The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

참고 : 모든 실험이 지역의 기관 윤리 지침에 따라 실시 하였다. 1. 혈액 그리기 <ol><li> 전주 venipucture을 통해 녹색 위쪽 (헤파린) 튜브에 건강한 지원자에서 혈액의 14 튜브를 수집하고 얼음에 정착하기 전에 각 튜브를 반전. 최적의 호중구 수율을 보장하기 위해 실험 15 분 - (10) 내의 혈액을 수집합니다. </li></ol> 전혈 2. 호중구 격리 <ol><li> 혈액을 희석하기 위해 칼슘과 마그네슘이없는 PBS의 5 ml의 혈액의 각 녹색 위쪽 튜브를 씻으십시오. 4 × 50 ML 원뿔 튜브의 각에서, RT에서 림프구 분리 매체 (LSM) 15ml를 추가합니다. 날카로운 LSM-혈액 인터페이스를 생성, 조심스럽게 LSM 위에 희석 된 혈액을 층, 60 ML의 주사기에 장착 된 18 G 바늘을 사용. 주 : 최대한 층의 혼합 피한다. </li><li> 휴식없이 21 ° C에서 30 분 동안 800 XG에 원심 분리기. 참고 : 갑자기 중단 할 수 있습니다다른 레이어의 혼합을 야기한다. </li><li> 맨 아래에있는 적혈구와 호중구 침전물을 준수하십시오. 기음과는 하단 붉은 레이어를 떠나, 림프구 및 단핵구 세포를 포함 이러한 층 사이의 인터페이스를 제거해야합니다 상위 2 층 (플라즈마 및 LSM) 만들기를 폐기합니다. </li><li> 각각의 튜브에, 인산 버퍼 식염수 (PBS) 20 ml의 6 % 덱스 트란 용액 20 ml를 추가합니다. 부드럽게 적혈구 및 호중구의 층과 혼​​합하고 실온에서 30 분 동안 방치시키고 각 튜브를 반전. 주 :이 적혈구 (적혈구) 아래쪽에 침강 것을 허용 할 것이다. </li><li> 30 분 후, 신선한 튜브에 호중구 풍부한 뜨는을 전송하고 RBC 펠렛을 폐기합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기 상층 액. 원심 분리 후, 상층 액을 버린다. 펠렛은 주로 호중구 몇 적혈구가 포함됩니다. </li><li> 멸균 수에 4.5 ㎖의 용균 완충액을 0.5 ㎖의 첨가에 의해 용해하는 용액을 준비한다. 로 용해은 t으로 RBC 남아그는 하나의 튜브에 모든 재 부유 알약을 전송, 솔루션을 용해하는 5 mL를 준비했다. 10 분 동안 어둠 속에서 실온에서 용해를 허용합니다. </li><li> 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버리고 남아있는 용해하는 용액을 제거하기 위해 4 ° C에서 450 XG에서 다시 칼슘과 마그네슘 원심 분리기없이 5 ml의 PBS로 펠렛을 씻는다. 이 시점에서 얻어진 펠렛은 호중구가 포함되어 있습니다. 감기 3 % RPMI의 30 ml의 펠렛을 재현 탁과 얼음에 넣어. 주 : 3 %가 RPMI로 RPMI 매체를 보충함으로써 이루어진다 3 % 소 태아 혈청 (FBS) </li><li> 메틸렌 블루 염색을 사용하여 샘​​플의 순도를 확인합니다. &gt; 세포의 95 %는 다 엽성 핵와 과립구해야합니다. &gt; 확인 세포의 95 % 생존 최종 호중구 수율을 계산하는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 5 × 106 호중구 / ml의 최종 농도를 얻기 위해 빙냉 3 % RPMI 호중구를 희석. </li></ol> 3. 그물 세대 <ol><li> 500 N과 호중구를 자극PMA의 M (호중구 용액 30ml를 당), 37 ° C, 5 % CO 2에서 4 시간 동안 20mm 그리드와 150 X 25mm 평면 조직 배양 접시에 배양한다. 이 NETosis을 수 있습니다. </li><li> 자극의 4 시간 후, 부드럽게 하단에 부착 된 그물과 호중구의 레이어를 떠나, 기음과 미디어를 폐기합니다. 이 계층을 중단하지 마십시오. </li><li> 접시 당 칼슘과 마그네슘이없는 차가운 PBS 15 ml의 총을 사용하여, 아래에서 모든 접착 재료를 리프트 오프하기 위해 접시의 저면에 PBS 15 ㎖를 피펫 팅하여 각 접시의 저면을 씻는다. </li><li> 4 ° C에서 450 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기의 각 접시 (단계 3.3) 세척에서 얻은 솔루션을 수집합니다. 호중구 나머지 세포는 무 세포 상청액 NET 풍부한 떠나는 하단 펠렛 것이다. </li><li> 나누기 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ℃에서 18,000 XG에 10 분 동안 스핀. 이것은 모든 DNA가 펠렛 할 수 있습니다. 참고 : 큰 TU에서 원심 분리BES 달리 고속 마이크로 원심 분리기를 사용하기 위해 더 작은 튜브에 상청을 분할해야한다, 이러한 높은 속도는 일반 원심 분리기에 도달 할 경우 소모 쉽고 적은 시간이다. </li><li> PBS 100 ㎕ 당 2 × 10 7 호중구에 해당하는 농도로 얼음 차가운 PBS에서 함께 얻은 모든 알약을 뜨는을 취소하고 재현 탁. 이 후속 실험에 사용할 수있는 무 세포 NET 스톡을 산출 할 것이다. </li><li> 측정법 또는 다른 DNA 정량 도구를 사용하여 수득 된 샘플에서 DNA 농도를 측정한다. 180 NG / μL - 샘플에서 적절한 농도는 140 사이의 범위해야합니다. </li></ol> 4. NET-암 세포 정적 접착 분석 <ol><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 코트 우물 O / N로 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 당 이전에 취득한 NET 주식의 100 μl를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 이후 12 시간 내지 20 세포의 균일 한 단일 층의 형성을 확인할현미경으로 우물의 바닥에서 무료로 그물 (그림 1). 이 시점에서, 부드럽게 하단에있는 NET 단층을 방해 확실하지 만드는 우물에서 모든 비 접착 물질을 대기음. </li><li> 각 웰에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 차단 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 둡니다. </li><li> 0.25 % 트립신 용액 2 ㎖를 사용하여 T-75 플라스크에서 A549 폐암 세포를 분리. 일단, 분리 된 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 트립신 세포와 원심 분리기에 A549 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 100 μL 용지 당 4 X10 암세포의 농도를 얻기 위해 용지에 재현 탁하고 세포 상등액을 폐기. 주 : A549 세포 별도로 성장시켰다. 간략하게, 세포를 배양하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 37 ° C에서 5 % CO 2에서 배양 함유 된 DMEM F12 배지에서 유지 하였다. 일단 70 - 80 %의 세포가 합류점에 도달 한, 그들은 0.25 % 트립신 EDTA를 이용하여 분리하고 동일한 배지에서 재현 탁위의 설명. </li><li> 미디어 CFSE 1 ㎖ 당 1 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 염색을 남겨 CFSE 사용 얼룩 암세포. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 염색, 원심 분리기 다운 후 다음 100 μL 미디어 당이 10 배 4 암 세포의 농도를 얻기 위해 미디어의 초기 볼륨에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기합니다. </li><li> 부드럽게 흡인 솔루션을 차단하고 당 잘 NET 단일 층 이상, 100 μL에 해당 미디어에이 10 배 4 암 세포를 추가하고 37 ° C 5 % CO 2에서 90 분 동안 부착 할 수 있도록, 차단 그물 1 시간 후. 조심스럽게 세포를 흡인 및 비 부착 세포를 씻어 각 웰에 PBS 100 ㎕를 추가합니다. </li><li> 일부 우물에서 그물을 저하 세척하기 전에 10 분 동안 잘 당 DNAse1의 1000U를 추가합니다. 이것은 부정적인 제어를 제공합니다. 다른 우물에서, 차량 제어 (VC)이 될 것입니다 10 분, 잘 당 멸균 물 100 μl를 추가합니다. 참고 : 3 공조 당 복제n은 일반적으로 표본의 크기를 증가시키기 위해 수행된다. </li><li> 기음은 우물 바닥에 만 그물과 부착 암 세포를 떠나 모든 솔루션을 버리고. (도 1)에 부착 NETS 암세포를 수정하고 형광 현미경 분석을 읽을 웰당 4 % 포름 알데히드 용액 100 ㎕를 추가한다. 플롯 및 결과를 분석 (도 3). </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

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이 비디오에서 보여 호중구 세포 외 트랩 격리 프로토콜은 호중구 격리 및 NET 형성을위한 문헌에 사용 된 다른 기술을 결합한다. 그것은 매우 복잡하고 변화하는 프로세스를 간소화하고 다른 프로토콜보다 적은 단계를 정제 무 세포 그물을 분리하는 매우 안정적이고 복제 방법을 제공합니다. 또한, 쉽게 사용할 시약은 프로토콜의 단순성에 추가 채용 크게 비용을 줄일 수있다. 정적 접착 분석 향?...

호중구 세포 외 트랩 (그물) 새로 단백질과 히스톤의 수백에 의해 장식 된 세포 외 DNA의 가닥으로 구성 호중구 파생 요소를 발견한다. 이들은 특정 자극에 따라 감염 및 염증의 맥락에서 호중구에 의해 분비되며, 이들은 초기 감염에 대한 호중구의 방어 메커니즘의 일부로 인식 하였다. 그들은 처음 박테리아, 바이러스, 곰팡이 1-3 등 다양한 미생물 침략자의 트래핑을 촉진 것으로 나타났다. 미생물의 트래핑 후 그 파괴에 직접적으로 NET 관련 단백질 3,4에 의해 간접적으로 식세포 5,6의 현지 채용을 통해 이어질 것입니다. 그물의 역할은 그러나 방어를 호스트하기 위해 제한 될 것 같지 않습니다. 보다 최근에, 그들은, 9 혈전증,자가 면역 질환 7,8에서 중요한 역할을하는 임신 관련 질환 (10) 및 심지어 암의 진행을 도시 한(11, 12). 따라서, 그물 다양한 생리 현상 큰 숫자에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 연구의 신규 한 특성으로 인해, 많은 그물 그 효과를 발휘하는 기전과 관련하여 설명 될 남아. 여기서, 호중구의 부재 그물 분리를 위해 단순화 된 방법을 제시한다. 다음 비디오는, 인간 전혈로부터 분리 그물을 간단하고 쉬운 방법을 보여준다. 무 세포 그물은 접착 성, 증식 및 이주 등의 분석법 번호뿐만 아니라 블로 팅 염색 imuunofluorescence 비롯한 시험 관내 실험에 사용될 수있다. 다른 프로토콜 그러나 그들은 일반적으로, 긴 복잡하고 비싼, 자주, 낮은 수율 13 아르, 13, 19 존재한다. 이 단순화 된 프로토콜 따라서 procedu의 길이를 최소화 염기성 시약을 사용하여 호중구를 분리하는 데 필요한 단계의 수를 감소수율을 극대화하면서 다시. 다음의 방법은 호중구 격리를위한 다양한 기술들이 앞서 라이브 호중구 매​​우 순수한 샘플을 수득 간단한 프로토콜을 수득 문헌에 기재된 결합한다. 문헌에서 제안 된 바와 같이, 정맥 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고, 호중구 활성화 (14)을 방지하기 위해 10 분 이내에 사용된다. 우리는 헤파린 처리 전혈 초기 Boyum 등 15에 의해 설명 피콜 밀도 원심 분리 기법에서 적응 방법에서 과립구 및 적혈구를 분리 림프구 분리 매체 (LSM) 밀도 구배 원심 분리를 사용한다. LSM은 나트륨 metrizoate 나트륨 diatrizoate 대입 16-18 호중구를 분리 많은 연구에서 성공적으로 사용되어왔다 Boyum 제형의 변형 예이다. 차동 밀도 원심 분리, 단핵구와 림프구가 삭제됩니다 다음; 적혈구는 침강6 % 덱스 트란 용액 (14)을 사용하고, 나머지 적혈구는 트리 판 블루와 메틸렌 블루 염색 확인 순수한 호중구의 인구를 얻기 위해 용해된다. 에이전트는 다수의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 및 인터루킨 (IL-8) -3,5,6- 비롯한 시험 관내 및 생체 내 NETosis을 유도하기 위해 사용되어왔다. 다음 프로토콜에 고립 된 호중구 세포 자멸사 (19, 20)을 홍보하지 않고 일관성과 신뢰성을 NET 형성을 허용하는 적절한 농도로 표시되었습니다 4 시간, 500 nM의 PMA로 자극한다. 분리 후, 우리는이 프로토콜에서 얻은 무 세포 그물 부착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여준다. DNAse1 소화 및 전술 한 바와 같이 그물을 분해하는 데 사용하므로 제어 2,3,11 역할을한다. 다른 옵션 NET formati을 억제 호중구 엘라 스타 제 억제제 (NEI)의 사용을 포함목표는 NET 형성을 억제하기보다는 저하 (11)에 영향을하는 것입니다 허용 대안 인에. 네이는 다양한 기능을 가지고 있지만, 이전에 증착 NET 염색질 decondensation, 탈과립 핵 호중구 사멸 (12)의 막힘을 통해 네이 의해 억제 될 수 있음을 보여왔다

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

호중구 세포 외 트랩 (그물)이 최근 호중구의 항균 필수품 전반의 한 부분으로 확인되었다. 그렇다 감염 싸움에서 자신의 역할에서, 최근의 연구는 암의 진행을 포함하여 많은 다른 질병 과정에 관여 될 수 있음을 보여 주었다. 정제 그물을 분리하는 것은 이러한 기능에 대한 연구를 허용하는 중요한 요소이다. 이 비디오에서는, 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 세포 무료 NET 분리의 단순화 된 방법을 보여줍니다. 고립 된 그물은 면역 형광 염색법, 모래 바닥 또는 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이는 호중구 자신의 전위 교란 효과의 부재에서의 생물학적 특성의 평가를 가능하게한다. 밀도 구배 분리 기술은 건강한 기증자로부터 전혈 호중구를 분리하는데 사용된다. 고립 된 호중구는 포르 12 MYR에 의해 자극istate 13 아세테이트 (PMA)는 NETosis을 유도합니다. 활성화 된 호중구는 폐기되고, 무 세포 NET 콘텐츠가 얻어진다. 그런 다음 A549 인간 폐암 세포와 접착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여 격리 그물. NET 스톡 코트에 첨가되는 96 웰 세포 배양 플레이트 O / N, 그리고 웰의 저부에 적절한 NET 단층 형성을 확인한 후 CFSE 개 A549 세포의 웰을 사용한다. 부착 세포는 니콘 TE300 형광 현미경을 사용하여 정량한다. 일부 우물에서, 1000U DNAse1는 그물을 저하 계산하기 전에 10 분 추가

그물 정적 유착 검정 성공적인 획득은 암세포의 첨가 이전 그물 단층 (도 1)과의 웰 적절한 코팅을 필요로한다. 이후의 모든 단계는 층을 방해하지 않도록주의하여 수행해야합니다. 그물의 적절한 층을 형성 할 때, 그것은도 2A 및 2C에 도시 된 바와 같이 그물 상당한 암 세포의 부착을 볼 것으로 예상된다. 이 효과는도 2B 및 2D에 도시 ?...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.5K 조회수.  McGill University.  다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다. 

비디오: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

호중구 세포외 트랩을 시각화하기 위한 염색 및 이미징

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

저자 스포트라이트: 호중구 세포외(Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissue) 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...