이 방법은 엽록소세포 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다, 예를 들어, 엽록체 단백질 수입 기계의 조성. 그것은 녹색과 광합성에 필수적이며, 따라서 지구상식량 생산을 위해서이다. 분자 기계는 TOC 및 TIC라고 불리는 엽록소의 외부 및 내부 부재내의 두 개의 별도 복합체로 구성되지만 조성물은 완전히 알려져 있지 않다.
이 기술의 주요 장점은 아라비도시스 TOC/TIC 복합체의 정제가 단일 단계 정화 방법, TAP-TOC 정제로 달성될 수 있다는 것입니다. 그것은 구체적이고 효율적인 방법입니다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 연구원은 엽록세막 분수, 세제, 용용화 또는 친화성 정화의 격리에 익숙하지 않기 때문에 투쟁할 수 있습니다.
아라비독시스 식물을 준비한 후, 차가운 박격포를 사용하여 액체 질소로 3주 된 묘목 10그램을 갈아서 모래로 유봉합니다. 20 밀리리터의 냉간 분쇄 버퍼를 분쇄 조직에 추가합니다. 잘 섞어서 혼합물을 얼음 위에 해동시키세요.
다음으로, 분쇄 버퍼와 빠른 여과 재료의 두 층을 담그십시오. 여과 재료의 두 층을 통해 균질을 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 필터링합니다. 10분 동안 섭씨 4도에서 1, 500g의 필기를 원심분리하고 상류물을 신선하고 미리 냉각된 50밀리리터 원심분리튜브로 옮긴다.
동일한 조건에서 원심분리를 한 번 더 반복합니다. 상체를 차가운 38.50 밀리리터 초원심분리기 튜브로 옮기고 차가운 분쇄 버퍼로 최대 35밀리리터까지 위로 올려다보십시오. 초원심분리기를 사용하여 샘플을 100, 000배, 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리합니다.
유리 테플론 균질화제를 사용하여 분쇄 버퍼에서 녹색 펠릿을 다시 놓습니다. 원심분리기는 1시간 동안 100g, 000배, 섭씨 4도에 달하며 상신기를 폐기합니다. 유리 Teflon 균질화제를 사용하여 1x 연삭 버퍼의 18.75 밀리리터에서 녹색 펠릿을 다시 재생합니다.
그런 다음 하나의 x 연삭 버퍼의 또 다른 9.375 밀리리터를 추가합니다. 4x 용용화 솔루션의 9.375 밀리리터를 추가하여 최종 볼륨을 37.5 밀리리터로 가져오고 30분 동안 섭씨 4도의 회전 셰이커에 배양합니다. 그 후 초원심분리기를 사용하여 샘플을 100, 000배, 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리합니다.
용해된 멤브레인을 포함하는 상체를 신선한 50 밀리리터 원심 분리튜브로 옮기. IGG 아가로즈 수지를 준비한 후, 이전에 세척된 IGG 아가로즈 수지들을 용해막 37.5밀리리터를 함유한 50밀리리터 원내 튜브로 이송한다. 섭씨 4도에서 회전 셰이커에 밤새 배양.
다음 날, 퇴적물 IGG 아가로즈 수지는 100배, 섭씨 4도에서 5분간. 파이펫을 사용하여 상퍼를 제거합니다. IGG 아가로즈 수지37.5 밀리리터의 완충 A를 10분 동안 실온에서 회전 셰이커에 배양하였다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 침전및 세척을 계속합니다. 그 후 IGG 아가로즈 수지를 35 마이크론 필터로 500 마이크로리터 스핀 컬럼으로 옮긴다. 구슬을 TEV 용출 버퍼 300마이크로리터로 두 번 세척하여 평형을 위해 세척합니다.
다음으로, TEV 용출 버퍼의 300 마이크로 리터를 추가 TEV 프로테아제 10 마이크로 리터를 포함. 스핀 컬럼을 온도 16도, 350 rpm에서 2시간 동안 Thermomixer에 구슬로 배양합니다. 그런 다음 스핀 컬럼을 열고 새롭고 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.
이 튜브를 100배, 섭씨 4도에서 5분간 회전하여 용액을 채집합니다. 이 연구에서는 형질전환 A.thaliana 식물로부터 TAP 태그 엽록소 봉투 단백질 복합체가 정제된다. 면역블롯 분석은 TAP-TOC159를 격리하여 TOC 컴플렉스의 TOC75 및 TOC33과 상호 작용하는 것을 확인합니다.
인광TOC159로 알려진 엽록혈성 외막 키나아제, KOC1도 공동 분리된다. TIC110의 존재는 격리 된 TAP-TOC159 단지가 TIC 복합체의 구성 요소를 포함하고 있음을 보여줍니다. FBN1A 항체는 TAP-TOC159 복합체를 인식하지 못하여 오염이 없다는 것을 나타냅니다.
음의 대조군에서, 면역 침전된 NTAP 단백질은 TOC, TIC 단백질중 어느 한 쪽과 공동 분리되지 않았으며 TAP-TOC159 정제의 특이성을 확인하였다. 이 방법은 엽록소 단백질 수입에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 잠재적으로 아라비도시스 탈리아나 병 시스템의 다른 복합체에 적용 될 수있다. 이 절차에 따라, 알려진 구성 요소의 존재를 입증하거나 TOC 및 TIC 복합체의 새로운 구성 요소를 식별하기 위해 서부 블로팅 또는 질량 분석과 같은 다른 방법을 적용 할 수 있습니다.
이 기술은 TOC 및 TIC 복합체의 새로운 성분의 기능을 탐구하기 위해 엽록소 단백질 수입 분야에서 연구를 위한 길을 열었습니다.
