Name: neutrophil extracellular traps generated by low density neutrophils obtained from peritoneal lavage fluid mediate tumor cell growth and attachment
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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우리 기술 및 사무 작업에 대 한 양 제이 시노하라와 I. Nieda 감사합니다. 또한, 우리 감사 박사 시로 마 츠 모토, 則 Haruta, 켄 타로 쿠라 시, 그리고 카즈야 타카하시 수술 실에 샘플 수집에 대 한 그들의 협력에 대 한. 이 작품은 특정 교육 과학기술부, 과학, 스포츠, 그리고 일본 문화 및 일본 사회에서 과학적인 연구를 위한 과학 진흥 (17 K 10606)에 대 한 지원 했다.

LDN는 환자가이 연구에 등록에서 가져온 하 고 기관 검토 위원회의: Jichi 의학 대학에 의해 승인 했다.
1. 복 부 구멍 Lavages 및 NET 검출에서 LDN의 격리
<ol><li>샘플 수집<ol>
<li>위장 암 복 부 수술을 받은 환자에 상처 폐쇄 하기 전에 복 부 구멍에 직접 일반적인 살 균 염 분의 1000 mL를 달 이다. 참고: 샘플은 연령이 나 성별에 따라 바이어스 없이 위절제술, colectomy, 또는 esophagectomy를 수술 하는 환자에서 얻은 했다. 식 염 수는 컨테이너로 전송 되었고 1 분 이내 전체 복 부에 부 어. 이것은 환자에 중요 한 영향 없이 수술 후 복 막 세척으로 정기적으로 수행 됩니다.</li>
		<li>게 1 분 이상 동안 광범위 하 게 복 부 구멍. 참고: 예제는 균일 한 외과 의사의 손에 생긴된 액체 흔들 천천히 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>4 50 mL 주사기와 게의 200 mL를 복구 합니다. 참고: 때로는 고무 커넥터 체액을 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Granulocyte 특정 mAb, CD66b16를 사용 하 여 복 막 LDN의 정화를 수행 합니다. 참고: 많은 단 세포 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 중간 계층에 포함 된 때문에 긍정적인 선택의 변이 호 중구 CD66b mAb를 사용 하 여 수행 되었다.<ol>
<li>50 mL 튜브에 복 막 게 유체를 전송. 참고:이 단계에서 불순물을 제거 하는 100 µ m 나일론 필터를 통해 액체를 전달 합니다.</li>
		<li>실시간에서 7 분 동안 270 x g에서 복 막 액체 원심</li>
		<li>0.02 %EDTA PBS의 5 mL에 산 탄을 resuspend.</li>
		<li>조심 스럽게 3 mL 밀도 그라데이션 솔루션에 세포 현 탁 액의 5 mL을 오버레이.</li>
		<li>휴식 없이 RT에서 15 분 동안 1700 x g에서 원심.</li>
		<li>피 펫을 사용 하 여 중간 레이어 (그림 1A)를 포함 하는 솔루션의 2 ~ 3 mL를 수확 하 고 0.02 %EDTA PBS의 10 mL와 함께 그것을 혼합.</li>
		<li>RT에 7 분에 대 한 400 x g에서 복 막 액체 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>실시간 삭제는 상쾌한에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기와 0.02 %EDTA, PBS의 또 다른 10 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>마그네틱 셀 분리 키트에 대 한 버퍼의 60 µ L에 셀 펠 릿 (1 x 107)를 용 해.</li>
		<li>펠 릿을 Fc 블록의 20 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어</li>
		<li>20 µ L 안티-CD66b의 microbeads와 활용 및 4 ° c.에 추가 10 분 동안 품 어 추가</li>
		<li>세척 하 고 다시 맥 버퍼의 500 µ L에서 알 약을 중단.</li>
		<li>적당 한 자석 분리기의 자기장에서 자석 열에 세포 현 탁 액을 적용 하 고 버퍼의 15 mL과 열 세척 하 여 흐름을 통해 포함 된 CD66b(-) 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 여 자석으로 레이블이 지정 된 CD66b(+) 세포 밖으로 플러시. 참고: CD66b(+) 세포 인구 구성 되어 주로 호 중구 나타내는 FACS 분석에 의해 결정으로 > CD66(+) 분수의 95%는 CD11b, CD15, 및 CD16, 긍정적인 CD14에 대 한 부정적인.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그물의 세대<ol>
<li>RT에서 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리 후 다시 격리 LDN를 일시 중단 (5 x 106) 10 %FCS RPMI1640의 1 ml에서.</li>
		<li>5% CO237 ˚C에서 2 h 6-잘 폴 리-L-리 신 코팅된 접시 (직경에서 6 cm)에 LDN 문화.</li>
		<li>5 µ M의 최종 농도에서 녹색 형광 counterstain (핵과 염색체 얼룩 막 스며들 지 않는 염료)를 추가 합니다.</li>
		<li>즉시 그물 (extracellular DNA 구성 요소에서 형광 현미경 검사 법에서 LDN 추방)의 형태를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 붉은 형광 셀 링커 염료와 종양 세포의 얼룩
<ol><li>인간의 암 세포 라인 MKN45, NUGC, 및 OCUM-1 준비.</li>
	<li>1 x 107 셀 PBS + 0.02 %EDTA 15 mL와 실시간에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기 세척</li>
	<li>펠 릿, 얼룩 염료에 대 한 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 플라스틱.</li>
	<li>얼룩에 대 한 솔루션의 1 mL에 빨간색 형광 셀 링커 염료의 4 µ L를 녹이 고 세포 현 탁 액 단계 2.2에서에서 혼합.</li>
	<li>실시간에서 4 분 동안 쥐 똥을 품 어</li>
	<li>DMEM의 4 개 mL를 추가 (10 %FBS) 착 색 반응을 중지 하.</li>
	<li>270 x g 7 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>2.6-2.7 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>형광 현미경으로 확인 (여기 551 = nm, 방출 = 567 nm) 종양 세포 붉은 얼룩이 있습니다.</li>
</ol>3. 그물에 종양 세포 접착의 분석
<ol><li>다시 0.1 %BSA 보충 RPMI 1640의 1 mL에 빨간색 형광 스테인드 종양 세포 (1 x 106) 일시 중단.</li>
	<li>1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 생산 LDN 문화에 종양 세포를 추가 합니다.</li>
	<li>종양 세포는 그물에 연결할 수 있는 37 ˚C에서 5 분 동안 품 어. 참고: 긴 외피 종양 세포 접착 LDN 하거나 번호판을 유도합니다.</li>
	<li>매체를 제거 하 고 부드럽게 prewarmed 미디어 (0.1 %BSA + RPMI 1640)의 2 개 mL를 추가 하 고 접시를 소용돌이 여 우물을 씻어.</li>
	<li>3.4 단계에서 세척 절차를 두 번 반복 합니다. 참고: 그물부터 약하게 플레이트에 부착, 세척 부드럽게 스스로 그물의 제거를 피하기 위해 가능한 이루어져야 합니다.</li>
	<li>핵 및 그물의 시각화를 위한 5 µ g/mL의 최종 농도에 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>그물을 관찰 하 고 적절 한 필터를 사용 하 여 종양 세포를 첨부 (녹색, 여기 = 504 nm, 방출 523 = nm; 레드, 여기 551 = nm, 방출 = 567 nm).</li>
	<li>종양 세포는 그물에 의해 갇혀 보여 인물을 병합 합니다. 참고: 일부 실험에서 DNA 분해 효소에 추가 되었습니다 LDN 문화 (최종 농도 100 U/ml) 5 분에 대 한 공동 부 화 하기 전에 5 분.</li>
</ol>4. 시간 경과 비디오 분석 갇혀 종양 세포의
<ol><li>문화 35 m m에서 복 LDN 라운드 접시 코팅 폴 리-L-리 신 1.3 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>핵 및 1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 시각화 하는 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>외피의 1 분 후 미디어를 제거 하 고 0.1 %BSA + RPMI 1640의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>미디어를 제거 하 고 흠 없는 1 x 106 MKN45 세포 정지 0.1 %BSA + RPMI 1640 추가. 실시간에서 5 분 동안 품 어</li>
	<li>3.4 단계에서 설명한 대로 부드럽게 세척 하 여 모든 첨부 되지 않은 종양 세포를 제거 하 고 10% fcs 100 u/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충 DMEM 추가.</li>
	<li>문화 요리 전체 보기 셀 관측 시스템에 탑재 하 고는 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있다. 적절 한 필드를 선택 합니다.</li>
	<li>계속 추가 대 한 공동 2 일 문화 하 고 정상적인 빛과 형광, MKN45 세포와 그물을 각각 감지에서 6 분 마다 필드의 연속 사진을 찍어.</li>
	<li>각 timepoint에 이미지를 첨가 하 고 시간 경과 비디오 이미지 뷰어 소프트웨어를 사용 하 여 구성.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus,+rheumatoid+arthritis,+and+acute+rheumatic+fever.">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li><li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+(CALLA)+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients.">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li><li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients.">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li><li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties.">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li><li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+granulocytes:+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity.">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li><li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress.">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li><li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells.">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).</li><li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li><li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+(NETs)+Isolation+and+Handling.">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li><li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+neutrophils+(LDN)+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+(NETs).">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).</li><li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product,+the+granulocyte+marker+CD66b,+exclusively+in+granulocytes.">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps.">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이전 연구는 종양 세포를 순환 수 있습니다 갇혀 있을 NET 기판10, vivo에서11보고 있다. 전이성 유방암 세포 자극 하는 호 중구 및 대상 기관17에서 종양 세포 성장에는 그물의 대형을 유도 표시 되었습니다. 또한, 우리는 수술 후 게 액체에서 LDN의 단기 문화 수 효율적으로 더 자극15없이 종양 세포를 모 함 하는 거...

혈액 순환에 다형 핵 호 중구 밀도 그라데이션 준비 방법을 통해 단 세포에서 일반적으로 분리 된다. 그러나, CD11b(+), CD15(+), CD16(+), 그리고 CD14(-) 고기와 저밀도 neutrophils (LDN)로 알려진 일부 호 중구는 공동 단 세포로 순화. LDN의 상대 수 면역 질환1,2, 암4,5, 패 혈 증3, 등 다양 한 병 적인 조건에서 크게 증가 합니다. 이전 연구는 LDN의 호 중구6phenotypically 및 기능적으로 뚜렷한 클래스 나타났습니다. 그것은 혈액 순환에 LDN 더 정상적인 밀도 호 중구2,7보다 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산할 가능성이 있습니다 주목 해야한다. 그물 핵 산, 히스톤, 프로 테아 제, 그리고 세밀 하 고 cytosolic 단백질의 구성 하는 웹-같은 구조 이며, 그들은 효율적으로 모 함 하 고 병원 균8파괴.
최근, 그물 캡처 뿐만 아니라 미생물, 하지만 또한 혈소판 혈전 형성9 및 종양 전이10,11에 지원할 수 있는 종양 세포를 순환 표시 되었습니다. 그러나, 뒤에 그물과 혈소판 또는 종양 세포 사이 접착 상호 작용 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 더 최근에, 생체 외에서 접착 분석 결과 골수성 백혈병 세포 (K56212) 폐 암 세포 (A54913) 연결 및 그물을 β1와 β3 integrins를 통해 밝혔다. 저자 호 중구에서 고립 그리고 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 접착 기판14에 의해 활성화 인터넷 주식 사용. 이 분석 결과 호 중구의 부재에서 NET 구성 요소와 실제 상호 작용의 탐지를 허용, 그것은 arguable 여부 그물 생산 에서 동일한 분자 구조를 유지는 "셀-무료 인터넷 주식" 고속 원심 분리에 의해 분리 vivo. 최근에, 우리는 복 부 수술 포함 거 대 한 그물을 생성 하 고 복 막 전이15발생 하는 종양 세포에 연결 된 많은 성숙한 LDN 후 그 게 복 막 액체를 발견. 이 연구에서 우리는 성공적으로 어떤 물리적 조작 없이 그대로 그물에 종양 세포의 접착을 시험 했다. 여기, 우리는 그물과 무료 종양 세포 사이 접착 상호 작용을 검출 하는 기법의 세부 정보를 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare, SWEDEN</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&amp;trade; Whole Blood CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS Rinsing Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stock Solution</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetic Separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, Japan</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td><td>gibco by life technologies, Mexico</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyophilized powder, &amp;ge;96% (agarose gel electrophoresis)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td><td>IWAKI, Japan</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>fluorescein stereomicroscope</td><td>BX8000, Keyence, Osaka Japan</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Whole view cell observation system</td><td>Nikon, Kanagawa, Japan</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 human gastric cancer cell line</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 human gastric cancer cell line</td><td>Riken, Tukuba Japan</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 human gastric cancer cell line</td><td>Osaka City University, Japan</td><td>N/A</td><td>Gift from Dr. M.Yashiro</td></tr></tbody></table>

neutrophil extracellular traps generated by low density neutrophils obtained from peritoneal lavage fluid mediate tumor cell growth and attachment

호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), 캡처 및 미생물을 파괴할 수 있는 활성화. 최근 연구 제안 그물 자가 면역 질환, 혈전 증, 및 종양 전이 등 다양 한 질병 과정에서 포함 된다. 여기, 우리는 그물을 부착 후 성장 무료 종양 세포의 트래핑 동안 NET 활동을 감지 하 상세한 생체 외에서 기술을 보여줍니다. 첫째, 우리는 laparotomies 수술 환자에서 수술 후 복 막 게 액체에서 낮은 밀도 neutrophils (LDN)를 수집. LDN의 단기 경작 녹색 형광 핵과 염색체 counterstain 가시화 했다 거 대 한 그물 형성 결과. 인간의 위 암 세포 라인 MKN45, OCUM-1 및 NUGC-4 그물의 공동 화, 후 많은 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있었다. 그 후, 첨부 파일 DNase I. 계시 노출 인 비디오 공개 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 죽지 않 았와 그물의 저하에 의해 완전 하 게 폐지 했다 하지만 대신 적극적으로 지속적인 문화에서 성장 했다. 이러한 메서드는 그물과 다양 한 유형의 세포 및 물자 사이 접착 상호 작용의 탐지에 적용할 수 있습니다.

2 시간 문화에서 CD66b(+) LDN 복 막 게 유체 보였다 문자열 구조에서 파생 된에 대 한 녹색 형광 염료와 스테인드 핵 및 단 셀 하지 않았다 CD66b(-) 동안 염색체 (그림 1B), (그림 1C). 그러나 때 LDN 문화 했다 청소용으로 100 U/mL DNase 나, 특징적인 구조는 파괴 (그림 1D), 그들은 호 중구에서 추방 하는 extracellular DNA의...

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Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

neutrophil-extracellular-traps-generated-low-density-neutrophils

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.7K 조회수.  Jichi Medical University. 여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

비디오: Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

호중구 세포외 트랩을 시각화하기 위한 염색 및 이미징

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

저자 스포트라이트: 호중구 세포외(Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissue) 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Dual-Dye Live Cell Analysis를 사용한 NET 형성 정량화

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that neutrophils play in the pathogenesis of cancer, autoimmune diseases, and various acute and chronic inflammatory conditions by contributing to the initiation and perpetuation of immune dysregulation through multiple mechanisms, including the formation of neutrophil extracellular traps (NETs), which are structures crucial in antimicrobial defense. Limitations in techniques to quantify NET formation in an unbiased, reproducible, and efficient way have restricted our ability to further understand the role of neutrophils in health and diseases. We describe an automated, real-time, high-throughput method to quantify neutrophils undergoing NET formation using a live cell imaging platform coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach using two different DNA dyes to image intracellular and extracellular DNA. This methodology is able to help assess neutrophil physiology and test molecules that can target NET formation.

저자 스포트라이트: Quantifying Neutrophil Extracellular Traps in Disease and Drug Screening Using Dual-Color Live-Cell Imaging(이중 색상 생세포 이미징을 사용한 질병 및 약물 스크리닝에서 호중구 세포외 트랩 정량화)

We present an automated high-throughput method to quantify neutrophil extracellular traps (NETs) utilizing the live cell analysis system, coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

요약

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이 비디오의 챕터

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단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법