자연에서 Cas9는 진화가 자발적인 돌연변이로 바이러스 DNA를 갈라질 수 있는 난잡한 특이성을 가진 Cas9를 선호하는 침입 바이러스에 대한 면역 단백질입니다. 우리는 높은 특이성을 가진 최적화된 Cas9 변종을 선호하는 인공 지향 진화 시스템을 구축했습니다. 부정과 긍정적 인 선택은 모두 스나이퍼 스크리닝 시스템에서 동시에 작동합니다.
대상 활동이 감소한 Cas9 변형도 대상 활동을 한 번에 선별할 수 있습니다. 돌연변이는 무작위로 전체 Cas9 서열에 도입되어 선별될 라이브러리를 생성하였다. 그리고 이것은 예기치 않은 위치에서 돌연변이를 찾아내도록 가능하게 했습니다.
현재, 학계와 업계의 많은 연구자들은 치료 개발을 위해 Y 형 Cas9을 사용하고 있습니다. 그러나 Y형 Cas9의 특이성은 최적화되지 않아 단단히 포장될 수 있습니다. 인간에서, 이것은 심각한 부작용으로 이끌어 낼 수 있는 무작위 유전자에 있는 예기치 않은 돌연변이를 의미합니다.
치료에서 개발 되 고 효소 처럼 많은 Cas9 있다. 우리의 기술은 CPF1과 같은 지핑거, 태국 및 Cas9와 같은 그밖 DNA 및 핵의 특이성을 향상하기 위하여 이용될 수 있습니다. 라이브러리를 충분히 크게 만드는 것은 중요한 기능을 가진 변형을 얻을 수있는 가능성을 높이는 열쇠입니다.
냉각 단계에서 높은 효율을 얻고 매우 효율적인 유능한 셀을 사용해야 합니다. 이 절차를 시작하려면 CCDB 플라스미드와 SGRNA 플라스미드의 나노그램 1개를 해동된 BW25141 GOI 세포의 50 마이크로리터에 이중 불일치를 추가합니다. 파이펫팅으로 세포를 부드럽게 섞어 0.1센티미터의 전기기큐벳으로 옮춥니다.
전기포공을 통해 두 플라스미드로 대장균을 변형시키면 됩니다. 전기 포이션이 완료된 직후 SOC 배지 250마이크로리터를 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫하여 세포와 배지를 혼합하고 혼합물을 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 전달합니다.
변형 된 세포를 복구하고 1 시간 동안 부드러운 흔들림과 함께 섭씨 32도에서 배양하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Snyper 스크리닝 셀을 계속 준비합니다. 스니퍼 스크리닝을 수행할 준비가 되면, 이전에 설명된 엘클로포레이션 프로세스를 사용하여 각 라이브러리에서 제조된 Cas9 변종 플라스미드의 100나노그램으로 스니퍼 스크리닝 세포를 변환한다.
그런 다음, 세포의 250 마이크로리터를 신선한 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 밀리리터당 10 나노그램의 최종 농도에 ATC 250 피코그램을 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 1시간 동안 섭씨 32도에서 배양하여 ATC 함유 및 ATC 가 없는 세포를 모두 복구합니다.
클로람페니콜과 카나마이신을 함유한 LB 한천 플레이트에 회수된 ATC 가루 세포의 25마이크로리터플레이트. 245mm LB 한천 플레이트에 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도에 세포를 함유하는 회수된 ATC에 ATC를 추가합니다. 즉시 클로람페니콜, 카나마이신 및 아라비노스를 포함하는 플레이트를 포함하는 LB 천에 ATC 함유 세포를 플레이트.
모든 접시를 섭씨 32도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 접시를 촬영합니다. 개방형 CFU 소프트웨어를 사용하여 실행 가능한 식민지 수를 계산하여 비선택적 플레이트의 식민지 수가 라이브러리의 다양성보다 최소 10배 더 큰지 확인하여 모든 변형을 다룹니다.
세 개의 라이브러리에서 선택적 판에 살아남은 식민지를 당깁니다. 이 풀이 풀린 식민지를 LB 배지 250밀리리터로 옮기고, 클로람페니콜로 보충하고, 하룻밤 사이에 섭씨 42도에서 배양합니다. 먼저 대상 사이트를 선택하려면 Cas OF 파인더 소프트웨어를 로드합니다.
Cas9의 특정 유형및 표적 게놈에 적합한 PAM 유형을 선택합니다. 쿼리 시퀀스 탭을 입력합니다. 불일치 번호를 선택하고 제출 버튼을 클릭합니다.
몇 초 후 대상 및 오프 타겟 사이트가 나타납니다. 일반적으로 1~3개의 불일치가 있는 오프 타겟 사이트를 선택합니다. 다음으로, CRRNA와 트랙 RRNA 올리고를 템플릿 시퀀스와 함께 주문하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 템플릿을 증폭시합니다.
증폭된 템플릿 DNA의 2개의 마이크로리터를 분석한 다음 2%의 아가로즈 젤을 분석한 다음 템플릿을 정화합니다. 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, DNAse의 0.5 마이크로 리터를 추가하고 15 ~30 분 동안 섭씨 37도에서 배양 한 다음 SGRNA를 정화합니다.
그런 다음, 10 마이크로그램의 종아리 장 알칼리인 인산염을 섭씨 3도에서 3시간 동안 250단위로 전사한 RNA를 치료하고, 100단위의 RNA 억제제가 있는 경우, 처리된 SGRNA를 정화한다. 먼저, DMEM에서 HEK293 T 세포를 유지하여 이산화탄소5%를 가진 섭씨 37도에서 10%의 FBS와 1%의 항생제를 보충합니다. 다음으로, 야생 타입 또는 Snyper Cas9 단백질 의 2 마이크로그램을 SGRNA 2마이크로그램과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 배양하여 RNP 복합체를 만듭니다.
트립시닉하고 세포를 계산한 다음 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기 화 완충제에서 준비합니다. RNP 복합체를 30밀리초 동안 1300볼트의 1펄스를 사용하여 세포로 전기포전을 합니다. 전기 기화 직후, DMEM의 500 마이크로 리터로 채워진 48 웰 플레이트에 세포를 판화하여 10 %의 FBS와 1 %의 항생제로 보충합니다.
이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다. DMEM에서 HEK293 T 세포를 유지하여 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도에서 10%의 FBS와 1%의 항생제를 보충합니다. 배분 전날, 시험대와 셀카운트.
48웰 척도에서 작업하는 경우, 플레이트 10, 000 셀 당 우물 당 및 완전한 성장 매체의 250 마이크로 리터. 지질 기반 형질 전환 시약을 사용하여 250 나노그램의 P3S Cas9 플라스미드와 250 나노그램의 SGRNA를 트랜스펙트용으로 준비합니다. 그런 다음, 혈청이없는 MEM의 25 마이크로 리터에 플라스미드를 혼합합니다.
혈청이 없는 MEM 의 25 마이크로리터로 1마이크로리터의 트랜스페션 시약을 희석시. 이 혼합물을 실온에서 5분간 배양합니다. 플라스미드 혼합물을 트랜스페션 시약 혼합물과 결합하고 20분 동안 방에서 배양하여 플라스미드 리포펙타민 복합체를 형성합니다.
그 후, 이 혼합물의 50 마이크로리터를 각 우물에 직접 첨가하여 세포를 함유하고 있다. 접시를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 섞습니다. 트랜스 유전자 발현에 대한 속담 전에 48~72시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양한다.
이전에 준비된 게놈 DNA를 격리한 후, GDNA의 PCR 증폭에 의해 심층 시퀀싱 라이브러리를 생성하고 표적 및 오프 타겟을 대상으로 하는 프라이머를 생성합니다. 그런 다음 인덱스 프라이머를 사용하여 각 샘플에 레이블을 지정합니다. 차세대 시퀀싱 기계를 사용하여 풀 라이브러리를 페어링된 끝 시퀀싱으로 조정합니다.
스니퍼 스크린이 수행된 후, 선택적 LB 플레이트상의 콜로니 수를 비선택적 LB 플레이트상의 콜로니 수로 나누어 생존 식민지의 백분율을 계산할 수 있다. 이 비율은 일반적으로 SP Cas9 라이브러리로 수행할 때 매우 낮지만, 생존 풀로 화면을 반복하여 실제 포지티브 히트를 풍부하게 할 수 있습니다. 대표적인 스니퍼 스크린은 제3화면 이후에 100%의 생존율을 얻어낸다.
RNP 또는 플라스미드 인코딩된 Snyper Cas9를 사용하는 트랜스포이션은 다양한 표적에 대해 수행될 수 있으며, 표적 증폭기 시퀀싱에 의해 측정된 결과 대상 및 오프 타겟 활동에 대해 수행할 수 있습니다. 대부분의 대상에서 Snyper Cas9는 야생 유형에 비해 대상 활동과 더 높은 특이성 비율을 보여줍니다. 잘린 SGRNAs는 특이성을 더욱 향상시키는 데 사용할 수도 있습니다.
첫 번째 세척 단계에서 높은 변환 효율은 높은 특이성을 가진 클론을 잃지 않는 것이 매우 중요합니다. 나중에 스크리닝 단계는 클론이 이미 첫 번째 스크리닝 단계에서 풍부하기 때문에 변환 효율이 낮아지며 손실 가능성이 적습니다. 스니퍼 화면에서 발견된 복제본이 하나 이상 있습니다.
이러한 클론의 대상 및 오프 타겟 활동은 최상의 성능으로 클론을 선택하는 가능한 한 많은 다른 대상을 특징으로한다. 이 방법을 통해 과학자들은 대상 활동의 손실없이 Cas9와 같은 효소의 특이성을 향상시킬 수 있습니다. 또한 과학자들은 개선을 위해 단백질 구조에 대한 사전 지식이 필요하지 않습니다.
