이 프로토콜은 혈소판의 잠재적 사용을 혈액 내의 시험관 내 및 생체 내 모두에서 매우 민감한 산화 질소 센서로 다룹니다. 혈소판 산화질소의 인포이성 혈관 확장제-자극인 계포단백질 또는 P-VASP 세린(239)은 나노몰라 계보에서 산화질소의 존재를 검출하는 기능을 포함하여 몇 가지 장점이 있다. 건강한 기증자로부터 30~50밀리리터의 전혈을 수집한 후 2시간 이내에, 원심분리를 위해 15밀리리터 원추형 튜브의 적절한 수에 혈액의 5밀리리터 알리쿼트를 추가합니다.
플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 슈퍼나티의 상부에서 혈소판이 풍부한 플라즈마를 조심스럽게 수집합니다. 두 번째 원심분리로 플라즈마가 풍부한 혈소판을 펠렛과 부드럽게 CGS 버퍼의 다섯 밀리리터에 펠릿을 세척. 상온에서 10 분 동안 400g의 원심 분리기.
원심분리가 끝나면 수정된 티로드 버퍼의 3밀리리터로 펠릿을 재차한다. 혈류계를 사용하여 혈소판 서스펜션의 밀도를 신선한 티로드 버퍼에서 밀리리터당 8번째 세포로 3배 10으로 계산하고 조정한다. 그런 다음 혈소판 서스펜션을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.
한편, 전체 혈액 샘플의 플레이트 프리 플라즈마 층에서 적혈구를 수집한 다음 세척당 PBS 5밀리리터에서 4개의 세척을 한다. 마지막 세척 후, 슈퍼 나츠제를 버리고 고무 스토퍼로 닫혀 폴리 프로필렌 병에 적절한 실험 적혈구에 플라즈마가 풍부한 혈소판의 1 밀리리터와 적혈구를 혼합. 각 격막에 헬륨 가스 탱크에 연결된 바늘을 삽입하고 가스 배출을 만들기 위해 26 게이지 바늘을 삽입합니다.
그런 다음 천천히 실온에서 병을 소용돌이고 산화계를 사용하여 탈산소 공정을 모니터링하기 위한 부분 산소 압력을 측정합니다. 산소 감소속도는 헬륨 유량및 교반 속도에 따라 달라집니다. 따라서 실험 시작 전에 산소화 시간을 최적화해야 하므로 실험 설정의 형상에 크게 의존해야 한다.
적혈구 아질산염 감소를 위해, 10 마이크로몰라 최종 농도가 달성되도록 중격을 통해 아질산염을 주입하여 PRP 및 RbC의 탈산소 샘플에 아질산염을 주입하십시오. 샘플을 섭씨 37도에서 최소 10분 동안 배양하고 각 샘플의 1밀리리터를 원심분리기를 위한 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 300 마이크로리터의 혈소판 현탁액을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고 1~9비율로 각 튜브에 산성 구연산 덱스트로스를 첨가한다.
혈소판을 다시 원심분리하고 각 튜브에 3개의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 얼음 냉용 리시스 완충제 80마이크로리터에서 펠릿을 재분리한다. 다음으로, 각 샘플에서 15 마이크로그램의 단백질을 별도의 10%SDS-PAGE 젤 2개로 로드합니다. 젤을 1.3시간 동안 120볼트에서 실행합니다.
실행의 끝에서, 개별 아산화 질소 셀룰로오스 막에 젤을 전송하고 5 % 비지방 건조 우유의 적절한 부피와 비특이적 결합을 차단합니다. 적절한 1 차 항체와 함께 멤브레인을 4섭씨에서 하룻밤 동안 배양한 다음 실온에서 45 분 동안 적절한 이차 말 무 과산화항체로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 밴드 밀도를 정량화하기 위해 이미저로 멤브레인을 노출합니다.
건강한 정맥 혈액 샘플은 수은의 50 ~80 밀리미터 사이의 부분 산소 압력 값을 갖는다. 헬륨에 의한 탈옥은 산소의 부분 압력을 10분 이내에 25밀리미터의 수은으로 빠르게 감소시다. 부분 산소 압력의 추가 감소는 증가 된 탈산소 시간으로 달성 될 수있다.
증가 된 탈산소는 점점 적색 플라즈마에 의해 표시된 바와 같이 용혈의 증가 수준으로 이어집니다. 이것은 탈산소의 효과이며 헬륨없이 교반 된 샘플에서 용혈의 부족으로 표시된 대로 교반하여 발생하지 않습니다. 혈관 확장제-자극 인포프로틴 또는 VASP 및 포스포리드-VASP 발현 수준은 서부 블롯에 의해 검출된 바와 같이 산소분해된 시료에서 혈소판에서 혈소판의 혈소판에서 의 혈소판에서 의증가와 함께 감소하였다.
단명한 산화질소 기증자를 가진 처리는 처리의 10 초 안에 혈소판에 있는 인광질 혈관 확장제 자극인 자극인 인단 발현을 증가합니다. 또한, 인포리드-VASP 또는 P-VASP의 수준은 기존의 P-VASP 수준에 영향을 주지 않고 혈소판에서 RbC를 분리하기에 충분한 시간이 있음을 나타내는 혈소판이 풍부한 혈장으로 NO 기증자의 인큐베이션 후 최대 10분까지 안정적으로 유지되었다. 아질라이트는 또한 산소가 많은 RbC의 존재에서 혈소판의 P-VASP 수준을 증가시킵니다.
여기서 총 VASP에 대한 P-VASP의 비율은 헤마토크릿의 수준에 따라 다릅니다. VASP는 혈소판에서 높게 발현되고 산화질소의 존재에서 급속하게 인포화된다. 따라서, 본 프로토콜은 다양한 생리자극에 의한 산화질소의 유도를 연구하는 방법을 제공한다.
이 방법을 통해, 우리는 성공적으로 생체 내에서 흡입 아질산염에 의해 산화 질소 자극의 마커로 혈소판에서 증가 P-VASP를 사용했다. 생물학적 표본을 가진 혈소판으로 일하는 것은 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 수행되어야한다는 것을 잊지 마십시오.
