CMOD 팩을 사용하면 매우 높은 정밀도로 세포를 패턴화하고 2d 또는 3d로 배양 할 수 있습니다. 이것은 세포 세포 상호 작용 및 엔진 새로운 조직의 형태 발생을 연구하는 기회를 엽니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 실험실을 채택하기 쉽고 깨끗한 방, 특수 장비 또는 맞춤형 합성 시약을 필요로하지 않는다는 것입니다.
일회용 파이펫을 사용하여 알데히드 슬라이드에 저항하는 양수 사진의 작은 방울을 떨어뜨리는 것으로 시작합니다. 스핀 코더를 사용하여 3000 RPM에서 슬라이드를 30초 동안 돌린 다음 1.5분 동안 섭씨 100도 핫 플레이트에 놓고 사진 저항을 교차연결합니다. 핫 플레이트에서 슬라이드를 제거하고 슬라이드 위에 원하는 기능을 갖춘 사진 마스크를 놓고 유리 조각으로 무게를 측정하고 불투명한 상자에 전체 설정을 덮습니다.
2 분 동안 UV 램프로 설정을 노출하고 3 ~ 5 분 동안 개발자 솔루션에 몰입하여 슬라이드를 개발한 다음 여분의 개발자 솔루션을 물로 헹구고 공기 또는 질소 스트림 아래에서 건조시십시오. 현미경으로이 빛을 관찰하여 사진 리소그래피의 성공을 확인하고 어둠 속에 보관하십시오. 슬라이드의 각 사진 패턴 영역에 20 마이크로몰라 아민 변형 올리고스 용액의 방울을 추가하고 피펫 팁을 사용하여 전체 지역에 부드럽게 방울을 확산, 슬라이드를 긁지, 신경, DNA 솔루션이 완전히 건조 될 때까지 섭씨 65도 오븐에서 슬라이드를 굽고, 구운 슬라이드와 15 센트 식기계 후드에 환원 아미네이션을 수행 셰이커의.
부드럽게 혼합 100 나트륨 보로 수화물의 밀리그램 40 PBS의 밀리리터와 접시에 추가. 그런 다음 셰이커를 15분 동안 켭니다. 반응 후, 이 슬라이드를 0.1%의 나트륨 도데딜 황산염으로 두 번 세척하여 반응되지 않은 DNA를 제거합니다.
그런 다음 슬라이드를 물로 세 번 씻습니다. 질소 또는 공기의 스트림 에서이 슬라이드를 운전. 마지막으로 아세톤으로 헹신후 남은 사진 저항을 제거합니다.
텍스트 원고에 설명된 대로 4개의 마이크로몰러 범용 앵커 및 어댑터 솔루션을 준비하고 PBS에서 20마이크로몰러 범용 공동 앵커 솔루션을 준비한다. 얼음 차가운 PBS 또는 혈청 무료 매체의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 재보중단하고 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브 원심분리기로 1~300만 개의 세포를 이송하여 세포 현탁액을 준비한다. 원심분리기는 4분 동안 160배 G로 합니다.
얻어진 세포 펠릿을 75마이크로리터의 얼음 냉온 PBS 또는 혈청 프리 미디어에 재중단하고 마이크로몰라 범용 앵커 및 어댑터 용액을 위해 준비된 75마이크로리터를 추가한다. 얼음에 5분간 철저히 섞고, 보편적인 공동 앵커 용액 15마이크로리터를 튜브에 넣고 철저히 섞은 다음, 얼음 위에 샘플을 5분간 배양합니다. 셀 서스펜션에서 과도한 올리고를 제거하려면 얼음 차가운 PBS 또는 혈청 프리 미디어를 튜브에 넣고 파이펫과 섞습니다.
섭씨 4도에서 4분간 160회 G에서 원심분리를 한 다음, 상퍼를 폐기하여 세포를 원심분리하여 펠릿을 놓습니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 얼음 콜 PBS 또는 혈청 프리 미디어에서 세포를 다시 일시 중단하여 밀리리터 당 적어도 2,500만 개의 세포의 세포 조밀한 용액을 생성하고 패턴 슬라이드를 약간 기울인 다음 각 유류 셀의 입구에 이 셀 서스펜션의 25 마이크로리터를 추가합니다.
콘센트에서 PBS 및 1%BSA 용액을 제거하여 셀 서스펜션이 PDM 흐름 셀을 채울 수 있도록 합니다. 얼음 또는 실온에서 30초 동안 배양하고, 슬라이드 의 출구에서 셀 서스펜션의 5마이크로리터를 흡증하고 입구에 다시 추가합니다. 흐름 셀당 10회 반복합니다.
부드럽게 파이펫 PBS 또는 혈청 무료 매체는 각 유량 셀의 입구로 들어가 여분의 세포를 씻어 내고 출구에서 세포 현탁액을 수집합니다. 초과 셀이 슬라이드에 남아 있지 때까지 이 것을 2~4회 반복합니다. 3d 배양의 경우 2%DN을 포함하는 하이드로 젤 전구체 용액을 준비하고 각 유류 셀의 입구에 50 마이크로리터를 추가합니다.
출구에서 과도한 유체를 흡인하여 하이드로겔 용액을 유량 셀로 유도합니다. 하이드로겔이 세포와 표면 사이의 DNA 기반 접착력을 설정하고 갈라놓을 수 있도록 30~45분 동안 37°C에서 슬라이드를 배양합니다. 하이드로 젤 전구체 50마이크로리터를 2개의 웰 챔버 슬라이드 또는 6개의 웰 플레이트에 넣습니다.
각 유량 셀의 양쪽에 PBS의 파이펫 10 마이크로 리터. 면도날을 사용하여 유동 셀의 전체 길이를 따라 분배하거나 점 핀셋을 찾아 부드럽게 유동 셀의 측면을 들어 올려 PBS가 하이드로 젤 아래 서두르게 합니다. 면도날을 사용하여 슬라이드를 반전하여 흐름 셀을 슬라이드 가장자리로 이동하여 슬라이드에서 유동 셀을 밀어 주어 면도날 위에 착륙합니다.
곡면 집게를 사용하여 면도날에서 유동 셀을 선택합니다. 유동 셀을 반전하여 셀이 바닥에 있고 하이드로 젤 전구체 용액의 액적 위에 놓습니다. 패턴 세포를 함유하는 하이드로겔이 하이드로겔 밑줄에 결합하여 패턴 세포의 전체 포함을 초래할 수 있도록 적어도 30분 동안 배양한다.
흐름 셀을 제거하고 미디어에 완전히 담그지. 곡면 집게를 사용하여 유동 셀을 부드럽게 움직여 튀어나와 미디어에 떠서 버린 다음 버립니다. CMO 표지 된 세포에 대한 DNA 스팟 접지 접착의 정량화는 증가합니다.
CMO 농도의 함수로서 3개의 실험으로부터의 평균 및 표준 편차로 표현된다. DNA 패턴은 CMO의 다른 농도에서 시안에 있는 마젠타 및 부착된 CMO 표지된 세포에서 도시됩니다. 선형 DNA 패턴에 부착된 CMO 표지된 허벡및 LMO 표지된 허벡의 비교가 여기에 도시된다.
단일 MDCKs 패턴 VSC MOD 팩, 마이트르 젤로 전송5 일 문화 후 확산 및 편광 할 수 있었다. 다층다세포 골재는 무료 CMO로 표시된 세포의 층을 번갈아 만들어 만들었습니다. 여러 고유 세포 인구는 고정밀 및 교차 오염 없이 함께 패턴화될 수 있습니다.
이 프로토콜을 시도할 때, 세포가 DNA 반점에 달라붙는 기회를 최대화하기 위해 슬라이드에 세포를 추가하는 동안 조밀한 세포 현탁액을 갖는 것이 중요합니다.
