 기간 동안 염료 천천히 바이러스 입자 내부에 축적됩니다. </li><li> PD - 10 탈염 칼럼을 통해 바이러스 현탁액을 통과하여 여분의 염료를 제거합니다. 충분한 바이러스 재료를 사용하는 경우, 컬러 밴드가 열에 볼 수 있습니다. 이 밴드는 레이블이 바이러스를 포함하고 그것이 eluted 그대로 수령하실 수 있습니다. </li><li> 어떤 밴드는 볼 수 없다면, 200 microliter의 분수를 수집하고 분광 광도계에서 565 nm의 흡수를 측정하여 바이러스로 분류가 포함되어있는 분수를 결정합니다. 바이러스는 약 0.8 ML의 총 볼륨 elute한다. </li><li> SRB 표시 바이러스 중지 octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)의 2 디메틸 포름 아미드 MM (DMF) 용액 13 microliters을 추가하여 바이러스 봉투 라벨. </li><li> 실험실 회전에 튜브를 장착하여 정지를 저어하고 3 시간 동안 둡니다. </li><li> 전에 설명한 것처럼 PD - 10 탈염 칼럼을 사용하여 초과 Rh110C18에서 바이러스를 정화. </li></ol> 현미경 구성 실험은 총 내부 반사 형광 현미경에 적합한 높은 NA 오일 침지 목적이 장착된 형광 현미경에서 수행됩니다. 아르곤 / 크립톤 가스 레이저에서 488 및 568 nm의 라인은 Rh110C18 및 SRB 라벨 바이러스를 자극하는 데 사용됩니다. 각 레이블의 동시 이미징은 분할 이색성 거울과 함께 녹색과 빨간색 형광 방출에 의해 성취와 독립적으로 전자 곱한 CCD 카메라 별도의 반쪽에 이미지를 집중하고있다. 어세 공연 표시 바이러스 입자 코팅 플루오레신와 표면, 낮은 산도 버퍼 (그림 1A)과 반응의 개시의 도킹, 평면 지질 이중층의 조립 : 퓨전 분석의 실행 흐름 세포 내에서 생화학 구성 요소 stepwise 어셈블리를 포함 . <ol><li> 현미경 단계에 흐름 세포를 탑재하고, 분당 40 microliters의 속도로 흐름으로 설정 주사기 펌프에 아웃렛 튜빙을 연결합니다. </li><li> HNE 300 microliters 흐르는 의해 초과 liposomes의 흐름 채널을 해제합니다. </li><li> 현미경을 집중하고 488 ​​nm의 라이트와 568 nm의 빛이 70 W / cm 2 350 W / cm 2 표면을 조명하는 레이저 파워를 조정합니다. 당신은 1.45 NA 60x 기름 침지 목표를 사용하는 경우에는 각각 100 마이크로 왓츠, 20 마이크로 왓츠 레이저 농도를 설정합니다. </li><li> 흐름 세포에 표시된 바이러스 (1 / 100 희석) 펌프. 바이러스가 유동 채널의 바닥 표면 diffuses으로 입자는 지질 이중층에 통합 ganglioside에 집중하기 시작합니다. </li><li> 도킹 바이러스 입자의 적절한 밀도 (최대 전망 분야 1000 주위 입자)를 달성되었을 때. 밀리리터 플루오레신 표시 streptavidin마다이 마이크로 그램을 포함하는 솔루션에 입구 튜빙을 전환합니다. 라벨 streptavidin은 이중층의 결합 지질 분자를 비오틴에 바인딩되며, 결국 희미한 녹색 배경이 표시됩니다. </li><li> HNE 300 microliters와 흐름 채널을 씻으십시오. </li><li> , 이미지 영역을 선택 현미경을 집중하고 시간 타락한 이미지 수집을위한 CCD 카메라를 준비합니다. 100 MS에 노출 시간을 설정하고 10 Hz의 속도로 프레임을 수집합니다. </li><li> 10 MM 나트륨 구연 산염 및 140 MM NaCl을 포함하는 산성 버퍼에 흐르는으로 퓨전을 시작합니다. 버퍼의 산도는 assayed되는 바이러스의 중요한 산도 아래로 조정해야합니다. 산도에서 X - 31 퓨즈는 아래 5.5의. </li></ol> 대표 결과 그림 1B는 융합 전과 중에 이중층 도킹 virions의 스냅샷을 보여줍니다. 각각의 회절 제한된 장소는 개별 바이러스 입자를 나타냅니다. 적색과 녹색의 형광은 별도로 바이러스 봉투와 컨텐츠 레이블의 동시 관찰을 허용, CCD 카메라의 상단과 하단 반쪽에 몇 군데있다. 에 비해 녹색 채널에 두 배나 많은 명소가 일반적으로있다빨강, 이것은 봉투 레이블에 비해 콘텐츠 염료로 라벨의 낮은 효율성을 반영합니다. 플루오레신를 바운드 표면에서 방출 녹색 배경 형광은 구연 산염 버퍼의 도착 사라지고 융합 반응의 시작 시간을 결정 수 있습니다. Hemifusion 이벤트 hemifusion의 줄기를 통해 바이러스 봉투 diffuses의 침묵 Rh110C18로 녹색 형광의 파열로 감지되며 평면 막에 희석합니다. 외부 확장 형광 구름은 평면 막의 지방산 - 아실 연결된 염료의 무료 보급을 보여주는, hemifused 입자 주위에 볼 수 있습니다. 기공 형성은 바이러스 입자의 내부 안에 갇힌 SRB에서 빨간색 형광의 부패로 관찰됩니다. 퓨전 기공의 개통은 염색이 관찰 지역의 평면 이중층 밖으로 아래 수성 공간으로 탈출 할 수 있습니다. 각 입자에 대한 형광 강도의 탄도는 개별 입자의 통합 농도에서 꾸몄다 hemifusion 및 기공 형성 (그림 1C)의 수율 및 시간 결정을 용이하게합니다. Hemifusion 및 기공 형성 이벤트 시간은 Rh110C18 형광 버스트 또는 SRB 신호 부패의 최대 기울기가 발생하는 시점으로 결정됩니다. 성공적인 실험에서 Rh110C18 항복 dequenching 신호 및 SRB 라벨 입자의 30 %로 표시된 입자의 약 50 %는 유용한 신호를 제공합니다. 두 염료로 표시된 입자의 약 10 %가 모두 지질 혼합 및 기공 형성 신호를 보여줍니다. 그림. 2A - C는 전형적인 실험에서 hemifusion 및 기공 형성 지연 시간의 분포를 보여줍니다. Fig.2D - F는 같은 조건에서 수행 다섯 실험에서 결합된 이벤트 이벤트 배포판을 보여줍니다. 도 관찰 겸손한 번호, histograms의 형태는 분명합니다. 각 실험은 산도 드롭 시간의 감지에 의해 동기화되기 때문에, 여러 실험은 결합 수 있으며, 중간 단계를 제한 속도에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="그림 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. 실험 설계. A) 바이러스 입자는 hemifusion와 융합 기공 형성 속도론을 모니터하는 두 형광 염료와 함께 표시됩니다. 형광은 높은 NA 현미경의 목적이 수집하여 CCD에 몇 군데 있습니다. B) 형광 이미지를 전 (왼쪽)와 중 (오른쪽) 개별 바이러스 입자의 융합. 각 이미지의 위쪽과 아래쪽 절반 지원 이중층의 동일한 ~ 50 X 100mm이 지역의 각각 빨간색과 녹색 형광과 일치합니다. C) 붉은 SRB 바이러스성 내용 추적 (상단 트레이스)의 형광 강도는 녹색 Rh110C18 멤브레인 염료 (중앙 추적) 및 플루오레신 산도 센서 (낮은 추적) 산도 드롭, hemifusion, 그리고 퓨전 사이에 경과한 정확한 시간을 제공합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 찬란 분류 바이러스의 퓨전 속도론. 산도 드롭 및 hemifusion (A, D)과 기공 형성 (B, E) 사이의 경과 시간의 배포판. 배포판의 상승과 부패는 여러 중간 단계의 존재를 나타냅니다. hemifusion 및 개별 입자의 융합 기공의 개방 사이의 전환은 기하 급수적으로 단일 속도 - 제한 단계를 제안, 배포됩니다. 패널 AC는 단일 실험의 결과를 보여줍니다. 패널 DF는 동일한 조건에서 수행 다섯 별도의 실험에서 컴파일됩니다. 하시기 바랍니다 <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

유체 및 지속적인 지원 지질 bilayers의 준비 도전하실 수 있습니다. 물질 또는 표면 결함을 오염 미량의은 bilayers의 확산 방지합니다. dextran의 유니폼 레이어주의 청소와 증언이 필수적입니다. 바이러스 입자의 장시간 영상 표백제 형광 라벨을하거나 그들이 inactivated 될 발생할 수 있습니다. 이런 종류의 사진 손상이 잘 바이오 이미징 및 단일 분자 분야에 알려져 있고, 일반적?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

막 융합이 세포로 싸여 바이러스의 항목 중에 필수적인 단계입니다. 기존의 퓨전 assays은 일반적으로 어려운 것인 관련된 분자 단계의 순서를 분석하고, 퓨전 이벤트의 다수에 대한 리포트입니다. 우리는 체외에서 본질적으로 유동적인 지원 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합의 속도론을 모니터하는 두 색 형광 분석을을 개발했습니다. 인플루엔자 바이러스 입자는 멤브레인 및 바이러스 인테리어를 얼룩이 빨간색 친수성 ​​형광단를 얼룩이 녹색 lipophilic 형광단와 incubated 있습니다. 우리는 흐름 세포의 dextran - functionilized 유리 표면에 ganglioside 함유 지질 이중층을 입금, CCD의 입자의 수백을 포함, 평면 이중층 및 이미지 100 X 100 μm의 두 영역의 형광에 바이러스 입자를 품어 카메라. 이미징 모두 빨간색과 녹색 형광함으로써, 우리는 동시에 막 색소 (녹색) 및 입자의 수​​성 내용 (빨간색)의 동작을 모니터링할 수 있습니다. 퓨전 산도 아래 값을 산도를 낮출되면 입자는 세포막과 융합됩니다. Hemifusion은 대상 막의 바깥쪽 전단지와 입소문 막의 바깥 전단지의 병합, 입자의 녹색 형광의 갑작스런 변화로 볼 수 있습니다. 남은 두 말초 전단지의 후속 융합되면 기공이 형성되고 바이러스 입자의 빨간 발광 형광단은 대상 막에 따라 공개됩니다. 이 행사는 개별 입자의 붉은 형광의 감소로 상승을 제공합니다. 마지막으로, 대상 막에 포함된 산도에 민감한 형광단에서 통합 형광이 산도 드롭의 정확한 시간에보고합니다. 세 형광 시간의 흔적에서 모든 중요한 이벤트 (산도 드롭, 기공 형성에 혼합 hemifusion, 컨텐츠에 따라 혼합 지질)는 이제 간단한 방법으로 개별적으로 모든 입자에 대한 추출하실 수 있습니다. histograms에 많은 개별적인 입자에 대한 다양한 변환에 대한 경과 시간을 수집하여, 우리는 해당 중간체의 수명을 결정할 수 있습니다. 직접 형광 관찰가 없어도 숨겨진 중간체는 이러한 histograms에서 직접 시각하실 수 있습니다.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

우리는을 제시<em&gt; 체외에</em&gt; 두 컬러 유체 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합을 시각화하기 위해 형광 분석. differentially 바이러스 멤브레인 및 인테리어 얼룩 fluorophores와 바이러스 입자를 분류함으로써, 우리는 hemifusion과 기공 형성 속도론을 모니터 할 수 있습니다.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

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Research

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Biology

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

연구

생물학

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Qdot 표시 된 단백질과 단일 분자 수준에서 Site-specifically 수정된 λ DNA 사이 상호 작용을 시각화

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...