이 프로토콜은 특수 장비를 사용하지 않고 3D 세포 배양 모델의 신뢰성을 향상시키는 간단한 방법을 사용합니다. 이 기술의 주요 장점은 입방 장치 내의 초기 배양 상태를 제어하여 반복 가능한 3D 배양 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. 5 mm 5 mm 폴리 카보네이트 입방 프레임을 준비 한 후, 미리 냉각 된 슬라이드와 얼음 상자에 프레임을 배치하고 피펫을 사용하여 입방 프레임의 상단 면에서 1.5 % 아가로즈의 12 마이크로 리터를 하단 표면에 추가합니다.
아가로즈를 확산하여 평평한 표면을 얻고 중합체가 치료할 수 있도록 한다. 핀셋을 사용하여 프레임을 유리 가장자리로 밀어 넣고 프레임을 회전하여 프레임을 슬라이드에 다시 배치하기 전에 열린 쪽을 아래로 향하도록 합니다. 프레임의 다음 두 표면을 더 많은 아가로즈로 채운 후, 방금 설명했듯이, 아가로즈를 열린 얼굴에서 용기에 떨어뜨려 네 번째와 다섯 번째 면에 아가로즈 벽을 형성합니다.
초기 세포 클러스터 형상을 설정하려면 하이브리드 젤 큐브 배양 공간에 관심 있는 세포 배양에 적합한 세포외 매트릭스를 주입하고 조각된 마이크로 몰드를 큐브에 설정한다. 그런 다음 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 25분 동안 배치합니다. 세포 외 매트릭스가 경화되면 매트릭스가 악화되지 않도록 마이크로 몰드를 조심스럽게 들어 올립니다.
원하는 금형 모양의 포켓은 세포 외 매트릭스에서 제작됩니다. 세포를 로드하기 위해 적절한 실험 세포 배양 배지에서 원심분리 후 실험 세포 현탁액을 농축하고 세포 외 매트릭스 내의 포켓에 세포를 주입한다. 큐브를 이산화탄소 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 큐브를 배치하여 세포가 세포외 매트릭스 주머니에 빠질 수 있도록 하여 마이크로 몰드에 의해 생성된 공간을 채웁니다.
인큐베이션의 끝에, 큐브를 24웰 플레이트의 1웰에 넣고 적절한 세포 배양 배지의 100 마이크로리터를 우물에 첨가한다. 추가 세포 외 매트릭스를 주입하여 주머니를 닫고 큐브를 인큐베이터로 25 분 동안 반환합니다. 세포외 매트릭스가 경화되면 섭씨 20도의 약 10 마이크로리터가 큐브에 상부 표면에 떨어뜨려 표면을 닫고 섭씨 37도에서 10~20분 동안 낙하를 치료한다.
그런 다음 큐브 내의 세포에 영양전달을 용이하게 하기 위한 삼투압을 촉진하기 위해 신선한 배지로 큐브 전체를 덮습니다. 다방향 관찰에 의한 비침습적 3D 형상 인식의 경우, 플레이트를 현미경 단계에 배치하고 핀셋을 사용하여 큐브 서비스를 회전시켜 캡처 사이에 이미지화하여 밝은 필드 또는 위상 대비 현미경으로 큐브의 각 측면의 이미지를 얻습니다. 다방향 관찰에 의한 면역형성 이미징의 경우, 먼저 큐브를 함유하는 우물에서 상류체를 흡습하고 실온에서 20분 동안 4%파라포름알데히드로 큐브를 고정시한다.
고정이 끝나면 PBS로 큐브를 두 번 세척한 후 10분간 세척합니다. 큐브를 0.5% 트리톤 x-100, PBS는 섭씨 4도에서 10분 동안 접종합니다. 다음으로, PBS에서 세척당 10분 동안 큐브를 세 번 세척한 후, 상온에서 염소 혈청 및 면역 형광 완충제와의 비특이적 결합을 차단합니다.
그런 다음 표준 항체 염색 프로토콜에 따라 관심있는 적절한 1 차 항체로 세포를 얼룩지게한다. 그런 다음 레이저 또는 형광 현미경으로 큐브의 모든 6 면을 이미지화합니다. 이러한 대표적인 실험에서 정상적인 인간 기관지 상피 세포로 배양된 하이브리드 젤 큐브의 다방향 이미징은 배양물의 위상 대비 및 면역형이미징에 의한 초기 원통형 또는 프리즘 형 세포 배양의 생성을 보여준다.
여기서 는 하이브리드 겔 큐브에서 원통형 형상으로 처음 조절된 정상 인간 상피 세포의 면역 염색이, 기관지 나무의 생성 후 나타난다. 가지는 다차원 이미징에 의해 드러난 원통형 축에 수직을 보여줍니다. 세포의 낮은 밀도가 인큐베이션 후 세포 품질의 저하를 초래할 수 있기 때문에 세포 외 매트릭스 포켓에 세포의 고밀도를 주입하는 것이 중요합니다.
이러한 방법 패턴은 다방향 이미징에 의한 정량적 측정을 통해 3D 세포 패턴의 반복 형성으로 식기 개발 메커니즘을 연구한다.
