이 프로토콜은 건강한 개체의 인간 호중구에서 유사한 시험관 내 조건 하에서 유도 자극에 따라 호중구 세포 외 트랩의 구성, 구조 및 형태의 이질성을 입증합니다. 높은 호중구 순도 및 생존력이 얻어진다. 이는 호중구 세포 외 트랩에 의해 방출되는 DNA, LL-37 및 myeloperoxidase, elastase 및 cathepsin G의 효소 활성을 비교할 수있게합니다.
이 프로토콜은자가 면역 질환에서 NET의 생산에 대한 가용성 인자 또는 세포 접촉 또는 폐쇄를위한 가능한 치료법 또는 메커니즘의 효과를 분석 할 수있게했다. 이러한 방법은자가 면역 질환의 조사에 도움이 될 수 있습니다. NETs의 통제되지 않은 세포 재생산 및 질병의 바이오 마커로 간주되는 구성 요소의 정렬 기간으로 인해.
형광 현미경을 사용하면 LL37과 같은 단백질과 관련하여 DNA의 분산을 보여주는 NET의 이미지를 캡처 할 수 있으며, 이는 미생물과 함께 국소화되어 어떻게 나타나는지 이해하는 데 도움이됩니다. 시작하려면 대정맥 천자를 수행하여 항응고제로 EDTA 디 칼륨이 들어있는 튜브에 말초 혈액 10 밀리리터를 수집하십시오. 그런 다음 표준 혈액 생체 측정 및 C 반응성 단백질 검사를 수행하여 감염이나 염증을 배제하여 샘플의 품질을 보장합니다.
말초 혈액 샘플을 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장을 제거하고, 이어서 2차 원심분리하고 나머지 혈장을 버린다. 생성된 적혈구 및 백혈구 패키지를 하나의 1X DPBS로 일대일 부피비로 희석합니다. 그런 다음 멸균 된 10 밀리리터 유리관에 먼저 밀리리터 밀도 용액 1.08 밀리리터 1 밀리리터 후 밀도 용액 1.079 그램 1 밀리리터를 증착합니다.
그런 다음 희석 된 적혈구 및 백혈구 패키지 4 밀리리터를 벽에 부어 넣으십시오. 기울기를 방해하지 않도록 가속 또는 감속없이 원심 분리기. 과립구에 해당하는 상을 흡인하고 다른 멸균 10 밀리리터 유리관으로 옮깁니다.
섭씨 4도에서 10분 동안 300G의 1X DPBS 4밀리리터로 세척하고 상층액을 버립니다. 나머지 적혈구를 제거하려면 0.2 % 식염수 4 밀리리터를 추가하여 삼투압 쇼크로 세포를 치료하십시오. 섭씨 4도에서 2 분간 배양하고 원심 분리합니다.
상청액을 버리고 0.65 % 식염수 용액 4 밀리리터를 첨가하십시오. 막 무결성을 복원하고 원심 분리를 반복하기 위해 섭씨 4도에서 5 분 동안 배양합니다. 상청액을 제거하고 세포를 4밀리리터의 1X DPBS에 재현탁하여 세포 파편을 제거합니다.
다시, 원심분리하고 2밀리리터의 차가운 HBSS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 트리판 블루 배제 테스트를 수행하려면 5 마이크로리터의 세포 현탁액을 20 마이크로리터의 0.4% 트리판 블루로 희석합니다. 새로운 바우어 챔버에서 세포를 세고 배제 테스트를 사용하여 세포 생존율을 결정합니다.
그런 다음 5 마이크로리터의 세포 현탁액을 슬라이드에 장착하고 15초 동안 Wright's 염색으로 염색합니다. 즉시 샘플을 고정하고 증류수로 씻은 다음 광학 현미경으로 형태를 관찰합니다. 다음으로, 5번째 세포를 유세포 분석기 튜브에 1회 10회 첨가하고 100 마이크로리터의 FACS 완충액에 1 마이크로리터의 7AAD로 염색하여 암실에서 섭씨 4도에서 15분 동안 염색한다.
300G에서 500마이크로리터의 FACS 완충액으로 10분 동안 세척합니다. 세포를 500 마이크로 리터의 2 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 유세포 분석 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 죽은 세포 제어의 경우 세포를 200 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 30 분 동안 고정하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 300G에서 500 마이크로 리터의 1XPBS로 세척하십시오.
상청액을 버리고 200 마이크로 리터의 0.1 % Triton X-100을 첨가하십시오. 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 500 마이크로 리터의 1X PBS로 씻고 7AAD로 염색하십시오.
유세포분석기 소프트웨어에서 캡처된 데이터를 분석합니다. 파일을로드하고 염색되지 않은 호중구 파일을 두 번 클릭하십시오. X축의 전방 산란 또는 FSC와 Y축의 측면 산란 또는 SSC를 선택하여 호중구에 해당하는 세포 집단을 표시합니다.
그런 다음 X축에서 채널 B3-A:PerCP vio 700-A를 선택하여 세포의 자가형광을 디라인하고 Y축에서 히스토그램을 선택합니다. 그런 다음 염색된 호중구 파일을 엽니다. X축에서 FSC를 선택하고 Y축에서 SSC를 선택하여 호중구에 해당하는 세포 집단을 표시합니다.
다시, 채널 B3-A:PerCP vio 700-A를 선택하여 염료 7AAD에 대해 양성인 호중구의 집단을 구분한다. 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 레이아웃 편집기에 복사를 선택하여 최종 히스토그램을 생성합니다. 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 박테리아 또는 곰팡이 의사 균사를 추가하십시오.
200 마이크로리터이므로 5 마이크로몰 CFSC를 1X PBS에 첨가한다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 혼합하고 배양하십시오. 500 마이크로 리터의 비 보수 된 혈장과 원심 분리기를 추가하여 반응을 중지하십시오.
상청액을 버리고 원심 분리로 1XPBS 1 밀리리터로 펠릿을 세척하십시오. 이어서 미생물을 250 마이크로리터의 1X PBS에 재현탁시킨다. NET 유도를 위해 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 50 마이크로 리터 분취량을 7 번째 박테리아에 2 배 10 또는 5 번째 의사 균사에 2 배 10으로 준비합니다.
10 x 10mm 멸균 유리 커버 슬립을 24웰 플레이트에 놓습니다. 실온에서 1시간 동안 10마이크로리터의 0.001%폴리 l-라이신으로 덮고 100마이크로리터의 1X PBS로 두 번 세척합니다. 자연 건조 및 자외선으로 15 분 동안 조사하십시오.
다음으로, 이전에 준비된 호중구 현탁액의 HBSS 용액을 10%열 탈보충된 자가 혈장이 보충된 RPMI 1640 배지로 교체합니다. 350 마이크로리터의 이 세포 현탁액을 24-웰 플레이트에 첨가하여 웰당 10 내지 5번째 호중구의 2배의 최종 농도를 갖는다. 세포가 웰 바닥에 부착되도록 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 플레이트를 20 분 동안 배양합니다.
그물 형성을 유도하려면 MOI1에 박테리아 자극 MOI100과 유사 균사를 추가하십시오. 또한 생화학적 자극을 추가하고 50 마이크로리터의 HBSS를 첨가하여 자극 없이 대조군을 준비한다. 웰당 400마이크로리터의 최종 부피를 얻고 플레이트 셰이커에서 140RPM에서 30초 동안 혼합합니다.
그런 다음 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 4 시간 동안 배양하십시오. 순 유도 후, 조심스럽게 피펫팅하여 웰에서 상청액을 제거하고 세포를 300마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정합니다. 원심분리 없이 200마이크로리터의 1X PBS로 세포를 세척하고 200마이크로리터의 블로킹 완충액을 30분 동안 추가합니다.
LL37 염색의 경우 1X PBS에서 200 마이크로 리터의 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 10 분 동안 투과시키고 1X PBS로 두 번 세척합니다. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하십시오. DNA는 2 마이크로 리터의 DAPI로 세포를 염색하고 공초점 형광 현미경으로 분석 할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.
동적 세포 단계는 이중 밀도 구배 정제 후에 시각화되었습니다. 전형적인 호중구 형태는 오른쪽 염색으로 확인하였다. 세포는 또한 막 파괴 없이 트리판 블루 배제에 의해 관찰된 최적의 생존력을 보였다.
유동 세포분석에 의한 SSC 대 FSC의 분석은 높은 세포 순도를 갖는 PMN에 상응하는 집단을 확인하였다. 염색되지 않은 세포 대 7AAD 염색 세포에 대한 PMN 점도표 및 각각의 히스토그램은 투과화된 대조군 세포와 비교하여 새로 분리된 호중구에서 높은 세포 생존율을 나타냈다. 화학 및 미생물 자극제로 호중구를 자극한 후, DNA DPI 및 항-LL37을 사용하여 형광 현미경으로 NET을 시각화하였다.
미생물을 CFSE로 미리 염색하였다. PMA 유도 자살 그물 형성은 LL37과의 공동 국소화로 나타납니다. HOCI로 형성된 NET은 중요한 NET 형성에 해당하는 세포 외 공간에서 약간의 DNA 분산을 보였다.
진균 유사 균사에 의해 유도 된 NET은 중요한 NET 형성의 특징 인 필라멘트 구조를 갖는 세포 외 공간으로 방출 된 낮은 농도의 DNA를 보였다. S.aureus는 중요한 NET 형성을 보인 반면 녹농균은 자살 NET 형성을 나타내는 LL37과 공동 국소화되는 흐린 형태로 많은 농도의 DNA 방출을 유도했습니다. 이중 밀도 구배 방법론을 수행하면 호중구의 높은 순도와 생존력을 얻을 수 있습니다.
그리고 우리는 세척을 높이고 구조를 손상시키지 않습니다. 이 방법에 따라 NET 생산에서 물질 또는 세포의 효과뿐만 아니라 일부 메커니즘 또는자가 면역 질환의 치료법으로 사용되는지 여부를 분석 할 수 있습니다.
