이 비디오에서는 전 세계 수준에서 항체 레퍼토리를 시각화하고 분석하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 그것은 개별에 있는 전체 B 세포 레퍼토리 및 면역 자극에 응하여 그들의 동적 변경을 기술하는 것이 가능합니다. 이 방법은 신흥 바이러스 감염의 환자로부터 병리학 적 샘플을 분석하고 감염의 병인에 대한 전례없는 통찰력으로 데이터를 얻기 위해 적용 될 수있다.
응용 프로그램에 대 한 가장 흥미로운 영역 중 하나는 백신 제어. 백신 효능은 백신 투여 된 개인의 글로벌 항체 레퍼토리의 역학을 분석하여 평가 될 수있다. 개별은 항체 유전자 증폭의 효율성이 개시 물질의 모형에 달려 있기 때문에 PCR 조건을 최적화할 필요가 있을 수 있습니다 이 방법에 새로운.
면역 글로불린 앰플리컨의 식별을 위한 Fla-cher. 이러한 작업을 시각적으로 보여 주는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 야마구치 사우리 씨와 제 실험실에서 기술자이자 대학원생인 한빙 쉬(Hanbing Xue) 씨가 될 것입니다.
이 절차를 시작하려면 8 주 된 C57 블랙 6 마우스에서 조직을 해부하고 분산 된 세포를 얻기 위해 PBS의 두 밀리리터와 스테인레스 스틸 메쉬를 통과. 세포 현탁액을 2밀리리터 미세원심분리기 튜브와 원심분리기로 600배, 섭씨 4도에서 5분간 전달합니다. 상체를 버리고 800 마이크로리터의 ACK 리싱 버퍼를 펠릿에 추가합니다.
조직에 있는 적혈구를 lyse 2 분 동안 얼음에 배양. 다음으로, 각 세척에 대해 PBS의 3 밀리리터를 사용하여 조직 세포를 세 번 씻는다. 원심분리기는 다시 600배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 드시면 됩니다.
상체를 버리고 페놀/구아니딘 이소티오카네이트 시약 800마이크로리터를 펠릿과 소용돌이에 철저히 넣습니다. 섭씨 25도에서 5분간 배양하세요. 그런 다음 200 마이크로리터의 클로로폼을 추가하고 15초 동안 수동으로 흔들어 줍니다.
2분 동안 섭씨 25도에서 배양하십시오. 원심분리기는 12, 000배, 섭씨 25도에서 위상을 분리합니다. 상부 수성 단계를 신선한 튜브로 옮기십시오.
70%의 에탄올 한 부피를 추가합니다. 소용돌이를 간략하게 적용하여 실리카 스핀 컬럼에 이 혼합물을 적용합니다. 30~100마이크로리터의 물로 RNA를 엘테.
그 후, 초기 RNA 농도를 양화하기 위해 형광계를 사용한다. 정제된 RNA를 영하 80도에 보관하십시오. 먼저, 제조사의 지침에 따라 5'RACE CDS 프라이머와 SMART-PCR 올리고뉴클레오티드를 사용하여 총 RNA 템플릿의 2~10마이크로그램에서 제1가닥 cDNA를 합성한다.
마우스 면역글로불린의 경우, PCR은 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 범용 전방 프라이머 및 면역글로불린 클래스별 역프라이머를 사용하여 고충실도 DNA 폴리머라제로 cDNA를 증폭시한다. 인간 면역글로불린의 경우, 태그 시퀀스를 가진 범용 전방 프라이머 및 면역글로불린 클래스 별 역프라이머를 사용하여 제1 PCR을 수행한다. 인덱스 시퀀스 프라이머를 사용하여 두 번째 PCR별로 각 샘플에 대한 인덱스 시퀀스를 포함합니다.
다음으로, 2%아가로즈 젤의 PCR 제품 중 하나. UV 트랜틸루미네이터에 DNA 밴드를 시각화하고 600~800개의 베이스 쌍 사이의 넓은 밴드를 포함하는 젤 슬라이스를 절제합니다. 젤 슬라이스 10밀리그램당 멤브레인 결합 용액 10마이크로리터를 추가합니다.
젤 슬라이스가 완전히 녹을 때까지 섭씨 50~65도에서 혼합하고 배양합니다. 그런 다음, 실리카 멤브레인 스핀 컬럼에 겔 용액을 전달한다. 세척 버퍼로 한 번 컬럼을 씻고 50 마이크로 리터의 뉴클레아제없는 물로 DNA를 엘로우.
불소계를 사용하여, 정제된 앰플리턴을 정량화하고 NGS 시퀀싱에 대해 동일한 양으로 각 면역글로불린 클래스의 앰플리온을 풀링한다. 그 후 DNA 크기 조정 칩을 사용한 마이크로모세필계 전기포진을 사용하여 라이브러리의 크기와 농도를 결정한다. 라이브러리를 영하 20도에 보관하십시오.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시퀀싱 실행의 샘플 스프레드시트를 생성합니다. 다음으로 시약 카트리지와 라이브러리를 해동합니다. 수산화 나트륨의 0.2 정상 용액을 만들고 원하는 어금니 농도를 얻기 위해 라이브러리를 희석한다.
그런 다음, 유량 셀을 헹구고 건조시키고 희석및 변성 라이브러리 용액600마이크로리터를 시약 카트리지의 우물에 넣고 시퀀싱 실행을 시작합니다. 전체적으로 뮤린 항체 레퍼토리의 원근은 비장, 골수, 림프절 또는 혈액과 같은 세포 또는 조직에서 얻을 수 있다. Naïve 마우스 비장의 IgM, IgG1, IgG2c 및 면역 글로불린 라이트 체인 레퍼토리의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.
3D V(D)J 플롯에 의한 V(D)J 재배열에서 각 공의 크기는 상대적인 읽기 수를 나타냅니다. 즉, 전체 B 세포에서 항체 mRNA의 수를 나타낸다. 3D 메쉬는 110개의 면역글로불린 중형 사슬 V 유전자, 12개의 면역글로불린 무거운 사슬 D 유전자 및 염색체에 그들의 순서를 반영하기 위하여 정렬되는 4개의 면역글로불린 무거운 사슬 J 유전자로 이루어져 있습니다.
2D VJ 플롯은 IGL 레퍼토리에서 VJ 재배열의 프로필을 보여줍니다. 각 막대의 길이는 상대읽기 수를 나타냅니다. X축은 101면역글로불린 라이트 체인 V-카파 유전자, 3개의 면역글로불린 라이트 체인 V-람다 유전자를 나타내며, Y축은 4개의 면역글로불린 광사슬 J-kappa 유전자, 및 3개의 면역글로불린 라이트 체인 J-lambda 유전자를 나타낸다.
인간 항체 레퍼토리의 관점은 전체적으로 말초 혈액 단핵 세포 또는 병리학 적 조직을 포함한 다양한 조직에서 분석 될 수있다. IgM의 대표적인 결과, 총 IgG, 총 IgA, IgD, IgE 및 IgL 레퍼토리의 정상 말초 혈액 단핵 세포에서 여기에 표시됩니다. 뮤린 모델과 마찬가지로 V(D)J 재배열의 레퍼토리 프로파일은 각 공의 크기가 판독 횟수를 나타내는 3D V(D)J 플롯에 표시됩니다.
3D 메쉬는 56개의 면역글로불린 중형 사슬 V 유전자, 27개의 면역글로불린 중형 사슬 D 유전자 및 6개의 면역글로불린 무거운 사슬 J 유전자로 이루어져, 염색체에 나타나는 순서로 정렬됩니다. IgL 레퍼토리의 VJ 재배열 프로필은 각 막대의 길이가 판독횟수를 나타내는 2D VJ 플롯에 묘사됩니다. X축은 41개의 면역글로불린 라이트 체인 V-카파 유전자, 및 32개의 면역글로불린 라이트 체인 V-람다 유전자를 나타내며, Y축은 5개의 면역글로불린 광사슬 J-kappa 유전자및 5개의 면역글로불린 광사슬 J-lambda 유전자를 나타낸다.
이 프로토콜의 연구 자료에서, 유동 세포측정또는 병리학적인 견본의 극저온섹션에 의하여 정렬된 세포의 소수는 이용가능합니다. 그러나 PCR 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜의 출력 정보는 거대하기 때문에 생물 정보 학문해력은 항체 네트워크의 구조를 찾는 데 도움이 될 것입니다.
그것은 면역 계통의 깊은 이해로 선행되지 않을 것입니다.
