NTA 결과는 작업자 편향에 매우 취약합니다. 이 프로토콜은 변경된 NTA 매개 변수가 얻은 결과에 미치는 영향을 보여줍니다. 표준화된 방법은 NTA 분석에서 엄격성과 재현성을 높이는 데 도움이 됩니다.
큐벳에서 샘플을 분석하면 각 비디오에서 통계적으로 임의의 샘플을 캡처할 수 있습니다. 이로 인해 다양한 크기에 걸쳐 더 재현 가능한 데이터와 파티클의 시각화가 생성됩니다. 권장 입자 농도 범위에서 샘플을 얻는 것이 어려울 수 있기 때문에 이상적인 희석 계수를 식별하기 위해 직렬 희석을 수행해야합니다.
절차를 시연하는 것은 앤서니 페란테의 실험실에서 박사 과정 학생인 쿤응 카이(Kungheng Cai)가 될 것입니다. 나노 입자 추적 분석을 위한 큐벳을 준비하려면 작업 공간을 보풀이 없는 재료로 덮어 섬유가 큐벳에 유입되는 것을 방지합니다. 장갑을 끼고, 교반 바가 들어 있는 큐벳을 마그네틱 큐벳 지그 위에 놓습니다.
후크 도구를 사용하여 큐벳 의 전면에 인서트 노치가 보이는 큐벳에 삽입을 넣습니다. 파이펫을 사용하여 400~500마이크로리터의 정제된 세포외 소포를 삽입구멍을 통해 큐벳에 천천히 추가하고 기포를 도입하지 않고 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 혼합한 다음, 큐벳을 캡하고 필요에 따라 거품을 두드리고 보풀이 없는 천을 사용하여 큐벳의 외부 표면을 닦아냅니다. 희석제 또는 샘플의 입자 농도를 분석하려면 컴퓨터 워크스테이션과 계측기를 켜고 입자 추적 분석 프로그램을 시작합니다.
메시지가 표시되면 NTA를 클릭하고 레코딩 탭을 엽니다. 화면 의 지침을 따라 필요한 모든 샘플 정보를 작성합니다. EV 추적 분석을 위해 희석제를 PBS로 설정합니다.
살리닌성은 희석제 또는 시료 입자 농도를 얻기 위해 9%로 자동 채웁니다, 기기 뚜껑을 열고 큐벳이 배치될 곳에 보호 캡 덮개를 제거합니다. 큐벳을 올바른 방향으로 기기에 카메라를 향한 인서드의 노치로 로드하고 캡과 악기 뚜껑을 교체합니다. 스트리밍 화살표를 클릭하여 카메라를 켜고 쉐브론 화살표를 클릭하여 레코드 설정을 확장합니다.
상대적으로 작은 입자가 명확하게 표시될 때까지 초점을 조정합니다. 작은 EV 정량화에 대한 분석을 설정하려면 프레임 속도를 초당 30 프레임으로 설정하고, 노출 시간을 15밀리초로 설정하고, 교반 시간을 5초로, 대기 시간3초, 파란색, 녹색 및 빨간색 레이저 파워를 각각 210, 12 및 8밀리와트로 설정하고, 비디오당 프레임을 300으로 설정하고, 30데시벨이 되는 데 게인합니다. 상대적으로 작은 입자가 명확하게 표시될 때까지 초점을 조정합니다.
줌 및/또는 게인을 늘리면 파티클 초점에 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이득을 늘리면 녹음 하기 전에 30 데시벨로 설정해야 합니다. 파티클이 포커스가 되면 확대/축소 설정을 0.5배로 설정하여 대역폭을 절약하고 손실 프레임및 클릭 레코드를 방지하여 비디오 녹화를 시작합니다.
동영상이 녹화되었음을 알리는 프롬프트가 나타나면 확인을 클릭하여 녹화를 완료하고 프로세스 탭을 선택합니다. 녹화 하는 동안 모든 비디오에 매우 큰 파티클을 표시 하는 경우, 녹화 된 비디오의 디렉토리로 이동 하 고 처리 하기 전에 문제가 비디오를 제거 합니다. 비활성화된 오디오 감지 재정의 상자를 확인하고 피쳐 직경을 30으로 설정합니다.
프로세스를 클릭하여 비디오 처리를 시작하고 라이브 배포 그래프를 봅니다. 처리가 완료되면 확인을 클릭하고 플롯 탭을 선택합니다. EV의 경우 주 차트를 로그 빈 실리카로 표시합니다.
생성된 그림의 통합 영역을 설정하기 위해 x축을 변경하는 것과 같은 그래프의 다른 피쳐를 사용자 지정할 수 있습니다. 결과에 대한 PDF 보고서를 만들려면 보고서 단추를 클릭합니다. 희석 계수 및 분포 폭에 맞게 조정된 평균, 중앙값, 모드 크기 및 농도가 표시됩니다.
희석제의 NTA는 이 블랭크의 농도가 EV 샘플 입자 농도로부터 빼질 수 있도록 임의의 시료 전에 수행해야 한다. 분석 후 큐벳을 청소하려면 큐벳을 비우고 큐벳을 10~15회 디온화된 물로 완전히 채우고 잔류 시료를 제거하기 위해 70~100%의 에탄올로 3회 를 채웁니다. 보풀이 없는 마이크로 화이버 천으로 큐벳의 바깥쪽을 말리고 압축 공기 더스터로 내부를 건조시다.
인서트를 청소하고 바를 저어주려면 70~100%에탄올이 들어있는 유리 신경병 유리병에 재료를 넣고 유리병을 힘차게 흔들어 줍니다. 그런 다음 인서트를 헹구고 바에 탈이온화된 물에 몸을 흔들어 보풀이 없는 천으로 말리십시오. 건조 후, 즉시 다음 분석까지 모든 깨끗한 구성 요소를 저장에 배치합니다.
분석을 수행하기 전에, 계측기 교정은 획득 된 데이터의 유효성을 보장하기 위해 폴리스티렌 구슬을 사용하여 테스트되었습니다. 관찰된 바와 같이, 입자 추적 기기는 100나노미터 의 마노분산 구슬의 크기를 정확하게 보고했지만, 400나노미터 구슬의 크기만 면밀히 보고하였다. 따라서 이 프로토콜의 계측기 설정은 크기가 100나노미터에 가까운 작은 입자에 대해 더 정확했습니다.
이러한 설정을 사용하여, 보고된 입자 농도 는 기술 복제자 간의 가변성이 거의 없는 다양한 희석제에서 입자 농도를 정확하게 검출할 수 있음을 입증하는 희석 계수와 함께 비늘 농도 를 배율화합니다. 밀리리터 마우스 조직 유래 EV 샘플당 10번째 입자에 대한 4.41배 10분의 10에 대한 최적 희석은 1, 000 및 3, 000 사이로 결정되었다. 이 분석에서 게인을 증가시켜 카메라의 감도가 높아져 더 많은 수의 더 작은 입자의 시각화가 증가합니다.
녹색 및 빨간색 레이저 전원을 유지하면서 파란색 레이저 전력을 70에서 210 밀리와트로 증가시켜 보고된 평균 입자 크기를 122에서 105나노미터로 이동하고 보고된 총 입자 농도를 1.1배에서 8배 1.7배로 10배 로 증가시켰습니다. 적색 레이저의 전력을 증가시켜 보고된 평균 입자 크기가 175에서 246나노미터로 증가하고 보고된 총 입자 농도가 감소하였다. 녹색 레이저 전력을 증가시켜 보고된 평균 입자 크기가 감소하고 보고된 총 입자 농도가 증가했습니다.
최적의 검출 범위 내에 샘플을 배치할 적절한 희석을 찾는 것은 각 샘플에 대해 몇 번의 시도를 할 수 있습니다. 큐벳 청소에는 세심한 취급이 필요합니다. EV 입자 크기 및 농도 측정을 위해 둘 이상의 직교 방법을 적용하는 것이 좋습니다.
다이나믹 광 산란, 저항 펄스 감지, 투과 전자 현미경 및 단일 입자 간섭 반사도 이미징 감지도 전기를 특성화하기 위해 수행될 수 있습니다.
