1 표준 작동 프로토콜 1.1 장비 설정 및 샘플 준비 <ol><li> 설치 Izon 컨트롤 스위트 소프트웨어 악기를 컴퓨터에 연결합니다. </li><li> - 또는 NP200 (대상 크기 범위 100-400 nm의) 가장 자주 사용되는 NP150 (300 nm의 대상 크기 범위 85)는 전기 자동차의 크기와 농도 측정 : 사용하는 나노 기공의 크기를 선택합니다. 220 nm의 필터를 통해 샘플을 전달하여 예를 들어 큰 전기차의 제거를 포함하는 프로토콜을 이용하여 분리 한 전기차로 작업 할 때, NP100 기공 (목표 크기 범위 70-200 나노 미터)가 사용될 수있다. 생체 시료에서 전기차 또는 다른 프로토콜을 사용하여 절연 전기차 작업하는 경우가 종종 덜 막히게되므로, NP200을 사용할 수있다. 또는 NP400 (목표 크기 범위 200-800 나노 미터) - 등 NP300G의 (600 nm의 목표 크기 범위 (150))와 같은 다른 나노 기공, 또는 더 큰 나노 기공이 큰 전기차의 종류에 사용될 수있다. </li><li> 폴리스티렌 캘리 브레이션을 선택1.1.2 단계에서 선택한 나노 기공을 보완 ation 입자. NP100를 들어, NP150와 NP200의 나노 기공은 각각 CPC100, CP100 및 CPC200 입자를 사용합니다. 정확한 크기의 추정을 위해, 캘리브레이션 입자 알려지지 입자와 유사한 크기를 갖도록. </li><li> 교정 입자의 균일 성, 소용돌이 짧게 (30 초)을 확인하십시오. 선택적으로, 집계를 제거하기 위해 초음파를 적용합니다. </li><li> 적어도 40 μL의 부피 목표 농도로 PBS에 교정 입자를 희석. 참고 : 목표 농도는 단계 1.1.2에서 선택한 나노 기공에 따라 달라집니다. 목표 농도는 나노 기공 함께 제공됩니다. </li><li> 적용하고 직접 낮은 유체 셀 PBS의 78 μl를 제거; 나노 기공이 위치에있을 때, 상기 하부 유체 셀에 전해질을 도포 할 때 하부 유체 셀이 습윤은 나노 기공 하에서 기포 형성의 위험을 감소시킨다. </li><li> 악기의 네 팔에 나노 기공을 놓습니다. 사용디지털 캘리퍼스이 반대 팔 사이의 거리를 측정하고 &quot;스트레치&quot;입력 필드에 mm의 거리를 입력하고 나노 기공 스트레칭 교정하는 &quot;스트레치를 교정&quot;을 클릭합니다. </li><li> 하부 액체 셀에 78 μl의 PBS를 다시 적용하기 전에, 기기의 대향 아암들 사이의 거리가 증가하므로 사이드 휠을 켜서, 47mm로 나노 기공을 스트레칭. 주 : 전기 간섭이 실질적으로 측정의 품질에 영향을 미칠 수있다. Izon 제어 Suite 소프트웨어를 실행하는 노트북을 사용하는 경우, 노트북이 접지 된 소켓과 플러그를 사용 전력망에 연결되어 있는지 확인합니다. 휴대 전화는 전기 간섭의 원인이 될 수있는 근접 악기로 유지했다. 전기 간섭은 종종 루트로 광장 (RMS) 노이즈&gt; 10 pA의 의미, 기준 전류가 지속적으로 반복 피크로 관찰된다. 참고 : 거의 모든 버퍼의 TRPS characteri 대한 교정 입자 및 전기차를 희석하는데 사용될 수있다아네트. 염의 존재는 전류의 확립을위한 필수 조건이다. EV 측정을위한 버퍼로 PBS를 사용합니다. 전기차가 정확한 측정을 보장하기 위해 교정 입자는 항상 동일한 완충액으로 희석한다. </li></ol> 1.2. 측정을위한 최적의 설정을 결정 주 : 촬영 전에, 최적의 측정 설정을 설정하는 것이 중요하다. 나노 기공을 통과하는 입자에 의한 봉쇄의 크기는 적용 스트레칭 및인가 전압에 의존한다. 신뢰할 수있는 측정을 위해 RMS 잡음이 있어야합니다 0.1 nA의 &lt;10 PA 및 모드 봉쇄 크기는되어야한다&gt;. <ol><li> 나노 기공에 상부 유체 세포와 차폐 케이지를 놓고 상부 유체 셀에 희석 교정 입자의 40 μl를 소개합니다. ≥0.8 kPa의 긍정적 인 압력을 적용 할 VPM을 사용합니다. </li><li> 교정에 의한 봉쇄 이벤트를 분석하는 동안 44mm쪽으로 천천히 적용 스트레칭 감소입자. 나노 기공을 통해 공경보기 입자의 이동을 감소시키는 경우가 거의 없을 것이며, 따라서, 입자 속도는 감소한다 참고. 그러나, 공극이 증가 상대적인 봉쇄 큰 봉쇄 이벤트 향상된 신호대 잡음비로 인한 발생한다. 전압을 증가 시키면 더 봉쇄의 크기를 증가시킬 수 있습니다뿐만 아니라 RMS 노이즈를 증가시킬 수있다. </li><li> 적절한 봉쇄 이벤트 (그림 1C)는 &quot;신호 추적&quot;패널에서 관찰 될 때까지 스트레칭을 줄일 수 있습니다. (모드&gt; 0.1 nA의)와 해당 입자의 속도는&gt; 100 / 분이다. 주 : 입자 속도는 적어도 500의 입자 측정이 이상적으로하지만, 덜 엄격한 컷오프이며, &lt;100 / 분의 입자의 비율은 적어도 5 분의 지속 시간을 기록하게됩니다. (샘플 희석 수행해야있는 경우) 2000 / 분보다 더 높은 입자 속도는 덜 정확한 측정 될 수 있습니다. </li></ol> 교정의 1.3 측정입자, Uper 유체 셀 및 샘플 측정의 세척 <ol><li> 다형성 아교 모세포종 세포주 U87-MG / EGFRvIII의 세포 배양 상층 액에서이 섹션의 전기 자동차에서 특징입니다. 이러한 전기 자동차의 분리 및 준비는 이전에 기술과 18을 가시화하고있다. </li><li> 상부 유체 셀의 교정 입자를 놓습니다. (예 : 0.8 kPa의에 대한) 압력 VPM 기록&gt; (500) 입자를 사용하여 적용합니다. </li><li> 다중 압력 측정을 수행하는 경우, (1.0 kPa의 행 예)인가 압력을 증가시키고 제 캘리브레이션 파일을 기록한다. 참고 : 0.2 kPa의 차이의 최소 필요합니다. </li><li> 상부 유체 셀로부터 교정 샘플을 제거합니다. 잔류 입자를 제거하기 위해 상부 유체 세포 100 ㎕의 PBS로 3 회 세척 할 것. 상부 유체 셀에 시료를 도입하기 전에 상부 유체 셀로부터 잔여 PBS를 제거하려면 보풀이없는 조직을 사용합니다. </li><li> 상부 유체 셀에 샘플을 소개. 기준 전류가 교정 입자를 측정 할 때 관찰 된 기준 전류의 3 % 이내인지 확인. 3 % 이내하지 않으면, 기준 전류를 안정화 후술 전략을 적용한다. 교정 입자에 적용되는 정확한 압력을 적용하고 샘플 파일을 기록합니다. 참고 : 입자의 속도 그래프는 일정한 입자 검출 (그림 2a)를 표시해야합니다. 입자 검출, 기준 전류의 급격한 저하, 또는 RMS 잡음 급증 갑자기 중단 된 경우에는, 기공이 막히게 될 수있다; 이에 따라, 촬영을 일시 정지. 베이스 라인, 탭을 복원하거나 차폐 캡을 비틀, 플런저를 적용하거나 완전히 나노 기공을 제거하고 탈 이온수로 씻어 그리고 장비를 교체하기 위해. 참고 : 다른 방법으로, 약 5 분 동안 VPM에서 최대 압력과 함께 47mm에 나노 기공 스트레칭을 증가시킨다. </li></ol> 1.4 데이터 분석 <ol><li> 클릭 &quot;, 소프트웨어의 분석 부분을 입력 데이터 &quot;탭을 분석합니다. &quot;처리되지 않은 파일&quot;을 선택 &quot;프로세스 파일&quot;을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 교정 및 예제 파일을 처리합니다. </li><li> 교정 기록에 부부에 &quot;보정&quot;열에서 샘플 옆에있는 샘플 파일을 체크 박스를 클릭합니다. 해당 샘플 및 교정 파일을 선택하고 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 참고 : 다중 압력 보정 옵션은 여러 교정 파일에 몇 여러 샘플 왼쪽에있는 &quot;멀티 압력 보정&quot;탭을 선택 사용하는 경우. </li><li> 일단 성공적으로 결합 Izon 제어 Suite 소프트웨어는 크기 분포 등 다양한 시료의 특징에게 (그림 2B)를 표시합니다, 기준 기간, 전체 폭의 절반 최대 (FWHM) 및 농도 분석. 선택적 : 쉼표로 구분 된 파일로 각 샘플의 경우, 각각의 데이터 포인트는 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 2lternative 프로토콜 - 교정 비즈 샘플을 못을 박는 주 : 절연 전기차로 작업 할 때 일반적으로, 표준 운영 절차가 사용될 수있다. 생물학적 샘플, 또는 대형 단백질 집합체로 오염 된 절연 EV 준비 비 절연 전기 자동차, 작업 할 때 장비를 운영하는 것은 문제가 될 수 있습니다. 이 문제는 주로 나노 기공 차단 (기준 전류의 급격한 하락), 교정 측정하거나 동일한 샘플 (그림 3a) 사이의 입자 속도에서 큰 차이의 3 % 내에서 기준 전류를 복구 할 수없는 높은 비율로 구성되어 있습니다. 전기 자동차를 정량화하기 위해 이러한 어려움에게 다른 프로토콜을 표시하는 샘플은 17를 개발 하였다. 이 방법론은이자 (그림 3b)의 샘플에 큰 폴리스티렌 교정 구슬의 도입에 의존한다. 이 대안 프로토콜에 대한 자세한 절차는 아래에 설명되어 있습니다. 2.1. 샘플준비 주 : 대안적인 방법을 사용하여 시료를 제조 할 때, 주위도 1의 EV-대 - 비드 비율을 설정하는 것이 바람직하다, 그것의 정확한 &#39;게이팅&#39;있도록 샘플 &#39;만 교정 비드&#39;를 포함하는 것이 필수적이다 교정 구슬 및 버퍼에 존재 (예를 들어 단백질 응집체의 경우) 배경 입자의 수​​를 결정한다. <ol><li> 300 XG에 7 분 동안 세포 배양 상층 액의 원심 분리기 100 μL </li><li> PBS의 20 μl의 75 배의 10 μL에 상층 액의 20 μl를 추가는 335 nm의 폴리스티렌 비즈 (주식 7e10 / ㎖)로 희석. </li></ol> 2.2. 샘플 측정 <ol><li> 최적의 장비 설정을 결정하기 위해 1.2 절에서 설명하는 전략을 사용합니다. </li><li> 샘플 첫번째 &#39;만 교정 구슬&#39;을 측정한다. 작은 비 - 비드 입자의 배경에 검출 가능한 낮은 지 확인 (&lt;비드 10 %). </li><li> 각 개별 사를 측정mple 한번 기록 동등하게 다른 시료 위에 나노 기공 조건에서의 변동을 분산하기 위해 복제 전에. 각 샘플의 적어도 3 회 반복 측정한다. </li><li> 모든 샘플의 기록을 마친 후 &#39;교정 비드만을&#39;샘플을 재 측정. </li></ol> 2.3. 데이터 분석 주의 : 다른 프로토콜을 사용하는 경우, 제어 Izon 스위트 소프트웨어가 전용 농도 계산을 위해 충분하지 않는다. 추가 스프레드 시트 소프트웨어가 필요하다. 표 1은도 3에 도시 된 샘플의 농도를 계산하는 예를 나타낸다. <ol><li> &#39;교정 구슬만을&#39;샘플 및 하나 이상의 샘플 파일을 엽니 다. </li><li> 전기 자동차 및 폴리스티렌 구슬 사이의 구별에 대한 컷 - 오프로 사용할 수 (NA)에있는 봉쇄 이벤트의 크기를 결정합니다. 폴리스티렌 비즈 인구의 좌측베이스에 대응 봉쇄 값 수 (NA) (결정 <st룽&gt; 그림 3B). 참고 : 모든 측정의 bin-크기의 동일한 설정을 확인합니다 ( &quot;개인 봉쇄 추적&quot;아래에 &quot;팝업&quot;버튼을 클릭하여 액세스 할 수 있습니다 &#39;ViewSettings&#39;로 조절할 수 있습니다.) </li><li> 샘플의 &quot;입자 분석 요약&quot;탭을 클릭하여 각 샘플에 대한 총 입자 수의 값을 검색합니다. </li><li> 단계 2.3.2에서 결정된 컷오프 레벨을 이용하여 상기 데이터 세트를 필터링. &quot;데이터 필터링&quot;팝업을 선택하여. 디스플레이는 단지 컷오프보다 작은 입자. </li><li> &quot;입자 분석 요약&quot;에서 각 샘플에 대한 EV 수의 값을 검색합니다. </li><li> 교정 비드의 양을 결정하기 위해 전체 입자에서 전기차의 양을 뺀다. </li><li> 교정 구슬 수에 의해 EV 수를 나눈 EV - 투 - 비드 비율을 결정합니다. </li><li> 및 각각에 대해 결정된 비율을 평균화함으로써 평균 백그라운드 비율을 결정# 8220; 만 &quot;교정 샘플을 구슬. 각각의 샘플에서이 값을 뺍니다. </li><li> 각 샘플에 대한 전기차의 농도를 결정하기 위해 교정 구슬의 농도에 의해 조절 된 EV-대 - 비드 비율을 곱한다. </li><li> EV 샘플로 보정 구슬의 첨가에 의해 도입 EV 희석 인자에 의해 단계 2.3.9에서 발견 된 농도를 곱한다. 참고 예 시료 설정에서 PBS 및 교정 구슬 시료의 전체의 2.​​5 배 희석하고, 따라서 단계 2.3.9에서 발견 농도 것의 EV 샘플 농도를 결정하기 위해 2.5 곱해야하다. </li><li> 예컨대 평균, 표준 편차 및 복제물의 각 그룹에 대한 평균의 표준 오차로서 통계를 계산한다. 주 : 어떤 경우에 관찰되는 전기 자동차 및 아군 폴리스티렌 구슬 사이에 겹칩니다. EV 농도의 과소 평가에 대한 보정이 필요한 경우, 아군 폴리스티렌 비드가없는 샘플은 또한 측정되어야한다. 같은 컷 -을 사용하여&quot;비드 투 EV&quot;비율을 결정하는 단계에서 결정된 바와 같이 2.3.2 떨어져 아군 폴리스티렌 비드의 범위 내에 전기차의 비율을 산출한다. 이 비드 대 비율은 EV 단계 2.3.8에서 결정된 EV-대 - 비드 비율로 첨가한다. </li></ol> 2.4. 옵션 : 다른 방법을 사용하여 EV 크기 분포. <ol><li> 컨트롤 스위트 소프트웨어에 두 번 샘플 녹음을 엽니 다. </li><li> 상기 결정된 컷오프보다 더 큰 경우에만 표시 입자 샘플 중 하나의 필터 옵션을 설정한다. 이 교정 입자 만 표시됩니다. </li><li> &quot;교정 파일&quot;에 대한 필터링 된 샘플을 설정하고 교정 구슬의 모드 크기를 입력합니다. </li><li> 커플 샘플 파일 및 1.4.2에 설명 된대로 단계 2.4.3에서 만든 &quot;교정 파일&quot;. 샘플 파일은 이제 아군 교정 구슬에 기초 전기차 및 교정 비드 모두의 크기 분포를 표시한다. 참고 : 표준 오페라팅 프로토콜은 대부분 전기 자동차의 크기 분포 측정에 충분합니다. 그러나 때때로, 버퍼 정확한 성분은 불가능 관심 전기차와 같은 버퍼에 교정 비드 시료를 제조 할 수있는 (혈장 또는 뇨에서 예) 알려져 있지 않다. 교정 입자 타서 EV 시료 이들 특정 조건 EV 크기 추정을 위해 사용될 수있다. </li></ol>

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Vis. Exp. (3037), (2012).</li><li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing.">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li></ol>

설명 프로토콜이 원고를 작성하는 개발은 재정적으로 네덜란드 뇌 재단, 슈마허 크레이머 재단 및 Bohnenn 기금에 의해 부분적으로 지원하고있다. 이 비디오 문서의 생산은 부분적으로 Izon에 의해 sponsorted했다.

정량 TRPS를 사용하여 전기 자동차의 크기 특성이 원고 제공 방법에 설명 된 프로토콜을 지원합니다. TRPS 플랫폼의 주요 장점은 작은 샘플 크기, 상대적 짧은 측정 기간 및 요구되는 시료의 조작 부재이다. 정확한 TRPS 측정을위한 전제 조건은 교정 및 샘플 측정과 동일한 조건을 유지하는 것입니다. 이것은 동일한 버퍼의 사용뿐만 아니라 나노 기공 크기,인가 전압 및 압력과 같은 동일한 장비 설정을 포함한다. 일본어 VPM시켜 시료 사이에인가 된 압력의 작은 차이를 일으키는인가 압력의 정확한 설정을위한 메커니즘이 부족하다. 상이한 시점에서 측정하는 경우도, 프라이밍 VPM에서 유체를 증발 부 압력 차이를 유도 할 수 있으며, 따라서 종종 VPM 다시 프라이밍되어야한다. 이러한 제한은 잠재적으로 VPM2의 도입에 의해 해결되고있는클릭 기 스케일링을 가지며 공기압 기초한다. 이 논문에 설명 된 대체 프로토콜은 비 정제 된 생물학적 시료 17에서 전기차의 측정에 특히 적합하다. 우리는 당, 지질, 단백질 및 몇몇 경우에, 더 큰 수의 다른 파편 등 완충 성분, 적용하는 표준 프로토콜에 대한 너무 많은 측정 조건에 영향을 미칠 것으로 믿는다. 샘플이 아닌 별도의 측정 값을 비교하는 캘리브레이션 구슬 첨가 &#39;실시간 교정&#39;을 소개한다. 상이한 및 / 또는 알 유체 배경 콘텐츠가 샘플 (예를 들면 다른 기증자의 혈장)를 비교할 때이 방법은 특히 적절하다. 전기차가 차이 및 폴리스티렌 입자 (예를 들면 입자 밀도와 표면 전하), 이론적 모델뿐만 아니라 실험 데이터간에 존재하지만 정량화 및 전기차의 크기 프로파일 폴리스티렌 비드의 유용성을 강조,사전에서 그 의미 압력은 15,19 적용됩니다. 동 전기의 힘의 영향을 최소화하기 위해 상대적으로 더 큰 NP150 / NP200의 나노 기공과 유의 한 양의 압력의 사용은 권장합니다. 전기차 및 교정 구슬의 크기에 의해 구별된다. 결과적으로, 나노 기공이 큰 전기차과 교정 모두 입자의 검출이 관찰 직경에 신축성을 적용하여 열 수있다. 공극의 개구부가 작은 입자쪽으로 감도를 감소하기 때문에, 단지 기록 된 특정 크기 (종종 전기차&gt; 120 내지 335 nm의 보정 비드를 사용하여)보다 큰 EVS. 전기차의 최소 검출 한계는 NP150의 나노 기공에 203 nm의 보정 비드를 사용하여, 약 90 나노 미터로 감소 될 수있다. 큰 전기 자동차가 나노 기공을 자주 막힘을 유도 할 때,이 설정은 생존이 불가능 할 수 있습니다. 이러한 방해 전기 자동차의 존재는 설정의 사용을 강제 할 수 있습니다 어디 정말이에요 너무 작은 전기 자동차의 인구,검출 임계 값을 채널, 감지되지 않습니다. 크기가 100 나노 미터보다 작은 입자를 측정하도록 시도 할 때 어려움이 증가 시스템을 운영한다. 이러한 경우에, 검출은 전해질 염 농도를 증가시킴으로써 개선 될 수있다. 증가 된 이온 농도가 상대적으로 작은 입자에 대한 증가 된 봉쇄 크기 (큰 신호 대 잡음비)을 유도 할 것이다. 전기차의 측정을위한 이러한 기술의 가능성이 증가 염 농도는 전기차의 체적에 영향을 미칠 수 있으므로, 비록 검증되어야한다. 결론적 TRPS 플랫폼은 직접 정량화 및 전기차의 크기 특성화에 사용될 수있다. 더 격리 또는 EV 조작 (항체 결합 또는 형광 라벨)이 필요하지 않기 때문에,이 플랫폼은 생물학적 유체에 직접 EV 정량에 적합합니다. 대안적인 프로토콜은 완충 성분 상당한 세공 cloggin 유도 여기서 샘플 유리할 수있다 제공된다살수 표준 프로토콜의 안정적인 활용을 g 이벤트.

휴대 원점에서 소포는 체액 한 매우 풍부하다. 이 소위 세포 외 소포 (전기 자동차) (50 - 크기가 1,000 nm의)는 세포막 다중 기공을 갖는 기관 중 하나 융합하거나 세포막의 직접 바깥쪽으로 신진에 의해 형성된다. 최근, 전기 자동차에 대한 관심이 크게 과학적 새로운 기능 및 전기차의 특성을 설명 하나되는 EV 중심 출판물 과다, 결과적으로 증가하고있다. 전기차는 이제 이러한 신호 전달, 면역 조절 및 혈액 응고 1-4과 병리 생리 학적 과정의 광범위한 어레이에 관여하는 것으로 생각된다. 암에서 전기 자동차는 premetastatic 틈새 5,6, 혈관 신생 팔의 프로 암 콘텐츠 7,8의 전송 및 자극의 형성에 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 이 외에도 전기 자동차는 치료제 9의 배달 요원으로 탐구한다. 이러한 데에도 불구하고velopments는 전기 자동차의 신뢰성 정량화 도전 남아있다. 전통적으로, 간접 정량 방법은 총 단백질 함량 또는 특정 단백질의 정량화에 의존하는 데 사용됩니다. 광범위하게 사용되지만, 이러한 기술은 단백질 당 EV의 차이를 고려하지 않고, 전기 자동차에 단백질 응집체 및 단백질 오염을 구별하지 않습니다. 더욱이, 이들 기술은 많은 경우에 생물학적 시료에서 EV 농도의 비교가 불가능하게 전기차의 절연을 필요로한다. 따라서 노력은 더 정밀하고 직접적인 EV 측정 열 수 있도록 신규 한 방법을 개발하기 위해 수행된다. 이 보고서는 신뢰할 수있는 정량 및 전기 자동차의 크기 프로파일에 대한 조정 저항 펄스 감지 (TRPS)를 사용하는 방법을 설명한다. 현재 qNano 악기 (도 1a) TRPS 유일한 시판 플랫폼이다. TRPS에서, 비도 전성 탄성 멤브레인은 위스콘신 구두​​점나노 크기의 세공이 유체 번째 셀을 분리한다. 다른 셀이없는 입자 전해질로 채워진 반면 유체 셀 중 하나는 관심있는 시료로 채워진다. 전압을인가함으로써, 이온 유동 / 전류가 기공을 통해 입자의 전사시에 변경되는, (도 1B)으로 설정된다. 이 전류 차단 ( &#39;펄스 저항&#39;)의 크기는 입자 (11) (도 1C)의 체적에 비례한다. 봉쇄 기간은 충전 또는 12 모양 같은 입자 특성에 의존하는 입자의 제타 전위를 평가하기 위해 사용될 수있다. 미지의 입자 크기 프로파일은 공지 직경 보정 입자에 의한 저항 펄스와 미지의 입자에 의한 저항 펄스를 비교함으로써 수행 될 수있다. 봉쇄 이벤트의 크기 외에,이 발생하는 속도가 측정된다. 이 계수 속도 RELI입자 농도에 에스. 농도 및 봉쇄 율 알려진 농도와 입도의 입자가 단일 캘리브레이션 샘플을 사용하여, 직선 (13)의 농도에 비례하기 때문에 (14)와 미지 시료의 입도 분포 (11)의 측정을 허용한다. 나노 기공을 통해 입자의 움직임은 전기 kinetic- (전기 및 전기 삼투) 및 유체의 힘 (15)에 의해 결정된다. 변압 모듈 (VPM) 유체 셀 사이의 압력 차를 이용하여 부가적인 힘으로서 발생 될 수있다. 양압을 적용하면, 입자의 농도가 낮은 경우에 도움이 될 수있다 입자의 유량을 증가시킨다. 또한, 압력은 전기 역학적 힘의 영향을 줄이기 위해 적용될 수있다. 상대적으로 작은 기공 직경을 갖는 나노 기공을 사용하는 경우에 특히 중요하다 (NP100, NP150 가능성 및 NP200)는 자주 전기차의 검출을 위해 사용.이러한 나노 기공 들어, 상당한 압력을 가하는 경우에도, 전기 역학적 힘은, 입자 표면 전하에 따라, 16 무시할 남아있을 수있다. 다양한 압력에서의 입자 속도를 측정함으로써, 전기 - 역학적 보정, 따라서 더 정확하고, EV 농도를 산출 할 수있다. 여기서, 상세한 프로토콜은 전기차의 크기 분포 및 농도를 결정하기 위해 제공된다. 샘플은 공지 된 크기 및 농도 17의 폴리스티렌 비드 아군 곳 정상운 프로토콜은 다음에, 다른 방법에 대하여 설명한다. 이것은 실시간 교정 기술은 소변, 혈장 및 세포 배양 상등액, 또는 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 기술적 과제 일부 발생 극복하는데 사용될 수 측정 장시간 나노 기공의 안정성을 할 수없는 경우 보장.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Variable pressure module</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>NP100, NP200</td>
			<td>Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration Particles</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>CPC100, CPC200, CPC400</td>
			<td>Calibration particles are available in different sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td>Basic sonication bath is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Mini) vortexer</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lift-free tissues</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Windows based computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Izon Control Suite 2.2</td>
			<td>Izon Science Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet Software</td>
			<td>Multiple available</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification and size-profiling of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing

&#39;마이크로 소포&#39;와 &#39;엑소 좀&#39;를 포함한 세포 외 소포 (전기 자동차)는, 체액 매우 풍부하다. 최근 몇 년 동안 전기 자동차에 대한 관심의 엄청난 증가를 목격했다. 전기차는 응고, 면역 반응, 및 암을 포함하는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 또한, 전기차가 약물 전달 등의 차량, 예를 들어 또는 재생 의학으로서, 치료제로서 가능성이있다. 때문에 작은 크기 (50 ~ 1,000 nm의)의 정확한 정량 및 전기 자동차의 크기 프로파일 링은 기술적으로 도전이다. 이 프로토콜은 qNano 시스템을 사용하여, 어떻게 가변 저항 펄스 감지 (TRPS) 기술을 설명 전기차의 농도와 크기를 결정하는데 사용될 수있다. 나노 크기의 기공을 통해 자신의 전송시 전기차의 검출에 의존하는 방법은 상대적으로 빠르다 작은 샘플 볼륨의 사용을 충분하고부터 끝까지 필요없는동북 아시아의 평화와 번영 및 전기 자동차의 농도. 다른 방법이 사용하여 설명 일반 동작 프로토콜에 대한 다음 샘플은 알려진 크기와 농도의 폴리스티렌 비즈를 타서. 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 교정 기법 기술적 장애물을 극복하기 위해 이용 될 수있는이 실시간이 발생.

TRPS 기기를 사용하기 위해, 비도 전성 나노 기공은 머신 (도 1A)의 암 (4) 상에 배치되어야하며 전압 (도 1B)을 적용 할 수있다. 전기 기준 전류가 설정되면도 1c에 도시 된 바와 같이, 공극을 통과 입자에 의한 저항 펄스가 검출된다. 전기차은 초 원심 분리에 의해 교 아세포종 세포주 U87-MG / EGFRvIII의 세포 배양 상청액으로부터 정제 하였다. NP100의 나노 기공에 고립 된 전기 자동차 (그림 2a)를 측정 할 때 안정적인 입자 속도 플롯이 관찰된다. 이 안정된 입자 속도 플롯은 신뢰할 수있는 EV 농도 측정이 필요합니다. 115 nm의 폴리스티렌 보정 구슬, 입도 분포 (도 2b) 및 EV-샘플의 농도 추정의 기록에 EV-샘플 기록 페어링 후 (데이터는 도시하지 않음)를 얻을 수있다. (Figrue의 3A)의 중단 및 / 또는 변동을 초래한다. 이 부정확 EV 농도 추정 결과. 공지 된 농도와 크기의 폴리스티렌 비드와 샘플 급상승하여, EV-대 - 비드 비율이 결정될 수있다.도 3b는 크기가 335 나노 미터의 폴리스티렌 비드와 세포 배양 상등액을 급상승 한 후 얻어진 결과를 도시한다. 두 명확 인구 관찰된다. 미만 0.46 NA가 봉쇄를 유도 입자는 큰 입자는 폴리스티렌 비드를 결정, 결정된 전기차이다. 폴리스티렌 비드에 전기차의 비율은 전기차 (표 1)의 원료 농도를 계산하는데 사용된다. 3C는 아군 폴리스티렌 비드에 기초하여 두 개의 집단의 크기 추정을 도시도. 나노 기공 설치 사용 재크기 전기차&gt; 140 nm 인 검출 sulted. 이것은 나노 기공 개구를 감소시킴으로써 저하 될 수 있으나이 또한 더 클 로깅 이벤트가 발생할 것이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1 : qNano 기기의 동작 모드와. 악기의 (A)의 사진. 나노 기공은 상부 유체 세포에서 낮은 유체 세포를 분리, 악기에 위치한다. 유체 셀은 차폐 캡에 의한 환경 전기적 간섭으로부터 보호된다. (B) 그림 조정 저항 펄스 감지 (TRPS)를 개설. 비도 전성 탄성 나노 기공은 두 유체 세포를 분리한다. 전압을인가하여 전류가 나노 기공에 천공 구멍을 통해 확립된다. 세포 외 소포가 나노 기공을 통해 이동하면 이온 흐름을 변경하고 저항 펄스로 검출. TRPS에서 나노 기공의 개구부의 크기가 장비의 대향 아암들 사이의 거리를 증가 또는이 거리를 감소시켜 나노 기공을 연신 (감소 또는 증가) 튜닝 될 수있다. (C) 저항 펄스의 예시. 단일 저항 펄스의 크기는 입자의 부피에 비례한다 :. 큰 펄스가 큰 입자를 나타내는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2 : 입자 카운트 음모와 U87-MG / EGFRvIII 세포 배양 상층 액에서 격리 된 전기 자동차를 측정에서 얻은 크기 분포 전체 일정 입자 검출을 나타내는 (A) 입자 카운트 줄거리.. partic의 간단한 감소르 검출은 기록의 80 ~ 100 초 사이에서 관찰되었다. 차폐 캡 기록을 일시 태핑 후, 입자 속도는 그 후에 기록이 재개 된 안정화. (B) 절연 전기차의 입도 분포는 115 nm의 폴리스티렌 보정 비드 미지 시료 (전기 자동차)를 조정 한 후의 플롯. (5 nm의 빈 크기). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> 도 3 : 다른 프로토콜을 사용하는 세포 배양 상청액에서 전기차의 TRPS 정량. 생물학적 유체에서 직접 전기차를 측정 할 때 얻어지는 (A)의 전형적인 입자 속도의 플롯. 모공 막힘 입자 검출 속도에 대한 간단한 중단되거나 변동이 발생합니다. 각플롯은 동일한 샘플의 복제에 측정을 나타낸다. 335 nm의 폴리스티렌 보정 비드 세포 배양 상등액을 급상승 후에 얻어진 (B) 세 복제 크기 분포 그래프. 이하 NA가 0.46 저항성 펄스를 유도하는 모든 입자를 전기차로 선택된다. (C) 아군 폴리스티렌 비드 샘플의 크기 분포를 얻기 위해 사용될 수있다. (5 nm의 빈 크기). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 측정 </td><td> 교정 만 # 1 </td><td> 교정 만 # 2 </td><td> 뜨는 # 1 </td><td> 뜨는 # 2 </td><td> 뜨는 # 3 </td></tr><tr><td> 평균 전류 (NA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;TD&gt; (116) </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 입자의 속도 </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> 사용 차단 (NA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> 총 입자 </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> 세포 외 소포 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> 가시 교정 구슬 </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> 전기 자동차 / 교정 구슬 </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0.788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> 샘플 - 배경 </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Extracelullar 소포 (10 7) / ㎖ </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> 샘플 2.5 배 희석 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 원시 농도 전기 자동차 (10 7) / ㎖ </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> 표 1. 대체 프로토콜을 이용하여 EV 농도의 계산 예 컷오프 값은 캘리브레이션 비드에서 전기차를 구별 판정된다. 이어서, 전기차 비드의 총 수를 검색 할 수있다. 각 측정의 EV 투 비드 비율이 계산된다. (실시 예 단백질 골재) 전해질 배경 입자의 양은 &#39;교정 비드 만&#39;샘플의 개별 측정 EV-대 - 비드 비율을 평균화함으로써 계산된다. 각 샘플에 대한 배경 비가 얻어지는 비로부터 감산된다. 이 adjusteD 비율 (: 9.33e7 / ㎖이 예에서) 샘플에서 보정 구슬의 농도에 의해 곱해진다. 전기차의 원료 농도를 측정하기 위해, 얻어진 농도 (2.5이 예에서) 다운로드 전기차 희석 인자에 의해 곱해진다.

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Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

세포 외 소포는 응고, 면역 반응, 암 또는 약물 전달이나 재생 의학의 잠재적 치료제를 포함하여 생리 학적 및 병리학 적 과정에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜은 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 다양한 유체 절연 및 비 절연 외 소포의 정량화 및 크기 특성화하기위한 방법을 제시한다.

정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.2K 조회수.  University Medical Center Utrecht.  세포 외 소포는 응고, 면역 반응, 암 또는 약물 전달이나 재생 의학의 잠재적 치료제를 포함하여 생리 학적 및 병리학 적 과정에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜은 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 다양한 유체 절연 및 비 절연 외 소포의 정량화 및 크기 특성화하기위한 방법을 제시한다. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

연구

생체공학

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Sensing of Barrier Tissue Disruption with an Organic Electrochemical Transistor

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the passage of necessary ions and molecules. A breach in this barrier can be caused by a reduction in the extracellular calcium concentration. This reduction in calcium concentration causes a conformational change in proteins involved in the sealing of the barrier, leading to an increase of the paracellular flux. To mimic this effect the calcium chelator ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetra acetic acid (EGTA) was used on a monolayer of cells known to be representative of the gastrointestinal tract. Different methods to detect the disruption of the barrier tissue already exist, such as immunofluorescence and&#160;permeability assays. However, these methods are time-consuming and costly and not suited to dynamic or high-throughput measurements. Electronic methods for measuring barrier tissue integrity also exist for measurement of the transepithelial resistance (TER), however these are often costly and complex. The development of rapid, cheap, and sensitive methods is urgently needed as the integrity of barrier tissue is a key parameter in drug discovery and pathogen/toxin diagnostics. The organic electrochemical transistor (OECT) integrated with barrier tissue forming cells has been shown as a new device capable of dynamically monitoring barrier tissue integrity. The device is able to measure minute variations in ionic flux with unprecedented temporal resolution and sensitivity, in real time, as an indicator of barrier tissue integrity. This new method is based on a simple device that can be compatible with high throughput screening applications and fabricated at low cost.

The Organic Electrochemical Transistor is integrated with live cells and used to monitor ion flux across the gastrointestinal epithelial barrier. In this study, an increase in ion flux, related to disruption of tight junctions, induced by the presence of the calcium chelator EGTA (ethylene glycol-bis(beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetra acetic acid), is measured.

유기 전기 트랜지스터와 장벽 조직 혼란의 감지

The gastrointestinal tract is an example of barrier tissue that provides a physical barrier against entry of pathogens and toxins, while allowing the ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. To this end, cells are grown in special culture chambers on top of opposing, circular gold electrodes. A constant small alternating current is applied between the electrodes and the potential across is measured. The insulating properties of the cell membrane create a resistance towards the electrical current flow resulting in an increased electrical potential between the electrodes. Measuring cellular impedance in this manner allows the automated study of cell attachment, growth, morphology, function, and motility. Although the ECIS measurement itself is straightforward and easy to learn, the underlying theory is complex and selection of the right settings and correct analysis and interpretation of the data is not self-evident. Yet, a clear protocol describing the individual steps from the experimental design to preparation, realization, and analysis of the experiment is not available. In this article the basic measurement principle as well as possible applications, experimental considerations, advantages and limitations of the ECIS system are discussed. A guide is provided for the study of cell attachment, spreading and proliferation; quantification of cell behavior in a confluent layer, with regard to barrier function, cell motility, quality of cell-cell and cell-substrate adhesions; and quantification of wound healing and cellular responses to vasoactive stimuli. Representative results are discussed based on human microvascular (MVEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), but are applicable to all adherent growing cells.

This protocol reviews Electric Cell-substrate Impedance Sensing, a method to record and analyze the impedance spectrum of adherent cells for the quantification of cell attachment, proliferation, motility, and cellular responses to pharmacological and toxic stimuli. Detection of endothelial permeability and assessment of cell-cell and cell-substrate contacts are emphasized.

전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness and low bioactivity of metals. In this study, we have developed a new method towards fabricating a new type of bioactive and mechanically reliable porous metal scaffolds-densified porous Ti scaffolds. The method consists of two fabrication processes, 1) the fabrication of porous Ti scaffolds by dynamic freeze casting, and 2) coating and densification of the porous scaffolds. The dynamic freeze casting method to fabricate porous Ti scaffolds allowed the densification of porous scaffolds by minimizing the chemical contamination and structural defects. The densification process is distinctive for three reasons. First, the densification process is simple, because it requires a control of only one parameter (degree of densification). Second, it is effective, as it achieves mechanical enhancement and sustainable release of biomolecules from porous scaffolds. Third, it has broad applications, as it is also applicable to the fabrication of functionally graded porous scaffolds by spatially varied strain during densification.

Bioactive and mechanically reliable metal scaffolds have been fabricated through a method which consists of two processes, dynamic freeze casting for the fabrication of porous Ti, and coating and densification of the Ti scaffolds. The densification process is simple, effective and applicable to the fabrication of functionally graded scaffolds.

Biometal systems have been widely used for biomedical applications, in particular, as load-bearing materials. However, major challenges are high stiffness ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

슈완 세포 표현형 사양을 평가하기 위한 튜블드 세포 외 세포 매트릭스 미세 환경의 준비

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...