연구 성장 이니셔티브 (보너스 번호 101 X 340), 국립 과학 재단, 주요 연구 계측 프로그램 (부여 번호 로부터 재정 지원을 인정합니다 PHY-1626450), 더 큰 밀워키 재단 (쇼 수상)와 위스콘신 대학 시스템 (응용된 연구 부여).

1. 시 약 솔루션 준비
<ol><li>[20 m m tris (hydroxymethyl) aminomethane 및 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris 버퍼를 사용 하 여 원하는 농도에 관심사의 단백질을 용 해/diluting 하 여 시작 단백질 솔루션을 준비 합니다. 참고: hydrogels로는 상호 연결에 대 한 작은 단백질 농도 단백질 사용에 따라 달라 집니다 및 일반적으로 > 1 m m 이다.</li>
	<li>Tris(bipyridine)ruthenium(II) 염화 암모늄 persulfate (APS) (1 M)의 주식을 준비 ([Ru(bpy)3]2 +) APS 용 해 하 여 (6.67 m m) 솔루션 및 Tris 버퍼에서 [Ru(bpy)3]2 + 파우더.</li>
</ol>2. 단백질 기반 하이드로 겔 합성
<ol><li>누르면된 플런저와 1 mL 주사기에 23 G 바늘을 수정.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 ()와 함께 0.022의 내부 직경에 0.044의 외부 직경 10 cm 소계 (PTFE) 튜브를 잘라. PTFE 튜브의 한쪽 끝을 바늘과 주사기를 연결 합니다.</li>
	<li>실 란 솔루션으로 튜브의 두 번째 끝을 삽입 하 고 튜브 주사기 플런저를 축소 하 여 작성. ~ 30 분에 대 한 튜브를 둡니다.</li>
	<li>실 란 솔루션을 제거 하 고 건조 한 압축 공기 튜브. 참고: 모든 실 란 솔루션은 건조 하 고 아무 잔류물은 튜브에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>APS와 [Ru (bpy) 3] 단백질 해결책 혼합2 + 일정 볼륨 비율을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 [예를 들어, 15:1:1 또는 15:0.5:0.5 (v:: v)].</li>
	<li>그것은 완전히 혼합 될 때까지 광 솔루션 소용돌이.</li>
	<li>(예를 들어, 14000 x g) 솔루션에서 모든 거품을 제거 하는 최대 속도로 혼합 원심</li>
	<li>광 혼합물으로 치료 PTFE 튜브의 열린 끝을 삽입 하 고 튜브에 주사기 플런저를 제거 하 여 솔루션을 그립니다.</li>
	<li>로드 튜브가 열을 방지 하 고 실내 온도 (그림 1B)에 최대 30 분 동안 그것을 유지 하는 100 W 수은 램프에서 ~ 10 cm를 놓습니다. 참고: 경우에 따라 빛을 노출 시간 수 30 미는 겔 화 시간 단축에 사용 되며 여기 형광 젤, photobleaching 제한으로 낮은.</li>
	<li>바늘에서 튜브를 제거 하 고 면도날으로 히드로 끝 근처 튜브의 가장자리를 잘라.</li>
	<li>무딘된 24 G 바늘을 사용 하 여 트리 스 솔루션 (그림 1C)에 히드로 돌출. 참고: 무딘된 바늘은 모든 노치를 피하기 위해 또는 하이드로 겔 샘플을 손상 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>돌출 하는 동안 또는 거품을 형성 하 고 결함을 가진 젤을 버리고 수도 있는 어떤 결점 든 지 젤을 않았는지 살펴보십시오.</li>
</ol>3. 단백질 기반의 히드로 첨부 및 힘-클램프 제가 설정
<ol><li>인스트루먼트 컨트롤 프로그램을 시작 합니다. 음성 코일 모터를 켭니다. 값 범위 (예를 들어, 7.5 m m)의 끝으로 코일 위치를 설정 합니다. 참고: 음성 코일 위치는 히드로의 가능한 확장을 최대화 하기 위해 최대 운동 범위의 끝으로 될 것이 좋습니다.</li>
	<li>Z에서 후크를 치환-방향 x벤드에 그들을 정렬-방향 (당기 좌표 이며 그림 2B참조). 마이크로미터 나사 x의 값을 기록-방향.</li>
	<li>2 살 균 봉합 길이가 가닥으로 잘라 (2-3 cm; 그림 3A 및 B참조).</li>
	<li>각각의 가닥에 느슨한 더블 overhand 매듭 고 힘 센서 (그림 3C 와 3D)에 연결 하는 연결에 2 루프를 배치.</li>
	<li>Tris 버퍼 실험 챔버와 의료 핀셋을 사용 하 여 채워진된 챔버로 하이드로 겔 샘플을 전송.</li>
	<li>음성 코일 및 놓고, 강제로 솔루션 표면 가까이 센서 후크 모든 방향으로 x를 사용 하 여 후크를 정렬 /y/z-조작자를 위치.</li>
	<li>의료 핀셋, 기다려 음성에 연결 하는 걸이에 단백질 하이드로 겔 샘플의 양쪽 코일과 센서 (그림 3C)을 강제로 사용 하 여.</li>
	<li>의료 핀셋으로 봉합 루프의 양쪽 끝을 잡고, 동시에 그들을 당기고 하 여 음성 코일에 하이드로 겔 샘플 주위 봉합 루프 1 조입니다 (그림 3D).</li>
	<li>루프에 대 한 반복 단계 3.8 힘 센서 (그림 3D)에 연결합니다. 참고: 어떤 구조적 손상 및 하이드로 겔 샘플의 횡단 절단을 방지 하기 위해 봉합의 극단적인 강화 하지 마십시오.</li>
	<li>어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 각 연결의 벤드에 봉합 루프를 강화 참고로이 벤드 포인트 제로 구분 단계 3.2에서에서 후크를 찾을 수 사용. 의료가 위 (그림 3D)를 사용 하 여 봉합의 초과 길이 잘라.</li>
	<li>Z를 사용 하 여 연결 된 하이드로 겔 이동- z따라 조작자-실험 솔루션에 히드로 몰입할 실험 챔버 쪽으로 축.</li>
	<li>Y-z 는 젤 하지 어떤 스트레스는 조작자를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 맞춥니다.</li>
	<li>제로 포스 센서와 x를 사용 하 여 2 개의 후크를 분리-마이크로미터 단계 젤 힘 발생 하기 시작할 때까지. 일단 이것이 일어나면, 약간 되돌릴 마이크로미터 나사 x-방향.</li>
	<li>음성 코일 모터 및 센서에 대 한 두 컨트롤러의 위치를 기록 하 고 이러한 값과 3.2 단계에서 측정 하는 것 들 사이의 차이 사용 하 여 정확한 실험의 시작에 tethering 후크 구분 계산.</li>
	<li>~1.5-2 m m로 여유 곡선에 대 한 범위를 설정 하 고 젤 여유 (그림 4A)를 측정 한다. 참고: 여유 각 측정 2 정권 (그림 4A)에 맞게 최적의 수의 데이터 요소에 대 한 허용 초기 음성 코일 위치 근처 여유 정권의 시작을 유지 하려고 합니다. 젤 길이 갈고리와 느슨하게에 2 정권 사이의 교차로 사이의 분리를 사용 하 여 미크론 분해능으로 결정 될 수 있다 곡선 (단계 5.1 참조). 힘 센서는 실험 조건에 있는 변이 때문에 시간 드리프트 수 있습니다로 젤이 없는 아래 여유 곡선의 부분 힘이 가능한 드리프트에 대 한 보고서. 계측기 제어 프로그램 PID 루프 (그림 4A 인세트)를 세트 포인트 명령을 보낼 때 이러한 차이 대 한 자동으로 보정 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 기반의 히드로 특성 제어 힘 램프를 사용 하 여 상수-힘 측정
<ol><li>
힘-램프 실험
	<ol>
<li>힘 램프 주기 원하는 로딩 속도 (예를 들어, 0.01 mN/s)에 힘을 증가 하 여를 수행 하려면 뒤집힌된 "V"로 시작 하 고 마지막 세력 및 프로토콜의 기간을 입력 합니다. 그런 다음 0 미네소타 (또는 낮은 힘) > 200 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 있도록 젤 잡으십시오.</li>
		<li>추적을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
상수-힘 실험
	<ol>
<li>정의 된 시간 동안 일정 한 힘 (예를 들어, 1만)에 30 s와 증가 힘에 대 한 낮은 힘 (예를 들어, 0.1 mN)를 적용 하 여 상수-힘 프로토콜을 수행 (예를 들어, 120 s), 뒤에 동일 하 게 다시 힘을 낮은 냉각 값 (예, 0.1 mN) > 300 s refold를 복구 젤 탄력 단백질 도메인 수 있도록.</li>
		<li>첫 번째 펄스 다음 PID 설정을 조정 하는 피드백의 응답 시간을 최대화 (참조 그림 2D) 루프. 참고: 뻣 뻣 한 젤에 대 한 힘에 작은 변화에 대 한 루프의 응답 시간 힘 센서의 전자와는 코일의 응답 시간에 의해 제한 됩니다 그리고, 5 ms7만큼 낮을 수 있다. 부드러운 젤, 힘에 있는 큰 변화에 대 한 응답 시간이 hydrogels (그림 2D)의 탄성에 의해 결정 됩니다.</li>
		<li>추적을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>젤 힘 ( 그림 4A 삽입에서 δ x) 경험, 젤 길이 L 방정식을 사용 하 여 계산을 시작 하면 갈고리와 계산 된 코일 위치 측정된 구분 활용 하 여: L = L0 + ∆x 여기, L0 (단계 3.14) 실험 전에 마이크로미터 나사의 위치에서 측정 후크 사이 분리 이다. 참고: 완전 한 cross-linking 귀착되는 낮은 단백질 농도와 젤에 대 한 측정된 길이 추적 추적에서 변경 됩니다. 또한, 시간의 오랜 기간 동안 hydrogels 내부 단백질 발생할 수 노화 효과25, 젤의 전체 길이에 있는 결과.</li>
	<li>정상화 긴장을 젤 길이 측정된 확장.</li>
	<li>중 합에 사용 되는 관의 내부 직경을 사용 하 여 횡단 표면에 측정 된 힘을 정상화.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins?.">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li><li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein:+a+comparison.">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li><li>Wiita, A. 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S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinks+for+3D+bioprinting:+an+overview.">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 낮은 볼륨 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 응답을 조사 하는 힘-클램프 rheometry 기법을 설명 합니다. 또한, 균일 한 원통형 낮은 볼륨 단백질 하이드로 겔 샘플을 합성 하는 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜도는 걸이에 어떤 기계적 변형 또는 단백질 기반 하이드로 겔 샘플 또는 젤의 미끄럼에 손상을 유발 하지 않고 다른 유형의 다양 한 신축성으로 단백질 기반 hydrogels 넥타이 하는 ?...

독특한 물리적 특성 떨어져, 단백질 기반 hydrogels 붐비는 환경에 있는 단백질의 연구를 활성화 한 '당겨'에 몇 십억 분자의 측정 함으로써 힘 분광학을 혁명의 약속을 잡으십시오 피부와 다른 조직에 있어서 그 비슷한. 단백질 도메인 유지 hydrogels, 강제로, biomechanical 반응의 연구를 수 있도록 내부 접힌 파트너 및 화학 조건 바인딩. 또한, biomechanical 응답 hydrogels 내부 단백질 도메인의 단일 분자 힘 분광학 기법으로 본 응답을 유사 합니다. 예를 들어 화학 denaturants 및 산화 제 접힌된 상태, 단일 단백질 도메인 수준1,2,3 와 거시적인 레벨4,5 에서 안정성을 감소 , 6 , 7. osmolytes 단일 단백질8,9, 동일한 힘 조건7,10대 hydrogels의 점 탄성 응답 감소로 이어지는의 안정성을 증가 하는 유사 하 게.
중 합성 단백질 기반 hydrogels 구현 되었습니다 몇 가지 방법을 사용 하 여 물리적 상호 작용11,12 또는 공유 상호4,13. 화학식 반응 고정된 가교 위치에 대 한 허용 하 고 이러한 hydrogels 기계적 또는 화학적 섭의 제거에 따라 초기 상태를 복구할 수 있습니다. 화학식 cross-linking를 위한 성공적인 접근 초기자 (그림 1)14는 산화 제와 루 테 늄 (II) 소금으로 암모늄 persulfate (AP)를 사용 하 여 노출 된 티로신 아미노산 사이 화학식 탄소-탄소 유대 형성에 의존 합니다. 하얀 빛에 노출 되 면 집중된 단백질의 해결책은 하이드로 겔으로 설정할 수 있습니다. 제어 하 여 반응을 시작, 단백질-APS 믹스 어떤 주조 형태, 투입 될 수 있는 때 소계 (PFTE) 등 튜브 (그림 1B 및 1 C), 수 있도록 매우 작은 솔루션 볼륨15를 사용 하 여. 또한, 가교 반응을 방 아 쇠를 흰색 빛으로의 사용 제한 표백 형광 단백질의 결과 하며 복합 hydrogels의 정립 형광 마커 (그림 1) 다른 단백질 기반 하이드로 겔 형성 방법 SpyTag SpyCatcher 공유 상호 작용16, 아민 가교 를 통해 도13또는 biotin streptavidin 상호 작용17에 따라 교차 연결을 사용 합니다.
동적 기계적인 분석 (DMA)는 현재 광범위 하 게 폴리머 기반 hydrogels13,18를 공부 하는 기술입니다. DMA 생체 재료에 일정 힘 프로토콜을 적용할 수 있습니다, 하는 동안 10 kPa, 및 이상의 200 µ L19의 큰 샘플 볼륨 영의 계수를 요구 한다. 이러한 제한으로 인해 단백질 hydrogels는 일반적으로이 기술에 의해 조사를 너무 부드러운. 설계 된 polyproteins 때문에 살아있는 시스템 생산에 필요한 고분자, 보다 합성 하 더로 같은 높은 볼륨 효율적, 최고의4,15되지 않습니다. 또한, 대부분의 생물 학적 조직 10 kPa 보다 부드럽고 있다. 몇 가지 방법은 생물 학적 샘플, 근육 탄력20,21연구에서 특히 개발 되었다. 이러한 기술은 또한 지속적인 힘을 피드백에서 동작할 수 있습니다 하지만 아주 짧은 시간 동안 강제로 노출 (미크론 범위)에서 작은 직경을 가진 샘플에 대 한 최적화 (일반적으로 1 s).
단백질 기반 hydrogels 수정된 rheometry 기술로 성공적으로 공부 했다. 예를 들어 반지 모양에는 히드로 주조 확장4,22의 기능으로 경험 있는 힘에 있는 변화를 측정 하기 위해 extensional rheometry 사용 하 여 수 있습니다. 단백질 기반 hydrogels의 유 변 학적 특성을 공부에 대 한 다른 접근 제어 전단 응력 rheometry를 사용 합니다. 이 기술은 또한 낮은 샘플 볼륨을 달성 하 고 부드러운 소재를 용납 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 부족을 당기기 모방 능력 그 원인 단백질 펼쳐진 vivo에서, 고 탄성 계수 다양 한 가정 및23필요로 하는 복잡 한 이론에 따라 계산 됩니다.
우리는 최근 단백질, 직경 튜브 내부 생산의 작은 볼륨을 이용 하는 새로운 접근 방식을 보고 < 1 m m. 이 기술은의 우리의 첫 번째 구현 젤 원하는 프로토콜15다음 확장 했다 길이 클램프 모드에서 운영 했다. 이 방법에서는, 단백질 경험 확장에 힘 연속 변경 도메인 전개 하는 동안 데이터 해석 복잡 하. 최근에, 우리는 새로운 힘-클램프 rheometry 기술, 피드백 루프는 사전 정의 된 힘 프로토콜7 (그림 2) 낮은 볼륨 단백질 hydrogels을 노출할 수 있습니다 보고 있다. 아날로그 PID 시스템 컴퓨터에서 보낸 세트 포인트와 힘 센서에 의해 측정 하는 힘을 비교 하 고 두 입력 간의 차이 최소화 하기 위해 음성 코일을 이동 하 여 젤 확장을 조정 합니다. 힘의이 '죄' 지금 허용 한다 실험의 새로운 유형에 대 한 단백질 hydrogels의 역학을 측정 하기 위하여.
힘-램프 모드에서 속박 되 단백질 히드로 지속적인 증가 시간 강제의 감소를 경험 한다. PID는 단백질 및 하이드로 겔 제제의 종류에 따라 비-선형 방법에 있는 확장명을 변경 하 여 점 탄성 변형에 대 한 보상. 힘 램프의 주요 장점은 그것은 영의 계수는 전개 및 refolding 단백질 도메인의 에너지 소비 등의 표준 매개 변수의 정량화를 허용 한다.
상수-포스 모드에서 적용 된 힘 단계 처럼에서 변경 됩니다. 이 모드에서 젤 확장 계약 탄력적 때 힘 증가 또는 감소, 각각, 시간에 따른 변형에 의해 따라. 이 점 탄성 변형, 젤 지속적인 힘을 경험 하는 동안 일어나는 도메인 전개 refolding와 직접 관련 됩니다. 단순화 된 방법으로,이 확장 몇 십억 단일 분자 추적 함께 평균 하 고 한 번에 측정의 동급으로 볼 수 있습니다. 상수-포스 프로토콜 크 리프 힘 및 시간의 기능으로 단백질 hydrogels의 휴식을 공부 하 고 사용할 수 있습니다. BSA-기반 단백질 hydrogels 위한 힘의 기능으로 우리 최근 나타났습니다 탄성 및 점 탄성 확장 및 적용 된 스트레인7반동 사이 선형 종속성입니다.
여기 우리 힘 클램프 고분자 형광 고 쉽게 전반적인 하이드로 겔을 만드는 단백질 L의 혼합물 (8 도메인24, L8로 묘사) 및 단백질 L eGFP 구문 (L-eGFP)에서 만든 복합 젤을 사용 하 여 작업 세부 사항 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>SI-KG4A force transducer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SI-KG4A</td><td></td></tr><tr><td>Linear Voice Coil Motor</td><td>Equipement Solutions</td><td>LFA2010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&amp;nbsp;6-0 NYLON SUTURE 12/PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Silane, Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD, 100 ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle, 23 Gauge</td><td>Healthcare Supply Pros</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>Medical Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels

여기, 우리는 단백질 기반 hydrogels의 biomechanical 속성 특성 힘-클램프 rheometry 메서드를 설명 합니다. 이 메서드는 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템을 사용 하 여 원통형 단백질 기반의 히드로 샘플, 선형 음성 코일 모터와 힘 변환기 사이 곁에 힘 제어 프로토콜을 적용. 작업 중 PID 시스템 측정 및 설정 포인트 세력 간의 차이 최소화 하 여 힘을 미리 정의 된 프로토콜에 따라 하이드로 겔 샘플의 확장을 조정 합니다. 단백질 기반 hydrogels이 독특한 접근 방식 다른 단백질 농도와 매우 낮은 볼륨 하이드로 겔 샘플 (< 5 µ L)의 밧줄 수 있습니다. 힘 램프 프로토콜, 어디 적용된 스트레스 증가 하 고 선형 시간 감소, 아래 시스템 표준 탄성의 측정 및 단백질의 폴딩 (유엔)와 관련 된 탄성과 히스테리시스 동작의 연구 활성화 및 점 탄성 매개 변수입니다. 상수-힘, 힘 펄스는 단계 같은 모양, 탄성 응답 인해 힘에 있는 변화에 아래에서 점 탄성, 전개 및 refolding 단백질 도메인에서 분리 된입니다. 낮은 볼륨 샘플 및 다양 한 기계적 섭 적용에 다양성, 힘-클램프 rheometry 대량 접근을 사용 하 여에서 단백질의 기계적 응답을 조사 하기 위해 최적화 됩니다.

그림 1A 는 L-£/ L8 하이드로 겔을 합성 하는 데 사용 하는 광 반응의 체계를 보여 줍니다. 그림 1B 는 photoactivation 전후 PTFE 튜브 히드로 혼합물을 보여줍니다. 그림 1C 트리 스 솔루션 내부 돌출된 L eGFP L8 하이드로 겔을 선물 한다. 하이드로 겔 샘플 노치 등 없는 구조적 결함이 있다. 명확 하 ?...

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Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

force-clamp-rheometry-for-characterizing-protein-based-hydrogels

Research

JoVE Journal

Engineering

6.9K 조회수.  University of Wisconsin-Milwaukee. 새로운 힘-클램프 rheometry 기술은 낮은 볼륨 단백질 기반의 히드로 샘플 음성 코일 모터와 힘 센서 사이의 곁의 기계적 성질을 조사 하는 데 사용 됩니다. 아날로그 비례-적분-미분 (PID) 시스템 강제로 원하는 프로토콜을 경험된의 '죄'에 대 한 수 있습니다.

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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

세포 수축을 Quantifying에 대한 불만 사항 매트릭스의 준비

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

연구

생체공학

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

생화학

Combining Microfluidics and Microrheology to Determine Rheological Properties of Soft Matter during Repeated Phase Transitions

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement during previous phase changes and applied shear. To determine the extent of these changes, we have developed a microfluidic device that enables repeated phase transitions induced by exchange of the surrounding fluid and microrheological characterization while limiting shear on the sample. This technique is &#181;2rheology, the combination of microfluidics and microrheology. The microfluidic device is a two-layer design with symmetric inlet streams entering a sample chamber that traps the gel sample in place during fluid exchange. Suction can be applied far away from the sample chamber to pull fluids into the sample chamber. Material rheological properties are characterized using multiple particle tracking microrheology (MPT). In MPT, fluorescent probe particles are embedded into the material and the Brownian motion of the probes is recorded using video microscopy. The movement of the particles is tracked and the mean-squared displacement (MSD) is calculated. The MSD is related to macroscopic rheological properties, using the Generalized Stokes-Einstein Relation. The phase of the material is identified by comparison to the critical relaxation exponent, determined using time-cure superposition. Measurements of a fibrous colloidal gel illustrate the utility of the technique. This gel has a delicate structure that can be irreversibly changed when shear is applied. &#181;2rheology data shows that the material repeatedly equilibrates to the same rheological properties after each phase transition, indicating that phase transitions do not play a role in microstructural changes. To determine the role of shear, samples can be sheared prior to injection into our microfluidic device. &#181;2rheology is a widely applicable technique for the characterization of soft matter enabling the determination of rheological properties of delicate microstructures in a single sample during phase transitions in response to repeated changes in the surrounding environmental conditions.

We demonstrate the fabrication and use of a microfluidic device that enables multiple particle tracking microrheology measurements to study the rheological effects of repeated phase transitions on soft matter.

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement ...

공학

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

단백질 흡착 및 폴리머 역학의 석영 결정 미세 균형 측정시 시료 준비

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...

화학

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi River basin due to its highly efficient filter feeding mechanism. The characteristic organs called gill rakers (GRs), found in many such filter feeders, facilitate the efficient filtration of food particles such as phytoplankton that are of a few microns in size.
The motivation to investigate the rheology of the GR mucus stems from our desire to understand its role in aiding the filter feeding process in the silver carp. The mucus-rich fluid, in a &#8216;thick and sticky&#8217; state may facilitate the adhesion of food particulates. The permeation and transport through the GR membrane are&#160;facilitated by the action of external shear forces that induce varying shear strain rates. Therefore, mucus rheology can provide a vital clue to the tremendous outcompeting nature of the silver carp within the pool of filter feeding fish. Based on this it was posited that GR mucus may provide an adhesive function to food particles and act as a transport vehicle to assist in the filter feeding process.
The main objective of the protocol is to determine the yield stress of the mucus, attributed to the minimum shear stress required to initiate flow at which irreversible plastic deformation is first observed across a structured viscoelastic material. Accordingly, rheological properties of the GR mucus, i.e., viscosity, storage, and loss moduli, were investigated for its non-Newtonian, shear-thinning nature using a rotational rheometer. &#160;
A protocol presented here is employed to analyze the rheological properties of mucus extracted from the gill rakers of a silver carp, fished at Hart Creek location of the Missouri River. The protocol aims to develop an effective strategy for rheological testing and material characterization of mucus assumed to be a structured viscoelastic material.

Macro-Rheology Characterization of Gill Raker Mucus in the Silver Carp, Hypophthalmichthys molitrix

This protocol presents a method to perform rheology characterization of mucus that resides on gill rakers (GRs) of the silver carp. Viscoelastic characteristics of GR-mucus, obtained by measuring viscosity, storage and loss moduli, are evaluated for the apparent yield stress to understand the filter feeding mechanism in GRs.

실버 잉어, 하이포팔미치티스 몰리트리스의 길 레이크머 점액의 매크로-리로지 특성화

The silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, is an invasive planktivorous filter feeder fish that infested the natural waterways of the upper Mississippi ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body> 펩타이드 하이드로겔: ECF-5의 환경적으로 반응하는 겔화 방법

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking networks. Their morphology closely resembles that of the extracellular matrix, allowing them to exhibit both the biological functions of peptides and responsive gelation properties. These unique characteristics have led to their extensive application in tissue engineering, three-dimensional cell culture, cancer therapy, regenerative medicine, and other biomedical fields. This article describes three methods for preparing ECF-5 peptide hydrogels using self-assembling peptides with environmentally responsive gelation processes: (1) pH-responsive gelation: varying pH levels induce the protonation or deprotonation of amino acid residues, altering electrostatic interactions between peptide molecules and promoting their self-assembly into hydrogels; (2) Metal ion addition: polyvalent metal ions chelate with negatively charged amino acid residues, acting as bridges between peptides to form a network hydrogel; (3) Solvent exchange: hydrophobic peptides are initially dissolved in non-polar organic solvents and subsequently induce self-assembly into hydrogels upon transitioning to a polar aqueous environment. These methods utilize conventional experimental procedures to facilitate peptide self-assembly into hydrogels. By designing peptide sequences to align with specific gelation-inducing conditions, it is possible to achieve finely tuned micro/nanostructures and biological functions, highlighting the significant potential of peptide hydrogels in the biomedical domain.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 우수한 생체 적합성을 위한 자체 조립 섬유 및 펩타이드 하이드로겔 생산 개선

This protocol presents three fast and simple preparation methods that use environmental conditions to trigger the self-assembly of peptides into hydrogels. Additionally, the characterization of peptide hydrogels is described, demonstrating that mechanically stable peptide hydrogels can be formed under these straightforward conditions.

기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

단백질 기반 Hydrogels 대상이 힘-클램프 Rheometry

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실버 잉어, 하이포팔미치티스 몰리트리스의 길 레이크머 점액의 매크로-리로지 특성화

치료 응용 프로그램을위한 도구로 RGD-작용 히드로 겔의 합성

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

기계적으로 안정적인 자체 조립 펩타이드 하이드로겔의 제조

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