저자는 감사 NIH P50GM103297, P30CA100730 및 종합 암 P01CA16058에 의해 지원을 인정합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 버퍼 조성물 </td></tr><tr><td> 세척 버퍼 : </td></tr><tr><td> 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 </td></tr><tr><td> 150 mM의 NaCl을 </td></tr><tr><td> 3 밀리미터의 MgCl2 </td></tr><tr><td> 낮은 소금 버퍼 : </td></tr><tr><td> 20 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5 </td></tr><tr><td> 10 mM의 염화나트륨 </td></tr><tr><td> 3 밀리미터의 MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM의 DTT </td></tr><tr><td> 1X 프로테아제 억제제 칵테일 EDTA 무료 </td></tr><tr><td> 의 RNase 아웃 5 μL / ㎖ (의 RNase 억제제) </td></tr><tr><td> 세포질 용해 버퍼 : </td></tr><tr><td> 0.2 M 자당 </td></tr><tr><td> 1.2 % 트리톤 X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 워시 버퍼 : </td></tr><tr><td> 20 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 </td></tr><tr><td> 150 밀리미터염화나트륨 </td></tr><tr><td> 0.5 % NP-40 </td></tr><tr><td> 3 밀리미터의 MgCl2 </td></tr><tr><td> 10 % 글리세롤 </td></tr><tr><td> 버퍼를 바인딩 : </td></tr><tr><td> 10 mM의 HEPES pH가 7.6 </td></tr><tr><td> 40 mM의 KCl을 </td></tr><tr><td> 3 밀리미터의 MgCl2 </td></tr><tr><td> 2 mM의 DTT </td></tr><tr><td> 5 % 글리세롤 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 버퍼 조성물에 관한 것이다. 세포 및 선호도 매트릭스 1. 준비 <ol><li> 문화 10cm의 접시에 하위 합류 (80 %)에 대한 관심의 셀 라인. 플래그 태그가 NLS-MS2 코트 단백질의 독립적 인 면역 침전 (IP)에 대한 10cm 플레이트를 사용합니다. 국기 - 에피토프 태그에 항혈청을 사용하여 IP를 수행합니다. 국기 - 태그 MS2 코트 단백질 플라스미드를 표현하면, 수확 20 미리 세포를 24 ~ 48 시간을 형질. 참고 : 특정 RNP는 핵이나 세포질에서 농축 될 수있다이러한 자당 기울기의 분수로 IC에서 해물 또는 생화학-분획 제제. 추가 음성 대조군을 제기 병렬로 비 형질 감염된 세포에서 해물을 수확하는 것이 좋습니다. </li><li> 전송 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 단백질 G 자성 비드 슬러리의 IP 당 60 μL. </li><li> 마이크로 원심 튜브는 스토리지 솔루션에서 구슬을 분리하는 자석 랙에 튜브를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 마이크로 피펫으로 그것을 그림으로써 스토리지 솔루션을 제거합니다. </li><li> 자석 랙에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 워시 1X 세척 완충액 600 μL와 비드 (비드의 10 배 사용 볼륨) 평형화 (20 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의 3 밀리미터의 MgCl 2, 150 mM의 염화나트륨) (3)과 엔드 오버 엔드 회전 실온에서 분. </li><li> 자석 랙에 튜브를 놓고 세척 버퍼를 제거합니다. </li><li> 평형화 홍보에 1X 세척 버퍼와 immunoprecipitating FLAG 항체의 10 권 (600 μL)를 추가immunoprecipitating 항체 공역 적어도 30 분 동안 실온에서 및 회전 엔드 오버 엔드 (은 An 면역 제조업체에서 권장하는 양에 따라) otein G 자석 구슬. 적절한 항체 음성 대조군으로 대응하는 이소 타입의 IgG를 사용합니다. </li><li> 구슬을 수집하고 뜨는을 제거 자석 랙에 튜브를 놓습니다. </li><li> 자석 랙에서 관을 제거하고 실온에서 3 분 동안 1X 세척 완충액 회전의 10 볼륨 (600 μL)를 항체가 접합 된 비드를 세척 하였다. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 자석 랙에 튜브를 놓고 세척 버퍼를 제거합니다. </li></ol> 2. 수확 RNP들 참고 : 단계 1.8 이후의 배양 시간 동안 RNP들을 준비합니다. <ol><li> 흡인 세포로부터 배양 배지를 제거하고 빙냉 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)로 두 번 세포를 씻어. 젖은 꺼 내려 셀 스크레이퍼를 사용하여,4 ° C에서 4 분 동안 226 XG에 원심 분리하여 이전 컬렉션에 부착 세포. </li><li> 3 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 NaCl을 2 mM의 DTT, 1X 프로테아제 억제제 칵테일, EDTA 무료, 5 μL / ㎖ 얼음처럼 차가운, 저염 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 7.5의 375 μl를 추가 된 RNase 세포 펠렛을 억제)와 5 분 동안 얼음 상에 배치하여 팽윤 허용한다. 주 : 세포 펠렛의 크기에 따라 저염 완충액 용적 맞춤. 10 센티미터 판에서 1.2 × 10 6 세포의 경우, 버퍼의 375 μL 충분하다. </li><li> 상기 세포질 세포 용 해물을 수집 빙냉 용해 완충액 125 μL를 추가하는 (0.2 M 수크로오스 / 1.2 % 트리톤 X-100) 한 다음 얼음 통에서 미리 냉각시키고 다운스 균질 10 스트로크를 수행한다. 참고 : 전체 세포 추출액을 수집하려면, 표준 RIPA 용해 버퍼는 핵질 / 염색질을 가용화하는 것이 좋습니다. </li><li> 1 분 최고 속도 (16,000 XG)에서의 microfuge에 스핀; 이 파편 (a)의 상층 액을 취소합니다차 핵. </li><li> 얼음에왔다 새로운 1.7 ML의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 예 브래드 포드 분석법 (23)과 같은 표준 실험실 바람직한 방법에 의해 총 단백질 농도를 결정한다. , 웨스턴 블롯 분석을 위해, 적어도 10 %의 분취 량을 예약 입력 대조군으로 사용한다. 면역 즉시 수확 된 세포 용 해물을 사용하거나 향후 분석을 위해 -80 ° C에서 보관합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면,이 샘플이 저장 될 수 및 무결성의 타협없이 면역 분석을 위해 몇 달 후 사용. </li></ol> 3. 면역 침전 <ol><li> 대상 항체에 접합 비드 단계 250에서 판정 된 단백질 농도에 기초하여 수확 된 세포 용 해물의 원하는 양을 추가. 1X 세척 완충액을 사용하여 600 μL까지 총 부피를 가지고 실온에서 90 분 동안 엔드 오버 엔드 돌린다. 참고 :이 시간이 발생하기에 충분하다비 특정 바인딩을 최소화하면서 높은 친 화성 RNP 단지의 강력한 격리. 전술 한 바와 같이, 이전에 제조 된 비드 - 항체 복합체로 배양 한 다음, 1X 세척 완충액으로 1 : 그리고 이러한 크로스 구배 분획을 적어도 하나의 대안으로서 RNP 소스를 희석. </li><li> 인큐베이션 90 분 후, 비드를 수집하는 자석 IP 선반에 튜브를 놓는다. 흐름을 통해 같은 뜨는를 보유합니다. 참고 :이 첫 번째 흐름을 통해이 IP 효율을 측정하는 중요한 제어 샘플입니다. 면역 분석은 IP 효율의 표시뿐만 아니라, 조사 상호 작용의 특이성을 제공한다. 다운 스트림 분석을 위해이 뜨는을 유지하는 것이 좋습니다. </li><li> 150 mM의 NaCl을, 3 밀리미터의 MgCl 2, 0.5 % NP40, 얼음처럼 차가운 NETN-150 세척 완충액 (20 mM 트리스 - 염산, 산도 7.4의 10 권 (600 μL)와 RNP 바인딩, 항체 - 복합 구슬을 씻고 실온에서 3 분 동안 회전 미만 10 % 글리세롤). 단계 3 번 반복합니다. 참고 :이 버퍼는 용해 버퍼 다르다 효과적으로 약하거나 특정 연결을 줄일 수 있습니다. </li><li> 예약 및 10 %의 최종 세척 후, 빙냉 1X 결합 완충액 (40 mM의 KCl을 3 밀리미터의 MgCl 2, 5 % 글리세롤, 2 mM의 DTT 10 mM의 HEPES, pH를 7.6) 60 μL에 고정화 RNP 복합체를 재현 탁 웨스턴 블롯 및 RNA 분리에 대한 20 %의 고정 된 복잡한 구슬. </li></ol> 4. 용출 <ol><li> 얼음처럼 차가운 1X 결합 완충액 100 μL에 남아있는 볼륨을 조정하고 3 분 동안 70 ° C에서 튜브를 가열한다. </li><li> 동족 RNA 단백질 복합체를 분리하기 위해, 관심의 RNA의 3 &#39;서열 경계 상보 ~ 30 NT의 DNA 올리고 뉴클레오티드를 추가 흔들 부드럽게 실온에서 30 분 동안 배양한다 (올리고 뉴클레오티드 100nM의 충분하다). 참고 : 올리고 뉴클레오티드가 시작 현장 exampl로 사용되는 PCE 구조의를 번역에 인접한 염기 잔류 물에 안티센스입니다이 프로토콜에서 전자. 적절한 서열 상보성은 ~ 40 %의 GC 함량에 의해 제공된다. 표적 RNA의 상보 적 영역에 최소 효과적인 혼성화 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 설계한다. </li><li> 튜브에의 RNase H의 5 ~ 10 단위를 추가하고 RNA의 RNA 절단 할 실온에서 1 시간 동안 품어 : DNA 하이브리드를. 멸균 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송; 이 샘플은 관심의 캡처 RNP 단지를 포함한다. 주 : 동족 RNA의 접근성에 따라,의 RNase H 처리 둘 이상의 라운드 다운 스트림 분석 용 샘플 다량을 증가하는 것이 유용 할 수있다. </li><li> 알려진 관련 단백질 및 RT qPCR에 다음 RNA 분리의 용출액의 20 %에 대한 웨스턴 블롯에 용출액의 20 %를 사용합니다. 나머지 60 %는 질량 분석법에 사용할 수있는 단백질 또는 구성 요소를 식별하기. </li><li> 병렬에서 RNA 분리 및 RT-PCR 분석에 예약 된 세포 용 해물의 분취 량을 대상. 이 ASSEssment는 RNP 단지 내 RNA의 농축의 표시를 제공합니다. 참고 :의 RNase H 절단이 immunuoprecipitated 복잡한에서 RNP 방출에 효과적임을 확인하기 위해 제어 웨스턴 블롯에서 분리 된 단백질 제제를 사용합니다. </li></ol> 5. 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> 실험실 표준 프로토콜에 따라 SDS-PAGE 및 면역 블롯 분석에 총 시료의 약 10 내지 20 %의 제목. 주의 :이 단계는 하류 RNA 분석에 앞서 IP 효율 및 특이성을 검증하는 역할을한다. 또한 격리 된 RNP 복합체 단백질 조성물을 평가할 수있다. </li></ol> 면역 RNA의 6. 컬렉션 참고 : RNA 분리는 설명 프로토콜 다음 트리 졸 방법 또는하여 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 방 t에서 재현 탁 산 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약 750 μL의 전체 시료의 절반 부화5 분 전에 촬영 된 PCE-RNP 단지에서 RNA를 추출에 럼 온. </li><li> 튜브에 클로로포름 200 μl를 추가, 10 초 동안 격렬하게 흔들어, 3 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 16,000 × g으로 원심 분리 후, 새로이 튜브로 수성 상을 수집하고, 이소프로판올 동량을 추가한다. 잘 혼합하고, 적어도 10 분 동안 실온에서 배양한다. 샘플에 글리콜 블루의 1 μl를 추가하고 미래의 날짜에 효율적으로 침전 또는 처리를 위해 냉장고에서 -20 ° C에서 보관합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 조심스럽게 수집하고 RNA 펠렛을 방해하지 않도록 상층 액을 제거한다; p 형 마이크로 피펫 팁 (200)의 사용은이 프로세스를 촉진하기 위해 추천된다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 16,000 XG에서 각 튜브, 소용돌이, 그리고 원심 분리기에 튜브를 75 % 에탄올 500 μl를 추가합니다. 조심스럽게 수집 단계 6.4에서와 같이 상층 액을 버린다. 공기-의 RNase없는 물 100 ㎕에 2 ~ 3 분,에 resuspend의 펠렛을 건조. 주 : 부유 문제를 방지하기 위해 타임 펠릿 공기가 건조 연장하지 않는다. </li><li> RNA를 청소 컬럼에 RNA 샘플의 100 μl를 적용합니다. 제조자의 프로토콜을 사용하여 처리한다. 최대 3 개월 동안 -80 ° C에서의 RNA 분해 효소가없는 물을 저장 30 μL의 RNA를 용출. 참고 :이 고립 된 RNA는 RT-실시간 PCR (qPCR에), 마이크로 어레이 및 RNA 서열에 의해 다운 스트림 분석에 적합합니다. RNP 및 관심 RNP 격리되어있는 효율의 풍부에 따라 동일한 파쇄물은 하류의 분석에 적용 할 충분한 RNA를 생성하는 IP 둘 이상의 라운드를 실시 할 수있다. </li></ol> PCR에 의해 cDNA를 7. RNA 역전사 및 증폭 <ol><li> manufa의 항에있어서, 고품질의 역전사 (RT)와 랜덤 프라이머가 역전사하는 단리 된 RNA 대상cturer의 지시. </li><li> 관심의 RNA를 증폭하는 상기의 RNase H 절단 시퀀스 내에서 특정 유전자의 안티센스 프라이머를 설계한다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 임의의 프라이머 또는 올리고 DT 프라이머 비슷한 금액을 사용 (재료 표 참조). 참고 : 올리고 DT 프라이머 및 폴리 adenylated의 mRNA는 RT-PCR 반응에 대한 긍정적 인 제어 반응을 제공한다. </li><li> 예약 차단을 정의하고, 표준 곡선을 생성하기 위하여 네거티브 컨트롤 용 해물 IP 및 포지티브 컨트롤 DNA 샘플을 직렬로 이루어 예비 qPCR에 대한 RT 반응 (1 μL)를 5 %. qPCR을 위해 준비의 CT 값이 표준 곡선의 범위를 벗어나면, 연속 된 하나의 RT 반응 희석 : 5 희석하고, 단계 7.2를 반복한다. 참고 : RNA 서열 및 질량 분석 기술의 경우, 보충 방법 파일을 참조하십시오. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">t 여기를 클릭하십시오</a>오이 보충 방법 파일을 볼 수 있습니다. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) </li></ol>

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP-Chip:+the+isolation+and+identification+of+mRNAs,+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts.">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li><li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs.">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 RNP 절연 및 RNA 동족 인식 전략은 특정 RNA - 단백질 상호 작용을 조사 및 공동 조절 후보 단백질들을 발굴 셀 특정 RNP를 선택하는 수단이다. RNP들을 분리 올리고 뉴클레오티드 지시 된 RNase H 절단을 사용하는 장점은 캡처 특별히 관심있는 시스 - 작용 RNA 소자에 하류에 결합 된 이종 RNP들 위에 RNP 시스 - 작용 RNA 요소를 분석하는 능력이다. 주어진 RNP의 동족 RNA의 ...

전사 후 유전자 발현 정확하게 핵에있는 DNA의 전사를 시작으로 조절된다. RNA는 단백질 (RBPs)를 결합에 의해 제어, mRNA의 생합성과 대사는 RNA 대사 1-3의 진행 동안 기판 전구체의 mRNA와 해리 동료와 매우 역동적 인 리보 핵산 단백질 입자 (RNP들)에서 발생한다. RNP 구성 요소의 동적 변화는 mRNA의의 전사 후 운명에 영향을 미칠 및 기본 증명서, 핵 인신 매매 및 현지화, 번역 mRNA의 템플릿으로 자신의 활동과 성숙의 mRNA의 최종 매출을 처리하는 동안 품질 보증을 제공합니다. 수많은 단백질은 RNA 인식 모티브 (RRM)를 포함하여 자신의 보존 아미노산 도메인 덕분에 RBPs로 지정되며, 이중 가닥 RNA 결합 도메인 (RBD) 및 염기성 잔기의 스트레치 (예컨대, 아르기닌, 리신, 글리신) 4. RBPs 일상적이다면역 전략에 의해 고립과 동족의 RNA를 식별하기 위해 상영된다. 일부 RBPs는 RNA의 regulons 5-8로 지정 기능적으로 관련되는 사전의 mRNA를 공동 조절한다. 이러한 RBPs 그들의 동족의 mRNA, 때로는 비 - 코딩 RNA는 조성물 다양 RNP들 촉매를 형성하고; 고유성 인해 관련된 요인의 다양한 조합으로뿐만 아니라 상호 작용 (9)의 시간적 순서, 위치 및 지속 기간이다. RNA의 면역 침전 (RIP)는 RNP들에서 세포를 분리 및 서열 분석 (10-13)을 사용하여 관련 증명서를 식별 할 수있는 강력한 기술이다. 후보에서 이동 게놈 넓은하는 검사는 마이크로 어레이 분석 (14) 또는 높은 처리량 시퀀싱 (RNAseq) (15)와 결합 RIP를 통해 가능하다. 그들은 공동 침전 항체 (16)로부터 충분히 풍부하고 분리 가능한 경우에 마찬가지로, 공 침전 단백질, 질량 분석에 의해 식별 될 수 있고,17. 접근 방법은 식물 세포, 진균, 바이러스 및 박테리아의 가용성 용 해물에 대한 변경 가능하지만 여기에서는, 배양 된 세포로부터 RNA의 특정 동족 RNP 성분을 분리하기위한 방법을 다룬다. 그림 1에 요약 된 바와 같이 재료의 다운 스트림 분석, 후보 식별 및 검증 면역에 의해, 질량 분석, 생화학 적 효소 분석, RT-qPCR에, 마이크로 어레이 및 RNAseq을 포함한다. 사후 전사 수준에서 유전자 발현을 제어 RNP들의 기본적인 역할이 주어 성분 RBPs 또는 보조 기능의 발현의 변화는 RNA를 셀에 대한 유해 할 수 있고, 신경계 질환 (18)을 포함한 질환의 여러 유형과 연관된 동족한다. DHX9 / RNA 헬리 A (RHA)는 셀룰러 및 레트로 바이러스의 기원 (6)의 선택의 mRNA의 번역이 필요합니다. 이 동족의 RNA는 내부 구조적으로 관련 시스 - 작용 요소를 나타내는 자신이후 전사 제어 요소 (PCE) (19)로 지정되어 5 &#39;UTR. RHA-PCE 활성은 HIV-1을 포함하는 많은 레트로 바이러스의 효율적인 캡 - 의존적 번역을 위해 필요하며, junD 6,20,21 포함 성장 조절 유전자들의. 필수 유전자 (dhx9)에 의해 암호화, RHA는 세포 증식과 하향 조절에 필수적인 세포 생존 능력 (22)을 제거한다. RHA-RNP들 PCE의 분자 분석 RHA-PCE 활성이 세포 증식을 조절하는 데 필요한 이유 이해하는데 필수적인 단계이다. 정상 상태에서 또는 세포의 생리 학적 섭동시 RHA-PCE의 RNP 구성 요소의 정확한 특성은 다운 스트림 분석을위한 충분한 풍요의 RHA-PCE의 RNP들의 선택적인 농축 캡처가 필요합니다. 여기에, 레트로 바이러스 PCEgag RNA는 오픈 리딩 프레임 내에서 MS2 코트 단백질 (CP)의 시스 - 작용하는 RNA 결합 부위의 6 사본 태그되었습니다. MS2 코트 단백질 엑소시켰다genously 공동 발현 플라스미드로 형질 감염 RNA PCEgag으로 성장 세포에서 RNP 어셈블리를 용이하게한다. 동족 MS2 태깅 PCEgag RNA와 MS2 코트 단백질을 포함 RNP들에는 세포 추출물로부터 면역 침전 및 자성 비드 (도 2a)에 포획 하였다. 선택적 PCE에 결합 된 RNP 성분을 캡처하기 위해, 고정화는 RNP의 RNase H 활성 용 기판 인 RNA-DNA 하이브리드를 형성 PCE에 말단 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드와 함께 배양 하였다. PCE가 번역 영역, 5 &#39;말단의 5&#39;에 위치되기 때문에, 올리고 뉴클레오티드는 레트로 바이러스 번역 개시 사이트 (개그 개시 코돈)에 인접하는 RNA 서열에 상보 적이다. 용리액으로 수집 된 고정화 RNP에서 발표 된 5 &#39;UTR 단지 코돈 개그 시작 근처의 RNase H 절단. 그 후, 샘플은 captu을 확인 PCEgag 및 SDS PAGE 및 면역 블롯에 의해 캡처 확인 RT-PCR에 의해 평가 하였다대상 MS2 코트 단백질의 재. PCE 관련된 RNA 결합 단백질의 검증 DHX9 / RNA 헬리 케이즈 A는 다음을 수행 하였다.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibody</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibody</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RHA antibody</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reagent</td><td>Life technology</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy clean-up column</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript reverse transcriptase</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primers</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT primers</td><td>Invitrogen</td><td>AM5730G</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>Gene specific primers for&amp;nbsp; PCR amplification</td></tr><tr><td>Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage</td><td>IDT</td><td></td><td>Anti-sense primer for target RNA</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco Life technology</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM tissue culture medium</td><td>Gibco Life technology</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco Life technology</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td></td><td></td><td>1.7 ml micro-centrifuge tube holding</td></tr><tr><td>Laminar hood</td><td></td><td></td><td>For animal tissue culture</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td>For animal tissue culture</td></tr><tr><td>Protein gel apparatus</td><td></td><td></td><td>Protein sample separation</td></tr><tr><td>Protein transfer apparatus</td><td></td><td></td><td>Protein sample transfer</td></tr><tr><td>Ready to use protein gels (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Protein sample separation</td></tr><tr><td>Table top centrifuge</td><td></td><td></td><td>Pellet down the sample</td></tr><tr><td>Table top rotator</td><td></td><td></td><td>Mix the sample end to end</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Mix the samples</td></tr></tbody></table>

isolation of cognate rna-protein complexes from cells using oligonucleotide-directed elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

이전 RIP 결과 레트로 바이러스 개그 RNA를 식별하고 공동 침전물 세포의 RNA를 DHX9 / RHA와, HIV-1 6, junD 6과 훌 (프리츠와 보리스 - 로리, 게시되지 않은) 포함을 선택했습니다. 레트로 바이러스 5 &#39;UTR이 핵 DHX9 / RHA와 공동 침전 및 polyribosomes의 세포질에서 공동으로 분리하는 것으로 입증되었다. 이것은 고유 시스 -acting 전사 후 제어 요소 (PCE) (6)으로...

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.9K 조회수.  University of Minnesota. This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A. 

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

연구

유전학

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

생화학

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

단일 단계 정화 RNA Biotin 및 사진 쪼갤 링커를 사용 하 여 고분자 복합물의

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional regulation1. Therefore, an essential step towards understanding transcript regulation at the molecular level is to gain positional information on the binding sites of RBPs2.
Protein-RNA interactions can be studied using biochemical methods, but these approaches do not address RNA binding in its native cellular context. Initial attempts to study protein-RNA complexes in their cellular environment employed affinity purification or immunoprecipitation combined with differential display or microarray analysis (RIP-CHIP)3-5. These approaches were prone to identifying indirect or non-physiological interactions6. In order to increase the specificity and positional resolution, a strategy referred to as CLIP (UV cross-linking and immunoprecipitation) was introduced7,8. CLIP combines UV cross-linking of proteins and RNA molecules with rigorous purification schemes including denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. In combination with high-throughput sequencing technologies, CLIP has proven as a powerful tool to study protein-RNA interactions on a genome-wide scale (referred to as HITS-CLIP or CLIP-seq)9,10. Recently, PAR-CLIP was introduced that uses photoreactive ribonucleoside analogs for cross-linking11,12.
Despite the high specificity of the obtained data, CLIP experiments often generate cDNA libraries of limited sequence complexity. This is partly due to the restricted amount of co-purified RNA and the two inefficient RNA ligation reactions required for library preparation. In addition, primer extension assays indicated that many cDNAs truncate prematurely at the crosslinked nucleotide13. Such truncated cDNAs are lost during the standard CLIP library preparation protocol. We recently developed iCLIP (individual-nucleotide resolution CLIP), which captures the truncated cDNAs by replacing one of the inefficient intermolecular RNA ligation steps with a more efficient intramolecular cDNA circularization (Figure 1)14. Importantly, sequencing the truncated cDNAs provides insights into the position of the cross-link site at nucleotide resolution. We successfully applied iCLIP to study hnRNP C particle organization on a genome-wide scale and assess its role in splicing regulation14.

The spatial arrangement of RNA-binding proteins on a transcript is a key determinant of post-transcriptional regulation. Therefore, we developed individual-nucleotide resolution UV crosslinking and immunoprecipitation (iCLIP) that allows precise genome-wide mapping of the binding sites of an RNA-binding protein.

iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

생물학

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded cellular environment. Ribosomes provide the platform for spatially and kinetically controlled binding of membrane-targeting factors, modifying enzymes, and folding chaperones. Even the assembly into high-order oligomeric complexes, as well as protein-protein network formation steps, were recently discovered to be coordinated with synthesis.
Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method developed to capture co-translational interactions in vivo. We will detail the various affinity purification steps required for capturing ribosome-nascent-chain complexes together with co-translational interactors, as well as the mRNA extraction, size exclusion, reverse transcription, deep-sequencing, and big-data analysis steps, required to decipher co-translational interactions in near-codon resolution.

Co-translational interactions play a crucial role in nascent-chain modifications, targeting, folding, and assembly pathways. Here, we describe Selective Ribosome Profiling, a method for in vivo, direct analysis of these interactions in the model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

SELEX-Based In Vitro Binding Assay to Identify RNA-Protein Interactions

Source: Singh, R. <a href="https://app.jove.com/v/59635">Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins.</a> J. Vis. Exp. ( (2019).
In this video, we describe the systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (SELEX) method to identify specific RNA-binding sequences for a target protein of interest. The protein is incubated with a large pool of randomized RNA sequences, and the protein-binding RNA sequences are isolated, PCR-amplified, and sequenced to identify their protein-binding sites.