이 프로토콜은 샘플 수집에서 준비에 이르기까지 진균종속영양 식물의 곰팡이 집락화를 이해하기 위해 적용되는 다양한 현미경 기술을 제시하고 필수 단계를 포함합니다. 이러한 기술은 다양한 진균 종속 영양 식물, 심지어 진균 종속 영양 이외의 식물 재료에도 적용될 수 있습니다. 이 방법은 주로 구조 식물학과 관련이 있으며 균근 상호 작용, 생리학, 생식 생물학, 진화 및 진균 종속 영양 식물의 생태학에 대한 통찰력을 제공 할 수도 있습니다.
시작하려면 지하 장기를 손상시키지 않도록주의하면서 식물 기반 주변의 토양을 탐색하여 진균 종속 영양 식물을 수집하십시오. 또한 지하 기관에서 공중 기관이 분리되는 것을 방지하기 위해 땅에서 식물을 당기지 마십시오. 조심스럽게 원예 흙손을 사용하여 공중 구조물 주변을 파고 뿌리, 줄기, 뿌리 줄기 및 저장 기관과 같은 지하 기관을 이러한 구조물을 손상시키지 않고 탐험하십시오.
깨지기 쉬운 구조를 보존하기 위해 토양 입자를 제거하고 샘플을 고정하기 전에 수돗물로 이러한 장기를 섬세하게 씻어 나머지 토양 입자를 헹굽니다. 잎 깔짚과 관련된 Mycoheterotrophic 식물은 특별한주의를 요구합니다. 따라서 연결된 구조물에서 끌어 당기지 않고 균사를 통해 분해 물질에 연결된 섬세한 기관을 조심스럽게 수집하십시오.
이러한 연결이있는 구조물을 보존하고 분석을 위해 깔짚을 수집하십시오. 투과 전자 현미경 분석을 위해, 글루타르알데히드 나트륨 카코딜레이트 완충액 한 방울 안에 있는 3 내지 4-밀리미터 두께의 샘플을 1 내지 2-밀리미터 두께의 더 작은 섹션으로 분할한다. 드롭 외부의 절단면을 버립니다.
식물 수집 직후 수집 장소에서 고정 과정을 수행하십시오. 첨가제 고정물이므로 시료의 부피보다 10배 이상 큰 고정제 부피의 수집 튜브로 섹션을 즉시 옮깁니다. 장기의 표면 균사, 특히 지하 균사 및 잎 깔짚과 접촉하는 균사의 표면 분석.
해부 현미경으로 신선하거나 고정된 물질을 7.5배 이상의 배율로 관찰합니다. 표면 균사와 rhizomorphs에 의해 안내되는 관심 영역을 검색하십시오. 표면성 근형의 영역을 포함하는 샘플을 선택하여 뿌리와 줄기의 피질 세포 내에서 펠로톤과 균사 코일을 시각화할 수 있습니다.
텍스트 원고에 설명 된대로 0.1 몰 인산염 완충액에 밀 배아 응집소 형광 색소 접합체 밀리리터 당 0.2 밀리그램과 1 % 칼코 플루오르 백색 용액을 준비하십시오. 이제 유리 슬라이드의 섹션을 밀 배아 응집소 형광 색소 접합체 용액으로 30 분 동안 적절하게 덮어서 배양하십시오. 배양 후, 0.1 몰 인산염 완충액으로 섹션을 세척하고 장착 매체로서 칼코 플루오르 용액에서 배양한다.
그런 다음 슬라이드 위에 커버 슬립을 놓고 표시된 필터를 사용하여 컨포칼 또는 형광 현미경으로 관찰합니다. 샘플을 고정하고 탈수를 수행하고 70 % 에탄올에 보관 한 후 날카 롭고 새로운 면도날을 사용하여 일방 통행으로 절단하여 주사 전자 현미경 분석을 위해 원하는 표면을 노출시킵니다. 필요한 경우 실체 현미경을 사용하여 샘플을 선택하고 샘플 크기를 결정하는 동안 금속 스터브 영역을 고려하십시오.
또한, 에탄올 계열의 샘플을 탈수시킨다. 작고 섬세한 샘플은 각 농도에서 30분 동안 유지하고 크고 밀도가 높은 샘플은 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 티슈 페이퍼를 사용하여 작은 봉투를 접어 다음 단계를 위해 샘플을 구성합니다.
더 큰 샘플은 봉투 없이 처리할 수 있습니다. 연필을 사용하여 봉투에 라벨을 붙이고 샘플 로그를 보관하십시오. 조심스럽게 붓을 사용하여 봉투 안에 샘플을 넣으십시오.
이제이 샘플을 절대 에탄올에 보관하십시오. 표준 작동 절차에 따라 임계점 건조기를 작동하여 임계점 건조를 즉시 진행하십시오. 이를 위해 시료 홀더의 무수 에탄올에 시료를 넣고 임계점 건조기의 압력 챔버 안에 두십시오.
중간 유체는 임계 이산화탄소 지점에서 전이 유체에 용해되어 샘플을 건조시킵니다. 대기 습도의 재흡수는 샘플을 파괴할 수 있으므로 임계점 건조 직후 건조 용기에 보관하십시오. 금속 스터브에 샘플을 장착하기 전에 장갑을 끼고 스텁을 조작하십시오.
아세톤에 5 분 동안 담그면 지방이 제거되고 건조됩니다. 실체 현미경으로 전도성 양면 탄소 접착 테이프를 사용하여 샘플을 스터브에 고정하고 위치를 지정합니다. 위의 사이트는 주사 전자 현미경 이미지에서 가능한 유일한 관점입니다.
샘플을 조작하려면 미세 포인트 핀셋을 사용하십시오. 핀셋으로 만진 샘플 부품은 일반적으로 손상됩니다. 따라서 조심하고 관심 영역에서 멀리 떨어진 부분을 만지십시오.
실리카겔로 밀봉 된 페트리 접시에 샘플이있는 스텁을 유지하십시오. 다음으로, 표준 작동 절차에 따라 불활성 가스의 저압 분위기에서 샘플 표면에 금 또는 백금 층을 증착하기 위해 스퍼터 코팅을 진행합니다. 코팅 두께는 샘플의 지형에 따라 다르며 일반적으로 15-40 나노 미터입니다.
마지막으로, 코팅된 스터브를 실리카겔이 습도를 유지하는 밀봉된 페트리 접시에 보관합니다. 샘플은 몇 주 동안 이런 식으로 보관할 수 있습니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 샘플을 분석하십시오.
주사 전자 현미경 검사 중에 전자빔이 진공 내 샘플에 부딪히고 이러한 상호 작용으로 인한 신호 방출은 이미지로 해석됩니다. 씨앗의 공생 발아에 사용되는 용액과 재료가 멸균되었는지 확인하십시오. 오염을 피하기 위해.
섭씨 121도에서 20분 동안 오토클레이브하여 시작합니다. 층류 후드에서 과일과 씨앗을 2% 활성 염소를 포함하는 차아염소산나트륨 용액에 담그어 표면적으로 소독합니다. 얇고 깨지기 쉬운 씨앗은 1:1 희석된 차아염소산나트륨 용액에 담글 수 있습니다.
소독 후 종자를 xerographic 직물을 사용하여 여과하여 회복시킵니다. 발아 시험을 진행하기 전에 고압 멸균 증류수에서 과일과 씨앗을 세 번 씻어 차아 염소산염 용액을 제거하십시오. 필요한 경우 섭씨 4 도의 실리카겔이 함유 된 유리 플라스크 내부의 여과지 봉투에 보관하고 플라스크를 밀폐하고 달라 붙는 필름으로 밀봉 한 다음 마지막 세척에서 감자 포도당 한천으로 몇 방울의 물을 옮겨 세척 과정의 효과를 평가하십시오.
난초 씨앗의 공생 발아를 위해, 오트밀 한천 배양 배지가 들어있는 페트리 접시에 놓인 1-2 센티미터의 오토 클레이브 여과지 디스크 위에 씨앗을 배양하십시오. 이제 페트리 접시의 중앙에 선택한 분리 된 균체에서 균사체가 들어있는 배양 배지 조각을 접종하십시오. 페트리 접시를 달라 붙는 필름으로 밀봉하고 곰팡이 성장에 따라 섭씨 25도 또는 실온의 어둠 속에서 배양하십시오.
발아 테스트를위한 음성 대조군으로 씨앗과 곰팡이 접종없이 일부 요리를 준비하십시오. 정량적 및 정성적 데이터를 수집하고 원형과 묘목을 촬영하여 매주 발아 결과를 분석합니다. rhizomorphs는 일반적으로 어둡고 신발 끈과 같은 구조로 쉽게 인식 할 수 있습니다.
10 마이크로 미터보다 두꺼운 섹션을 얻는 자유형 또는 기타 방법은 펠로톤을 더 잘 표현하고 식민지화의 곰팡이 패턴에 대한보다 대표적인 이미지를 제공 할 수 있습니다. 자유형 섹션은 또한 더 높은 증폭에서 균사 분석에 적합할 수 있습니다. 그러나 세부 사항은 더 얇은 섹션에서 더 잘 달성됩니다.
목부 요소의 2 차 세포벽은 톨루이딘이 획득 한 밝은 색으로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 한편, 일차 세포벽으로만 구성된 체관 요소는 더 얇고 어두운 세포벽으로 식별됩니다. 자가형광에 의한 인공물은 글리콜 메타크릴레이트 수지 절편에서 볼 수 있다.
이러한 인공물은 일반적으로 형광 색소 농도와 관련이 있으며 완충액으로 샘플을 더 많이 세척하여 피할 수 있습니다. 뿌리의 자유형 부분은 내부 및 외부 균사를 보여줍니다. 동일한 기관은 표면에 풍부한 rhizomorphs와 개별 균사가있는 주사 전자 현미경으로 볼 수 있습니다.
대부분의 난초 종은 접종 된 곰팡이에 감염된 후 몇 주 이내에 또는 거의 한 달 이상 발아합니다. 주사 전자 현미경의 빛은 생식 생물학 또는 진균 종속 영양 식물을 조사하기 위해 꽃, 과일 및 씨앗에 적용될 수 있습니다. 씨앗의 공생 발아는 독립 영양 난초에서도 테스트 할 수 있습니다.
