이 메서드는 필드의 일반적인 문제를 해결하고 관심있는 특정 마커를 사용하여 단일 세포 외 소포의 신속한 격리 및 특성화를위한 완벽한 워크플로우를 제공합니다. 나노입자 추적 분석은 반자동 방법입니다. 그것은 세포 외 소포의 크기 분포를 분석하기 위해 광 산란 및 브라운 운동의 특성을 활용합니다.
절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 박사 과정 학생 베라 슈미트입니다. 세포 외 소포를 분리하려면 인간 전체 혈액의 2 밀리리터 샘플을 혈청 분리 튜브로 수집 한 후 샘플을 실온에서 15 분 동안 응고한 후 혈청에서 세포를 원심 분리에 의해 분리할 수 있습니다. 각 시료에서 혈청 1밀리리터를 개별 1.5 밀리리터 반응 튜브로 옮겨 혈소판을 제거하고 혈소판 이불난 혈장 100마이크로리터를 새로운 1.5 밀리리터 반응 튜브로 이송한다.
다음으로, 플라즈마에 외성 강수액25 마이크로리터를 추가하고 샘플을 철저히 소용돌이시다. 얼음에 30 분 잠복 후, 원심 분리에 의해 세포 외 소포를 수집합니다. 펠릿은 베이지색 또는 흰색으로 나타납니다.
초퍼를 흡인하고 원심분리시 샘플을 다시 분리합니다. 그런 다음, 액체의 모든 트랜스를 제거하고 PBS의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 소포의 세포막을 염색하려면 EV 서스펜션 10마이크로리터를 새로 준비한 PKH67 에탄올릭 염료 용액 50마이크로리터에 추가하고 철저히 혼합합니다.
어둠 속에서 실온에서 5 분 후, 철저한 혼합과 함께 15 밀리리터 원추형 튜브에 증류수 2.5 밀리리터와 스테인드 세포 외 소포 현탁액의 50 마이크로 리터를 희석. 항체로 소포를 라벨을 붙이려면 1.5 밀리리터 반응 튜브에 증류수 50 마이크로리터로 스테인드 외세포 소포 현탁액의 10~20 마이크로리터를 철저히 혼합하여 희석시키십시오. 반응 튜브에 관심 있는 항체의 2.5~5마이크로리터를 철저히 혼합하여 어둠 속에서 실온에서 30분 간 배양을 합니다.
이어서, 표에 표시된 바와 같이, 라벨이 부착된 소포50마이크로리터를 증류수의 적절한 실험량을 포함하는 15밀리리터 원내 튜브로 이송한다. 염색되거나 표지된 세포외 소포를 분석하기 전에 먼저 형광 필터를 현미경 및 카메라의 광학 경로로 이동하고 자동 구현을 위한 화면의 지침에 따라 프로그램을 시작합니다. Cell Check 탭에서, 레이저 및 현미경이 일반적인 초점에 있는지 확인하기 위하여, 광학에 대한 형광 측정 및 기준 위치를 위한 정확한 세포 번호를 선택합니다.
주사기를 사용하여 증류수 10밀리리터로 셀 채널을 플러시하고 측정 셀이 기포가 없고 기포가 시스템에 주입되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 증류수 990마이크로리터에 200나노미터 크기의 형광 라벨폴리스티렌 입자 10마이크로리터를 희석하고 증류수 10밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 이 입자 현탁액의 마이크로리터 10개를 첨가합니다. 그런 다음 첫 번째 희석 된 입자 용액의 2.5 밀리리터를 셀 채널에 주입하고 최적화 포커스를 클릭하여 카메라를 조정합니다.
샘플을 측정하려면 증류수 10밀리리터로 셀 채널을 여러 번 플러시하고 스테인드 세포 외 소포 현탁액을 주입합니다. 참조 위치를 사용하여 테이블에 표시된 대로 셀 검사 탭 아래에 적절한 획득 매개 변수를 조정합니다. 최적의 감도 범위를 식별하려면 파티클 수 와 파티클 수를 클릭합니다.
감도, 다른 감도 수준에 대한 화면당 측정된 입자의 곡선을 표시합니다. 셔터 매개 변수의 경우 카메라가 지정된 간격으로 빛이 통과할 수 있는 기간을 조정합니다. 인수 후 매개 변수의 경우 최소 밝기 20, 최소 크기 20 나노미터 및 최대 측정 크기 500 나노미터를 선택합니다.
디스플레이 시야에서 감지된 파티클 수를 확인합니다. 산란 막대는 녹색에서 주황색, 50~300개의 입자 범위여야 합니다. 0 볼트에서 파티클 드리프트 를 확인하고 측정 탭을 엽니다.
비디오 수집 실행을 클릭하고 실험 횟수를 3~5분으로 설정하고 실험 간 시간 지연을 0분으로 설정합니다. 개별 하위 볼륨 위치 수를 11개로 설정하고 입자를 분석할 각 측정 위치에서 측정 주기 수를 10개로 설정합니다. 그런 다음 폴더를 선택하고 새 파일 이름을 만들고 Okay를 클릭하여 측정을 시작합니다.
분석이 끝나면 분석 탭을 열어 결과를 검토합니다. 그런 다음, 위치당 입자의 평균 수, 추적된 입자의 총 수 및 입자 농도, 입자의 분포 폭 및 평균값 및 표준 편차를 확인한다. 측정의 조정 및 보정을 위해 형광 구슬을 사용하여 이러한 설정을 사용하여 85 %의 최적의 설정 감도를 제공하므로 카메라는 날카로운 그림을 표시하고 반복 된 측정은 낮은 표준 편차를 보여줍니다.
긴, 알리팔성 꼬리를 가진 녹색 형광염염을 세포막의 지질 부위에 통합하는 형광 세포 링커를 포함하는 세포 링커 키트로 염색하면, 측정된 입자의 감도와 수 사이의 강한 상관 관계를 드러낸다. 관심 있는 단백질에 대하여 세포외 소포 염색 항체는 541 나노미터의 피크 최대 크기로 220 에서 1, 145 나노미터에서 입자 분포를 나타냅니다. 외세포 소포는 대조군 소포없는 물의 항체 염색 후 검출되지 않으며, 최대 100 %에 가까운 감도가 드리프트가 초당 5 마이크로미터 를 초과할 때 측정이 시작되면 개별 반복은 뚜렷한 편차를 보여줍니다.
형광으로 형광이소로 이소티오네이트를 사용하면 이 형광이 급속한 광표백에 걸리기 쉽기 때문에 부정확하고 재현할 수 없는 측정이 발생한다는 점에 유의해야 합니다. 이 프로토콜은 특정 마커를 사용하여 단일 세포 외 소포의 빠른 특성화를 위해이 분야에서 많은 연구자의 선도적 인 요구를 해결합니다. 사실에도 불구 하 고, 지난 10 년 동안, 방법은 상당히 개선, 아직 단일 세포 외 소포의 분석을 위한 표준화 된 프로토콜.
세포 외 소포 생물학에 대한 연구의 향후 진행에 관계없이,이 방법은 특정 마커를 사용하여 단일 세포 외 소포의 특성화를위한 신속하고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 현재 프로토콜에는 긴 처리 시간 이나 노동 집약적인 단계가 포함되지 않으므로 높은 샘플 처리량에도 적합합니다.
