우리는 친절 하 게 그의 참여 프로젝트, 생산적인 토론과 좋은 감독에 대 한 교수 박사 로타어 Willmitzer를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 proteomic MS 측정 도움 박사 다니엘 Veyel에 감사입니다. 우리 부인 Änne Michaelis LC MS 측정 우리 귀중 한 기술적인 도움을 제공 주셔서 감사 합니다. 또한, 우리는 닥터 모니카 Kosmacz와 박사 Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska를 그들의 도움과 원래 원고에서 작업에 참여에 대 한 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

저자는 공개 없다.

제시 프로토콜 대상 단백질의 PP와 오후 단지의 병렬 식별 수 있습니다. 최종 결과를 복제에서 실험 8-12 주 만큼 적게 완료할 수 있습니다. 완전 한 AP 걸립니다 약 4-6 h 12 ~ 24 샘플 집합에 대 한 우리의 프로토콜 중간 처리량 분석을 위한 적합 한 렌더링.
프로토콜, 되 고 전반적으로 간단에 불구 하 고 중요 한 단계의 수가 있다. (i) 충분 한 양의 입력된 단백질 및 선호도 구슬 대사 산물 탐지의 동적 범위를 도달 하는 중요 한 이다. 효율적인 셀 세포 따라서 절차에서 중요 한 단계입니다. 불 쌍 한 단백질 수율 차선 세포의 용 해 버퍼/재료 비율 또는 자료의 부족 분쇄의 결과 될 수 있습니다. (ii) 해야 주의 사용된 시 약 MS-친화입니다. 강한 세제, 글리세롤, 또는 소금의 과도 한 양의 그들은 MS 검색을 방해 피해 야 한다. (iii) Agarose 구슬 해서는 안됩니다-건조 단계, 세척 하는 동안 그리고 진공 매니폴드를 사용 하는 경우 그것은 구슬 파괴 또는 복잡 한 안정성에 영향을 미칠에 그렇게 하지 않도록 느린 흐름 속도 적용 하는 것이 중요.
제시 프로토콜에 중요 한 몇 가지 가능한 수정이 있다: (i) 제정 CaMV35S 모터를 사용 하 여 미끼 단백질의 양을 최대화 하는 우리. Overexpression, 매우 유용한, 고 수 있습니다 세포 항상성28 에 심각한 영향을 미칠 생리 적으로 관련이 없는 상호 작용의 형성으로 이어질. 식 사용 하 여 네이티브 발기인 기능 손실 배경에서 가능한 진정한 생물학 인터 검색에 대 한 우수한 여겨진다 태그 단백질입니다. 일반적으로 식물 세포 배양에 표현 하는 단백질에 대 한 식물 배경 관련 인터를 식별 하는 데 필요한 증명할 수 있습니다. (ii) 작업할 때 막 단백질, 세포의 용 해 버퍼는 MS 호환 세제로 보완 될 필요가 있다. (iii) 두 번째 친 화력 정화 단계 소개 가양성 true 반응 비율을 개선 하 고 EV 컨트롤29필요 수 있습니다. 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그 모두 힘들고 시간이 소모 되는 마에 다 외. 201411, 추가 크기 배제 크로마토그래피 단계에 매력적인 대안을 선물 한다.
AP의 가장 심각한 결점은 잘못 된 반응의 높은 속도. 이유는 수많은. 제정 overexpression 이미 언급 했다. 순수 없는 상호 작용의 다른 소스 고립 된 세포를 사용 하지 않는 한 단백질과 다른 subcellular 구획에서 대사 산물의 혼합물을 포함 하는 전체 세포 lysates의 준비 이다. Subcellular 지 방화는 진정한 인터에 대 한 필터링을 사용 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 잘못 된 반응의 대부분 난다 바인딩 단백질과 agarose 수 지 사이에서 유래한 다. 그러나 두 번째 정화 단계의 소개, 위에서 설명한 문제에 최고의 솔루션을 제공 합니다, 그리고 시간과 처리량 비용 온다. 또한, 약한 상호 작용 프로토콜 확장으로 손실 될 수 있습니다. AP의 또 다른 경고는 포괄적인 정보 제공 하는 위하여 대상 단백질의,에 불구 하 고 baited 단백질의 직접 및 간접 목표 구별 불가능 이다. 타겟된 분자 접근 상호 작용을 확인 필요 합니다.
MS 기반 대사체학 함께 AP S. cerevisiae12. 단백질 복합물 공부 하는 사용 했다 이 작품은, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 유지 세포 lysates에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 우리의 이전 관찰13 함께 제시 프로토콜에 대 한 개념적 기초를 제공 합니다. 우리의 프로토콜 3 독특한 포인트 특징 이다: (i) 반면에 누 룩을 작동12, AP 검색 뿐만 아니라 소수 하지만 또한 친수성 단백질 ligands에 적합 하다는 설명. (2) 3-에서-하나의 추출 프로토콜을 도입 하 여 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 인터를 공부 하는 단일 AP은 사용할 수 있습니다. (iii) 우리는 식물 세포 프로토콜을 적응.
향후 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그를 만드는 방법에 집중할 것 이다. 우리 또한 낮은 풍부한 식물 호르몬과 같은 작은 분자에 프로토콜의 적합성을 탐험 하 고 싶습니다.

방법을 설명 여기 근처-vivo에서 세포 lysate 조건에서 선택의 단백질의 대사 산물과 단백질 파트너의 식별에 목표. 그것은 많은 더 많은 대사 산물 오늘 특징 보다는 중요 한 규제 기능1는 추측 하고있다. 대사 산물은 생물학 스위치, 활동, 기능, 및 그들의 수용 체 단백질의2,,34의 지역화 변경으로 작동할 수 있다. 지난 10 년간에서 근처-vivo 조건, 또는 vivo에서 PMI의 식별 사용 여러 가지 획기적인 방법이 개발된5되었습니다. 사용할 수 있는 접근은 두 그룹으로 분리 수 있습니다. 첫 번째 그룹에는 소설 단백질 파트너를 트랩 하려면 알려진 대사 산물 미끼와 함께 시작 하는 기술 구성 되어 있습니다. 방법은 선호도 크로마토그래피6, 마약 선호도 응답 대상-안정성 분석 결과7, 항 암 치료-proteomics8및9프로 파일링 열 프로테옴 포함 됩니다. 알려진된 단백질 작은 분자 ligands10,11을 식별 하기 위해 시작 하는 단일 메서드 두 번째 그룹에 의하여 이루어져 있다.
MS 기반 lipidomics 함께 AP Saccharomyces cerevisiae12. 단백질 지질 단지 분석 하는 데 사용 했다 시작 지점으로 저자 표현 21 효소 ergosterol 생 합성에 관여 하는 효 모 종자를 사용 하 고 103 kinases 융합 협동 친 화력 정화 (꼭지) 태그. 효소의 70% 및 20%는 kinases의 복잡 한 단백질 지질 상호 작용 네트워크로 빛을 발산 하는 다른 소수 성 ligands를 바인딩할 발견 됐다.
이전에, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 또한 유지 세포 lysates13에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 수 설명 합니다. 이러한 결과에 따라, 우리는 AP를 최적화 하기로 메서드 출판 이전 식물 세포 및 친수성 화합물1410,11 . 이 목적으로, 밴 Leene 외. 2010, PPI 연구15공장에서 성공적으로 사용 하 여 설명 탭 벡터 사용 했습니다. 유전자 변형 라인을 얻는 데 필요한 시간을 단축, 우리 애기 세포 배양에 결정 했다. 우리 고용 원스텝 메 틸 tert-부 틸 에테르, (티비) / 메탄올/물 추출 방법, 단일에서 단백질 (펠 릿), 지질 (유기 단계), 그리고 친수성 대사 (수성 단계)16 의 특성을 허용 친 화력 정화 실험입니다. EV 컨트롤 라인 가양성, 혼자 태그에 바인딩 단백질 예 제외에 도입 되었다. 우리는 3 (5) 태그 개념의 증거로 서 nucleoside diphosphate kinases 애기 게놈 (NDPK1-NDPK3)에 존재. NDPK1 티 S상호 작용 설명 수 다른 결과, 중-전이 효소와 티. 따라서 우리는 NDPK1 glutathionylation14받게 됩니다 증명할 수 있습니다.
정리해 보면, 제시 프로토콜 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용 네트워크 특성화를 위한 중요 한 도구 이며 기존 방법에 비해 주요 사전 구성.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

세포질 과정은 단백질, 대사, 핵 산 등과 같은 생체 분자 간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 조사는 없는 참신, 실험적인 접근 생 단백질 대사 산물 상호 작용 (PMI)을 특성화 목표로 오히려 최근 개발을 구성 합니다. 여기, 우리는 PPI와 미끼 라고 선택의 단백질의 PMI의 동시 분석을 허용 하는 프로토콜을 제시. 우리의 프로토콜은 최적화 된 애기 셀 문화 및 친 화력 정화 (AP)를 결합 한 질량 분석 (MS)와 함께-기반 단백질 및 대사 산물 검출. 즉, 미끼 단백질 선호도 태그 융합을 표현 하는 유전자 변형 애기 라인 기본 세포 추출을 lysed 처음은. 방지 태그 항 체는 풀 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너 다운 하는 데 사용 됩니다. 친 화력 정화 단지 1 단계 메 틸 tert를 사용 하 여 추출 됩니다-부 틸 에테르 (티비) / 메탄올/물 방법. 대사는 극 지 또는 소수 성 위상, 분리 하는 동안 단백질 펠 릿에서 찾을 수 있습니다. 대사 산물과 단백질 다음 울트라 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (UPLC MS 또는 UPLC-MS/MS)에 의해 분석 된다. 빈 벡터 (EV) 제어 라인 가양성을 제외 하는 데 사용 됩니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 근처 생리 적 조건 (세포 lysate)에서 동시에 대상 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너의 식별 수 있습니다. 제시 방법 간단, 신속, 그리고 식물 세포 배양 이외의 생물 학적 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

원래 연구에 3 개의 A. thaliana NDPK 유전자 PSB L 셀 서 스 펜 션 문화 제정 35S 발기인14 (그림 1)의 통제에 overexpressed 했다. 탠덤 선호도 태그 미끼 단백질의 카 또는 아미노-터미널 끝을 융합 했다. 친 화력 정화 단지 티비/메탄올/물 추출16를 받게 했다. 선호도 뽑아 단백질과 작은 분자는 MS (테이블 S2 및 S3)를 사용 하 여 확인 되었다.
판정에 대 한 수정, 빈 샘플 작은 분자 오염 물질 화학 제품 및 실험실 소모품에서 제외 사용 되었다. 또한, 대사 산물 선호도 태그 중 하나에 바인딩 또는 혼자 수 지 단백질은 고려 EV 컨트롤 라인을 사용 하 여. 참 긍정 양측 쌍이 아닌 학생의 t-검정, Benjamini & Hochberg 틀린 발견 비율을 검색 하 보정 대사 (테이블 S4) 및 단백질 (테이블 S5) 크게 NDPKs AP에 농축 식별에 적용 된 EV 컨트롤 라인에 비해 (N-와 C-말기 태그 NDPKs) 실험 (루즈벨트 < 0.1). Note는 이전 작품에서 우리 사용 부재/존재 조건을 단백질과 작은 분자 인터 윤곽을 그리 다.
대표 결과 NDPK1를 위한 dipeptides, 우리의 그룹에 작은 분자 레 귤 레이 터의 새로운 클래스에 대사 산물 데이터 초점 동안 받는다. Proteomic 분석 NDPK1의 26 상 상속 단백질 파트너를 공개 했다. 공동 NDPK1으로 같은 subcellular 구획에서 화 된 단백질에 대 한 추가 필터링 (cytosol) 목록 13 상 상속 단백질 인터 한정. 확인 된 단백질 가운데 티 S-전이 효소, 두 개의 신장 개시 요인, tubulin, 및 aconitate hydratase. Metabolomic 분석 4 dipeptides 발 레이, Ile Glu, 레이-한 일-NDPK1와는 특별히 공동 eluted Phe 밝혀 (그림 2). 참고 모든 4 개의 dipeptides 그들의 N-말단, 공유 바인딩 특이성 제안에 소수 성 잔류물을 공유 합니다.
알려진된 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지 우리가 찾을 쿼리 13 단백질과 스티치 데이터베이스25 (그림 3)에 대 한 4 개의 dipeptides 식별. 여러 가지 관측을 만들 수 있다: (i) 이전 NDPK1에 대 한 보고는 없는 인터. (ii) APX1 ortholog 알데하이드 효소 가족 ALDH7B4, 번역 개시 인자 FBR12 다른 번역 개시 인자 유전자 AT2G40290에 의해 동안에 상호 작용을 보고 되었다. (iii) 확인 된 dipeptides 더 단백질 파트너를 보고 있다. 공동 eluted dipeptides 이전 모든 검색 된 식물 단백질에 관련 된 보도 했다. 그러나, 그들은 다른 유기 체에서 중요 한 역할 놀이: 레이-일, 예를 들면, 인간 세포 선26neurotrophin 활성화 효과가 있다. 참고 실험 시스템의 정확한 토폴로지 확인 허용 하지 않습니다. 예를 들어 한 dipeptide NDPK1와 직접 상호 작용할 수 있지만 잘 공동 순화 된 단백질의 어떤 관련이 있을 수 있습니다.
함께 찍은, 우리의 결과 보여준다 질량 분석, 함께 AP를 고용 설립된 절차, 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 인터의 식별을 용이 하 게 하 고 도움에 대 한 광범위 한 정보를 생성 합니다 위하여 대상 단백질의.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> 그림 1입니다. AP-MS 워크플로의 체계입니다. (A) 식물 세포 배양에서 네이티브 녹는 분수의 준비. (B) AP 절차의 다음 단계. 열에 샘플을 로드 한 후 관심 (POI) 탭 태그 융합 단백질 agarose 구슬에 움직일 IgG 항 체에 바인딩합니다. 열 세척 언바운드 단백질 및 대사 산물의 제거를 촉진 한다. AcTEV 분열을 수행한 후 포 단백질 대사 산물 단지는 eluted. (C) 단백질 및 대사 산물 분수 반 양적 MS 분석 뒤에 단지의 분리. 이 그림의 일부는 Luzarowski 외. 201714에서 재현 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> 그림 2입니다. 특히 공동 NDPK1와 방출 dipeptides. 4 dipeptides 발 레이 (A), Ile Glu (B), 레이 일 (C), 및 일 페 (D) AP 실험에서 측정의 평균 농도 구성 했다. 모든 4 개의 dipeptides NDPK1 샘플 EV 제어에 비해 상당한 농축 표시 (별표 나타냅니다 루즈벨트 < 0.1). 오차 막대 대표 6 측정 표준 오차 (N-3 복제와 C 말기의 3 태그 단백질). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> 그림 3입니다. 공동으로 NDPK1, 방출 하는 모든 분자의 상호 작용 네트워크 이전만 고려 하는 스티치 데이터베이스에 대해 쿼리 실험 및 데이터베이스 증거 (신뢰 > 0.2). 높은 신뢰 상호 작용의 더 높은 기회를 나타냅니다 하 고 예금 된 데이터에 따라 계산 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S1입니다. MaxQuant 출력 테이블 "parameters.txt". 테이블 식별 및 정량화, 뿐만 아니라 사용 하는 데이터베이스에 대 한 정보에 대 한 임계값이 포함 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S2 MaxQuant에서 정보 출력 테이블 "proteinGroups.txt". 테이블에는 모든 확인 된 단백질 그룹, 농도, 및 고유 펩 티 드 및 점수 번호 등 추가 정보 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S3 극 지 대사 산물의 분석을 포함 하는 출력 파일입니다. 테이블에 모든 확인 된 대량 기능 특정 m/z, RT 및 강도 특징의 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S4입니다. Dipeptides는 NDPK1, NDPK2 또는 NDPK3 미끼로 사용 되었다 AP 샘플에서 발견. Dipeptides 빈 샘플에는 목록에서 제외 했다. 두 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK는 3 중에서 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 < 0.1). 주어진 ΔRT 계산 됩니다 참조 화합물과 monoisotopic 질량 주어진 Metlin27에 관하여 Δppm. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S5입니다. NDPK1와 공동 순화 하는 단백질. 3 중에서 2 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 < 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K 조회수.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. 단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

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Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other fields. For instance, trehalose analogues bearing detectable tags have been used to detect Mycobacterium tuberculosis and may have applications as tuberculosis diagnostic imaging agents. Hydrolytically stable versions of trehalose are also being pursued due to their potential for use as non-caloric sweeteners and bioprotective agents. Despite the appeal of this class of compounds for various applications, their potential remains unfulfilled due to the lack of a robust route for their production. Here, we report a detailed protocol for the rapid and efficient one-step biocatalytic synthesis of trehalose analogues that bypasses the problems associated with chemical synthesis. By utilizing the thermostable trehalose synthase (TreT) enzyme from Thermoproteus tenax, trehalose analogues can be generated in a single step from glucose analogues and uridine diphosphate glucose in high yield (up to quantitative conversion) in 15-60 min. A simple and rapid non-chromatographic purification protocol, which consists of spin dialysis and ion exchange, can deliver many trehalose analogues of known concentration in aqueous solution in as little as 45 min. In cases where unreacted glucose analogue still remains, chromatographic purification of the trehalose analogue product can be performed. Overall, this method provides a &#34;green&#34; biocatalytic platform for the expedited synthesis and purification of trehalose analogues that is efficient and accessible to non-chemists. To exemplify the applicability of this method, we describe a protocol for the synthesis, all-aqueous purification, and administration of a trehalose-based click chemistry probe to mycobacteria, all of which took less than 1 hour and enabled fluorescence detection of mycobacteria. In the future, we envision that, among other applications, this protocol may be applied to the rapid synthesis of trehalose-based probes for tuberculosis diagnostics. For instance, short-lived radionuclide-modified trehalose analogues (e.g., 18F-modified trehalose) could be used for advanced clinical imaging modalities such as positron emission tomography-computed tomography (PET-CT).

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

빠른 한 단계 효소 합성 및 트레 할로 오스 유사체의 모든 수계 정화

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

전사에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 생체층 간섭측정기(BLI) 적용

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...