The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

단일 클론 항체의 1. 준비 <ol><li> 배양 5 % CO 2 보충 37 ºC에서 175T 플라스크에서 무 혈청 배지에서 RG-M56 마우스 단클론이 하이 브리 도마 세포. 매체의 색상은 배양 5 일 후 노란색으로 바뀌면 뜨는를 수집합니다. 주 : 하이 브리 도마 세포를 소 태아 혈청으로부터 항체의 오염을 피하기 위해, 무 혈청 배지에서 배양 하였다. </li><li> 4 ºC에서 30 분 동안 4,500 XG에 뜨는을 원심 분리기와 세포 파편 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 5 mL의 컬럼 (50 % 슬러리로 제공) 단백질 G 아가로 오스의 2 mL를 넣고 얼음처럼 차가운 PBS의 10 수지 볼륨 (10 mL)로 평형. </li><li> 항체 상층 액의로드 200 ㎖ 칼럼 상 (단계 1.2) 및 통과를 폐기합니다. </li><li> 그것을 씻어 칼럼에 얼음처럼 차가운 PBS의 10 ML을 추가합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 단백질 G-관련된 항체를 용출 컬럼에 50 mM의 글리신, 산도 2.7의 10 ML을 추가합니다. 안부[선택] 배 중화 완충액 100 μL (1 M 트리스, 1.5 M의 NaCl, 및 1 mM의 EDTA, pH를 8.0)를 함유하는 마이크로 원심 튜브에 900 μL 분획. </li><li> -20 ºC에서 0.03 % NaN의 3 50 % 글리세롤에서 정제 된 항체를 저장합니다. </li></ol> 2. 건설 및 직렬로 잘린 재조합 단백질의 발현 <ol><li> (10 배의 Pfu 완충액 5 μL, 각각의 dNTP, 0.2 mM의 0.2 μM 정방향 프라이머 3, 0.2 μM 역방향 프라이머 3, 2 mM의 황산, pET20b-1A59 3 플라스미드 DNA 1 NG 및 2.5 U : PCR 반응 혼합물을 제조 부)의 Pfu DNA 중합 효소; 50 μL의 최종 볼륨 O DDH 2를 추가합니다. <ol><li> 자동 열 자전거 타는 사람에 실행 샘플 다음 매개 변수를 사용하여 : 사이클 1 (5 분 94 ° C); 사이클 2-36 (30 초 94 ºC, 30 초 63 ºC, 60 초 동안 72 ° C); 사이클 37 (7 분 72 ° C). </li></ol></li><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 다음 제한 효소 절단을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 사용하여 제품을 추출한다. </li><li> 이니까 I 및 I을 XhoI 제한 효소로 PCR 증폭 된 DNA 단편을 Nde I 소화하고을 XhoI 효소 절단 된 애완도 20b (+) 벡터에 이러한 DNA 단편을 각각 결찰. 대장균 DH 5α-6-적격 세포로 구조 변환. <ol><li> 소화 버퍼 소화 혼합물을 제조 (20 mM 트리스 - 아세테이트, 10 mM의 마그네슘 (CH 3 COO) 2, 50 mM의 KCH 3 COO, 1 mM의 DTT, pH를 7.9)으로 한 PCR 증폭 된 DNA 또는 애완 동물 (20b)의 μg의 이니까 I 및 I을 XhoI 제한의 (+) 벡터 DNA 및 2 U 20 μL의 최종 부피 효소. </li><li> 부드럽게 소화 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 제한의 완전 절단 앉아 보장하기 위해 건조 욕조에 2 시간 동안 37 ºC에서 품어에스. </li><li> 다음 플라스미드의 구축을 용이하게하기 위해 PCR 정제 키트 (5)를 이용하여 제한 효소 소화 DNA 단편을 추출 하였다. </li><li> 결찰 완충액 결찰 혼합물을 준비한다 (66 mM 트리스, 5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 ATP, 5 mM의 DTT, pH를 7.5) predigested, PCR 증폭 된 DNA 100 ng를, predigested 애완 20B 10 NG와 (+) 벡터 DNA, 10 μL의 최종 부피의 5 U T4 DNA 리가. </li><li> 부드럽게 결찰 혼합물을 혼합하고 신속하게 스핀 다운. 수조에서 18 시간 동안 16 ºC에서 품어. </li><li> 지명 타자-5α-유능한 세포 100 μL에 결찰 샘플의 10 μL를 넣고 30 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 배치하기 전에 가볍게 섞는다. 열 충격 (7)을 유도하기 위해 90 초 동안 42 ºC에서 건조 욕조에 microcentrifuge 관을 넣습니다. 즉시 2 분 동안 얼음에 튜브를 전송합니다. </li><li> 0.5 % 박토 효모 extrac 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (1 % 박토 트립 톤의 900 μL를 추가튜브에 t, 0.5 % 염화나트륨, pH를 7.0). 150 rpm으로 45 분 동안 진탕 37 ºC에서 품어. 10 분 동안 4000 x g에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> LB의 국물의 50 μL와 펠렛을 재현 탁하고 100 μg의 / ML의 암피실린을 포함하는 미리 예열 LB 플레이트에 각각의 변환을 확산. 16 시간 37 ºC에서 번호판을 품어. </li><li> 200 μL 팁을 사용하여 단일 콜로니를 선택하고 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물에 배치합니다. 150 rpm으로 12 시간 동안 진탕 37 ºC에서 품어. </li><li> 각 문화 플라스미드 DNA (8)을 추출하고 순서 9를 확인 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 프라이머를 사용하여 시퀀스. </li></ol></li><li> 서열 확인 후, 이러한 애완 동물 20B에서 DNA 10ng의 (+) 회사에 의해 대장균의 BL-21 (DE3) 균주에 YGNNV 코트 단백질 유전자의 다양한 길이를 가진 플라스미드를 변형열 쇼크 방법 7 보내고. 단계에 따라 2.3.6-2.3.8 변환을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 느슨하게 덮인 15 mL의 튜브에 100 μg의 / ㎖의 암피실린을 포함하는 3 ㎖의 LB의 국물로 각각 형질 전환 된 대장균 BL-21 세포에서 하나의 식민지를 전송합니다. 150 rpm으로 흔들면서 37 ºC에서 문화를 품어. </li><li> 배양액의 OD (600)는 약 0.6 일 때 25 ºC로 배양을 냉각시키고, 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 IPTG를 추가한다. 200 rpm으로 흔들면서 25 ºC에서 추가로 4 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 미세 원심 관에 문화의 한 ML을 전송합니다. 1 분 12,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> 마이크로 피펫 최대 피펫 팅 다운 변성 완충액 100 μL (8 M 우레아, 20 mM 인산 나트륨, 0.5 M 염화나트륨, pH 7.4의)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 활발한 텍싱에 의해 섞는다. 참고 : 샘플 졸용액 사용은 이제 도트 오 하이브리드 분석을 위해, 반투명 약간 끈적하고 준비해야한다. </li></ol> 겹치는 펩타이드 3. 설계 및 합성 <ol><li> 디자인 및 각 도트 블로 팅에 의해 RG-M56 단클론 항체의 에피토프 영역을 좁힐 수있는 YGNNV 코트 단백질의 195-338 AA 지역에서 10 AA 잔류 물에 의한 후속과 겹쳐 3 직렬 20 머 펩티드를 합성. </li><li> 설계 및 합성 3 세 8 머 펩티드 (202 195 VNVSVLCR, 197 VSVLCRWS 204, 199 VLCRWSVR 206) 다음의 합성 펩티드 상 6 AA 잔류의 중복과 도트 블로 팅에 의해 195-206 금주의 에피토프 영역을 좁힐 수 있습니다. </li><li> 디자인과 3 ~ 7 머를 합성 (196 NVSVLCR 202, 195 VNVSVLC 201), 6- 메르 (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC (201), 1을 최소화하기 위해 자신의 이웃 펩티드 상에 각각 6, 5의 중복, 4 AA 잔류, 97 VSVLCR 202), 5 머 펩티드 (202 195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, 198 SVLCR) 도트 블로 팅에 의해 에피토프 영역입니다. </li></ol> 4. 도트 오 하이브리드 <ol><li> 10 mg / ml의 최종 농도로 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 각 합성 펩티드를 녹인다. 주 : 합성 펩티드의 용해도 변화를 극복하기 위해, 모든 합성 펩티드를 DMSO에 용해한다. DMSO 완전히 소수성 또는 친수성 펩티드를 용해하는 양 용매이다. </li><li> 2 분 동안 메탄올과 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 담근다. 주 : PVDF 막은 DMSO에 내성이 100 %까지이다; 다른 사람들은 그렇게하지 않을 수 있습니다. </li><li> 수정 Towbin 버퍼 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, pH를 8.3) 용으로 PVDF 막 평형2 분. 주 : ~ 20 % (V / V)의 메탄올는 전송 결과를 개선하기 위해 수정 Towbin 완충액에 첨가 할 수있다. </li><li> 개질 Towbin 완충액 크로마토 종이를 헹군다. 크로마토 그래피 종이 위에 PVDF 막 놓습니다. 수정 Towbin 버퍼가 다음 단계를 계속하기 전에 PVDF 막 표면에서 사라질 때까지 기다립니다. </li><li> 10 μL 팁으로 막에 각각의 펩타이드 샘플 2 μL를 추가합니다. 10 분 동안 크로마토 그래피 용지에 PVDF 멤브레인을 공기 - 건조. 지나치게 확산을 방지하기 위해 막에 천천히 그리고 점차적으로 각 펩타이드 샘플을 추가한다. </li><li> 부드러운 흔들림 실온에서 30 분 동안 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼 막 (0.05 % (v / v)의 트윈 20, 20 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 차단. </li><li> 막에 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼에서 1000 : 1의 최종 희석에 RG-M56 단클론 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어. </li><li> 그래서 항체를 제거lution. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 반복합니다. </li><li> 멤브레인을 5 % 탈지 우유 TBST 버퍼에서 5000 : 1의 최종 희석 차 항체 (염소 항 - 마우스 IgG, 된 Fc 공액 알칼리성 포스파타제)을 추가한다. 부드러운 흔들림과 1 시간 동안 37 ºC에서 막을 품어. </li><li> 항체 솔루션을 폐기하십시오. 부드러운 흔들림 5 분 동안 TBST 버퍼에 막 씻으십시오. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 어둠 속에서 15 분 동안 실온에서 BCIP / NBT 기질 용액으로 막을 개발. 신호가 나타날 때 DDH 2 O로 막을 세척하여 현상을 중지합니다. </li><li> 멤브레인을 공기 - 건조 이미지 시스템을 사용하는 도트 블롯 이미지를 캡처. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 3 점 블롯의 강도를 측정한다. </li></ol> 5. 알라닌 스캐닝 및 교체 <ol><li> 디자인과 3 알라닌과 methi을 합성onine 대체 펩티드. VAVSVLCR (202), (195) VNASVLCR (202), (195) VNVAVLCR (202), (195) VNVSALCR (202), (195) VNVSVACR (202), (195) VNVSVLAR (202) 8 메르 펩타이드 195 VNVSVLCR 202 알라닌 각각 AA 잔류 물을 교체하고 합성 펩타이드 195 ANVSVLCR 202, 195, 195 VNVSVLCA (202) . SJNNV 유전자형 에피토프 펩타이드 195 VNVSVMCR (202)를 만드는 메티오닌하는 AA 잔류 류신 (200)를 교체합니다. </li><li> 알라닌 검색 및 치환 돌연변이가 블로 팅 도트 수행하기 위해 제 4 절을 따르십시오. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest related to this report.

이 프로토콜은 단클론 항체 인식 선형 에피토프를 확인하기위한 신속하고 간단한 기술을 제공한다. 고려 펩티드 합성 및 합성 펩티드의 생산 효율의 비용을 고려하여 바이러스 코트 단백질의 항원 성 영역은 펩타이드 주사 분석 전에 연속적으로 절단 재조합 단백질 발현을 감소시켰다. 50-10 사이의 분자량이 kDa의 재조합 단백질은 쉽게 시스템을 통해 표현 될 수 있으므로 따라서, 안정적이고 효?...

면역계에서 V, D, 및 J 세그먼트의 재조합 항체는 병원균 감염으로부터 숙주를 보호하는 다양한 항원 결합에 대해 상보성 결정 영역 (CDR을)의 상당한 변화를 생성 할 수있다. 항원에 대한 항체의 중화 방어 항체의 CDR을하고 항원의 에피토프 사이의 공간 상보성에 따라 달라집니다. 따라서이 분자의 상호 작용에 대한 이해는 예방 백신 디자인과 치료 펩티드 약물 개발에 도움이 될 것입니다. 그러나,이 중화 상호 작용은 단일 항원 여러 항원 도메인 의해 결과적 에피토프 결정 처리는 더 복잡하게 항체의 복수 개의 CDR에 의해 모두 영향을받을 수있다. 다행히도, 골수종 세포와 개별 항체 생산 세포를 하이 브리 도마 융합 기술의 개발은, 초 셀 끊임없이 나누어 배치 허용모노클로 날 항체 (단클론)로 알려진 하나의 특정 항체 RETE 1. 하이 브리 도마 세포는 특이 적 항원 항원의 한 영역에 결합하는 이들의 순수한 고 친 화성 모노클로 날 항체를 생산한다. 확립 된 항원 - 항체, 펩티드 주사 등 여러 방식의 관계를, 그 대응하는 단클론 항체를 이용하여 항원의 에피토프를 결정하기 위해 사용될 수있다. 합성 펩타이드 기술의 최근 발전은 펩타이드 스캐닝 기술은 더 접근하고 수행하는 것이 더 편리 만들었습니다. 간단히, 중복 합성 펩티드의 세트는 표적 항원 서열에 따라 제조되고, 단클론 혼성화 고체지지 막에 관련된다. 펩티드 스캐닝 영역을 결합 항체를 맵핑하는 간단한 방법을 제공하지만, 또한 에피토프 펩티드 각각 AA 잔기 및 항체의 CDR의 결합 상호 작용을 평가하기 위해 잔류 검사 또는 교체를 통해 아미노산 (AA) 돌연변이를 용이 아닙니다. 2, 3, 4를 이용하여 노란색 그루퍼 신경 괴사 바이러스 (YGNNV) 외피 단백질의 선형 에피토프의 효율적인 식별을위한 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은 단클론 항체 제조, 건설, 직렬로 절단 된 재조합 단백질의 발현, 합성 중복 펩티드 디자인, 도트 오 하이브리드, 알라닌 검색 및 치환 돌연변이를 포함한다. 펩티드 합성의 높은 비용을 고려하면, 연속적으로 소망하는 목적 단백질의 재조합 단백질을 절단하는 단계는, 수정하고, 합성 펩티드 배열 도트 블롯 분석이 수행되기 전에 항원 성 영역은 약 100 내지 200 AA 잔기 좁혀졌다.

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM medium</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos&#039;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EP0502&amp;nbsp;</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>XhoI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>pET-20b(+) vector</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH-5&amp;alpha; competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL-21(DE3) competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB broth&amp;nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthio-&amp;beta;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

면역 시스템에 의해 항원 성 에피토프의 확인은 백신 펩타이드 약물의 개발을 용이하게 할 수있다 중화 항체의 보호 메커니즘을 이해할 수있다. 펩티드 스캐닝 노골적 모노클로 날 항체 (단클론 항체)에 의해 인식되는 선형 에피토프를 맵핑하는 간단하고 효과적인 방법이다. 여기에서, 저자는 중화 단클론 항체를 이용하여 신경 괴사 바이러스 코트 단백질의 항원 인식 직렬 절두 재조합 단백질, 합성 펩티드 설계, 도트 블롯 혼성화를 포함하는 에피토프의 결정 방법을 제안한다. 이러한 기술은 폴리 비닐 리덴 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 합성 펩티드 및 모노클로 날 항체의 도트 블롯 하이브리드 화에 의존한다. RG-M56 단클론 항체에 의해 인식 바이러스 외피 단백질 항원의 최소 영역은 6 량체 펩티드 에피토프에 펩티드 맵핑을 트리밍 단계별로 좁힐 수있다. 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 및 잔여 서브stitution는 에피토프를 구성하는 각각의 아미노산 잔기의 중요성 결합을 특징으로 수행 될 수있다. 에피토프 부위를 플 랭킹 잔기가 펩타이드 형태의 조절에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 동정 된 에피토프 펩티드는 X- 선 회절 연구 및 기능적 경쟁 또는 치료학 대한 에피토프 펩타이드 - 항체 복합체의 결정을 형성하는데 사용될 수있다.

이 실험의 목표는 단클론 항체를 이용하여 블롯을 통해 도트 에피토프를 확인 하였다. 신속하고 효율적으로 단클론 항체에 의해 인식되는 항원 영역을 좁히기 위해, C 말단에 6xHis 융합 태그의 전체 길이와 직렬로 절단 YGNNV 재조합 코트 단백질은 대장균 PET 발현 시스템 (10) (도 1a)에서 발현되었다. 생성 된 재조합 단백질은 도트 블롯 ?...

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Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K 조회수.  Academia Sinica. Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

연구

생화학

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

면역학 및 감염병학

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules play important roles in surveying cells for structural and functional integrity, inducing immune regulation, and limiting immune responses to viral infections. Additionally, functional augmentation of Qa-1-restricted CD8+ T cells through epitope immunization has shown therapeutic effects in several autoimmune disease animal models, e.g. experimental allergic encephalomyelitis, collagen-induced arthritis, and non-obese diabetes. Therefore, there is an urgent need for a method that can efficiently and quickly identify functional Qa-1 epitopes in a protein. Here, we describe a protocol that utilizes Qa-1-restricted CD8+ T cell lines specific for an overlapping peptide (OLP) library for determining Qa-1 epitopes in a protein. This OLP library contains 15-mer overlapping peptides that cover the whole length of a protein, and adjacent peptides overlap by 11 amino acids. Using this protocol, we recently identified a 9-mer Qa-1 epitope in myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). This newly mapped MOG Qa-1 epitope was shown to induce epitope-specific, Qa-1-restricted CD8+ T cells that enhanced myelin-specific immune regulation. Therefore, this protocol is useful for future investigation of novel targets and functions of Qa-1-restricted CD8+ T cells.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b molecules. Immunization with Qa-1-binding epitopes has been shown to augment tissue-specific immune regulation and ameliorate several autoimmune diseases. Herein we describe an overlapping peptide library strategy for the identification of Qa-1 epitopes in a protein.

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and the use of four-arm, fluorescent PEG-antigen conjugates to selectively identify antigen-specific B cells through avid engagement with cognate B cell receptors. Using modular click chemistry and commercially available fluorophore kit chemistries, we demonstrated the versatility of preparing customized fluorescent PEG-conjugates by creating distinct arrays for proteolipid protein (PLP139-151) and insulin, which are important autoantigens in murine models of multiple sclerosis and type 1 diabetes, respectively. Assays were developed for each fluorescent conjugate in its respective disease model using flow cytometry. Antigen arrays were compared to monovalent autoantigen to quantify the benefit of multimerization onto PEG backbones. Finally, we illustrated the utility of this platform by isolating and assessing anti-insulin B cell responses after antigen stimulation ex vivo. Labeling insulin-specific B cells enabled the amplified detection of changes to co-stimulation (CD86) that were otherwise dampened in aggregate B cell analysis. Together, this report enables the production and use of fluorescent antigen arrays as a robust tool for probing B cell populations.

This protocol details the customizable production and use of fluorescent probes for labeling antigen-specific B cells.

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and ...

생체공학

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct functional subsets based on the cytokines they secreted: for example, IFN-&#947; for CD4 T helper 1 cells, IL-4 and IL-13 for CD4 T helper 2 cells, IL-21 for CD4 T follicular helper cells, and IL-17 for CD4 T helper 17 cells. Analysis of hepatitis B virus (HBV)-specific CD4 T cells based on cytokine secretion after HBV-derived peptides stimulation could provide information not only about the magnitude of HBV-specific CD4 T-cell response but also about the functional subsets of HBV-specific CD4 T cells. Novel approaches, such as transcriptomics and metabolomics analysis, could provide more detailed functional information about HBV-specific CD4 T cells. These approaches usually require isolation of viable HBV-specific CD4 T cells based on peptide-major histocompatibility complex-II multimers, while currently the information about HBV-specific CD4 T-cell epitopes is limited. Based on an HBV-derived peptide matrix, a method has been developed to evaluate HBV-specific CD4 T-cell responses and identify HBV-specific CD4 T-cell epitopes simultaneously using peripheral blood mononuclear cells samples from chronic HBV infection patients.

Based on a hepatitis B virus (HBV)-derived peptide matrix, HBV-specific CD4 T-cell responses could be evaluated in parallel with identification of HBV-specific CD4 T-cell epitopes.

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

생물학

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

요약

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펩 티 드 선호도 시 약 검색 및 분석 결과 분리의 세균성 디스플레이 라이브러리의 반자동된 Biopanning

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

고래 마이오글로빈의 검출을위한 콜로이드 골드 기반 면역 크로마토 그래피 테스트 스트립의 개발

펩타이드 모노클로 날 항체 인식 선형 B 세포 에피토프의 확인을 스캔 보조

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장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

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농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

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펩티드 에피토프의 정량 분석을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석