이 방법은 RNA 단백질 복합체를 분리하고 질량 분석법에 의하여 그들의 조성물을 확인하는 것을 시도하는 연구원에게 주의해야 합니다. 우리는 우리의 프로토콜이 제한된 양으로 세포에 존재하고 긴 다단계 정화 절차 동안 해리하는 경향이 있는 복합체를 정화하는 데 특히 유용할 것이라고 믿습니다. 이 방법의 주요 장점은 단일 정화 단계만 을 포함하고 모든 길이및 서열의 RNA 결합 부위와 함께 사용될 수 있다는 것입니다.
일부 단계를 시연하는 것은 우리 그룹의 선임 연구 기술자인 샤오쿠이 양이 될 것입니다. 65개의 뉴클레오티드보다 훨씬 긴 결합 부위의 경우, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 T7 생성 된 RNA 및 어댑터 PCB 올리고뉴클레오티드를 얻습니다. 결합 완충제의 100 마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 어댑터 올리고뉴클레오티드의 100 피코몰과 RNA의 20 피코몰을 혼합.
튜브를 끓는 물에 넣고 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 물이 실온으로 식힙니다. pH 8에서 80 밀리머 EDTA를 함유한 마우스 핵 추출물의 1 밀리리터를 10 밀리머의 최종 농도로 보충합니다.
그런 다음 PCB 모이티로 태그된 RNA 기판의 5 그리고 10 피코몰을 추가합니다. 5분 동안 얼음에 배양하여 샘플을 섞는 경우가 있습니다. 다음으로 전냉각된 미세원심분리기를 섭씨 4도에서 원심분리하여 10분 동안 10, 000배 g에서 혼합물을 원심분리하여 잠재적침전을 제거합니다.
펠릿 이송을 피하기 위해 주의하면서 얼음에 새로운 튜브로 상체를 조심스럽게 수집합니다. 약 100 마이크로리터의 스트렙타비딘 아가로즈 비드 서스펜션을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기다. 구슬 세척을 시작하기 위해 약 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다.
2-3분 동안 25배 g의 원심분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다. 이 세척 및 원심 분리 과정을 2~3회 반복하여 구슬을 바인딩 버퍼로 평형화합니다. 이전에 수집된 상체를 평형 구슬 위에 조립된 복합체가 들어 있는 로드합니다.
튜브 회전기를 사용하여 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전하여 RNA를 고정하고 복합체를 구슬에 고정시하십시오. 다음으로 튜브의 바닥에 구슬을 수집하기 위해 2~ 3 분 동안 25 배 g에서 튜브를 회전시십시오. 상체를 흡인합니다.
그리고 이전에 설명된 세척 공정을 사용하여 바인딩 버퍼로 구슬을 두 번 헹구는 다. 두 번째 세척의 상체를 제거한 후, 1 밀리리터의 바인딩 버퍼를 추가하고 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전시합니다. 2-3분 동안 25배 g로 샘플을 회전시.
다음으로 바인딩 버퍼 1 밀리리터를 추가하고 서스펜션을 새 튜브로 전송합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 최대 1시간 동안 회전시합니다. 2~3분 동안 25배 g의 고정된 복합체원심분리기.
그런 다음 슈퍼나탈을 흡인하고 200 마이크로리터의 바인딩 버퍼를 추가합니다. 구슬을 500 마이크로리터 튜브로 옮기습니다. 365 나노미터에서 UV 광을 방출하고 전체 광채에 도달 할 수있는 고강도 UV 램프를 켭니다.
페트리 접시의 바닥을 꽉 포장된 얼음으로 채우면 접시 뚜껑 위에 쌓입니다. 고정 된 복합체를 포함하는 튜브를 간략하게 소용돌이. 그런 다음 얼음 위에 수평으로 놓고 미리 데워진 램프로 덮어 샘플이 전구 표면에서 2~3cm 떨어져 있는지 확인합니다.
균일한 노출을 보장하고 과열을 방지하기 위해 튜브를 자주 반전하고 소용돌이치면서 총 30 분 동안 샘플을 조사하십시오. 그 후 25회 g에서 2-3분간 구슬을 스핀다운하고 상수모를 수집합니다. 원심 분리는 동일한 조건을 사용하여 다시 한 번이 상신합니다.
잔류 구슬을 옮기지 않도록 튜브 바닥에 소량을 두는 결과 상체를 수집합니다. SDS-PAGE 전기포고증을 사용하여 UV 용출 후 구슬에 남아 있는 물질로부터 UV 용출 된 상신제의 일부와 해당 분획을 분리합니다. 다음으로 시판되는 실버 염색 키트를 사용하여 젤을 염색합니다.
UV 에로테인초상체에 존재하는 단백질의 강도와 UV 조사 후 구슬에 남은 단백질의 강도를 비교하여 UV 용출의 효율을 평가한다. 관심있는 단백질 밴드를 소비하고 질량 분석법에 의해 자신의 정체성을 결정합니다. 그 후, 질량 분광법에 의해 UV 용출 된 상체의 일부를 직접 분석하여 정제 된 물질의 전체 프로테오메를 편견없는 방식으로 결정합니다.
이 연구에서는, 광클레이블 비오틴으로 태그된 줄기 루프 RNA는 마우스 골수종 세포로부터 얻어진 세포질 S100 추출물의 1밀리리터로 배양된다. 그리고 자외선 용출의 효과와 효율은 은 염색에 의해 분석됩니다. 많은 단백질이 자외선 용출 전에 스트렙타비딘 구슬에서 검출됩니다.
긴 파도 UV를 가진 조사는 구슬에 비특정 배경을 남기는 상체로 이 단백질의 단지 몇몇을 풀어 놓습니다. 이것은 UV 용출 단계의 중요성을 강조합니다. 질량 분석법은 주요 UV 용출 단백질을 3'hExo 및 SLBP로 식별하며 SLBP는 전체 길이 단백질과 다수의 짧은 분해 제품으로 표현되고 있습니다.
다양한 RNA 결합 단백질로 확인된 소량의 다른 단백질도 UV 조사에 의해 용액으로 선택적으로 방출된다. 핵 추출물로 배양된 광클형 비오틴으로 태그된 고정된 Drosophila histone 의 UV 용출은 구슬에 남아 있는 비특이적 단백질의 강렬한 배경을 가진 소수의 단백질만 초상체에 선택적 방출을 초래하였다. 질량 분석법은 이러한 단백질을 U7 snRNP의 성분으로 식별합니다.
그들은 히스톤 프리 mRNA에 U7 snRNP의 결합을 차단하는 처리 경쟁자의 존재에서 검출되지 않습니다. 고강도 UV 램프를 사용하고 조사된 샘플과 가까운 거리를 배치하는 동시에 과열되지 않도록 하는 것이 중요합니다. UV 용출 방법은 주요 오염 물질이 부족하고 추가 정화 단계 및 기능적 작용에 직접적으로 적합한 네이티브 RNA 단백질 복합체를 산출합니다.
자외선 조사 중에 눈과 피부 노출을 피하십시오.
