초복합체는 내미토콘드리아 막의 호흡기 사슬 복합체에 의해 형성된 초분자 어셈블리입니다. 이러한 초복합체의 형성은 반응성 산소 종의 생산 감소, 안정화 및 개별 호흡기 사슬 복합체의 보다 효과적인 조립, 호흡기 사슬 활동 조절 및 내막의 단백질 응집 방지를 포함하는 몇 가지 구조적 및 기능적 이점을 부여하는 것으로 여겨진다. 초복합체의 조립 및 조성의 변화는 역동적이며, 생리적 적응 중에 관찰되는 미토콘드리아 기능의 변화뿐만 아니라 다양한 유전 및 획득 된 질병의 변화를 뒷받침하는 것으로 점점 더 나타나고 있다.
이 비디오는 하이브리드 지우기/파란색 네이티브 PAGE 프로토콜을 제공하여 정확하고 시간 효율적인 방식으로 초복합체를 해결하고 분석합니다. 이 하이브리드 클리어/블루 네이티브 PAGE 방법의 주요 장점은 기존의 파란색 및 명확한 네이티브 PAGE 프로토콜의 다양한 측면을 최적으로 결합하여 세제 및 애니온 화합물에 대한 노출을 게시된 프로토콜에 비해 최소로 줄일 수 있다는 것입니다. 대형 그라데이션 젤에서 최적의 분리 및 초복합체 분석을 달성합니다.
이 절차는 수동 기술과 신중한 실행을 필요로하는 몇 가지 섬세한 단계를 포함한다. 서면 프로토콜에 대한 시각적 지원은 기술의 구현을 용이하게 하는 중요한 팁을 제공합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 알렉산드리아입니다.
시작하려면 16, 000-G에서 1.5 밀리리터 튜브에서 동물 조직으로부터 분리된 미토콘드리아를 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상체를 버리고 미토콘드리아 펠릿을 재일시 중단하기 위해 디지오닌을 포함하는 얼음 냉기 추출 버퍼의 계산된 부피를 튜브에 추가합니다. 튜브를 미니 튜브 회전에 놓고 중간 회전 속도로 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.
원심분리기 샘플은 20, 400배-G에서 45분간 섭씨 45분 동안 용해성 조각을 제거합니다. 상체를 얼음에 새 튜브로 옮기. 전기전도가 같은 날 수행되지 않으면 샘플을 영하 80도에서 저장합니다.
주조 챔버를 엽니다. 챔버에 20센티미터 배 22 센티미터 외부 유리 판을 놓습니다. 정렬 카드를 사용하여 1.5 밀리리터 스페이서 1 세트를 배치하여 챔버의 측면과 모서리에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
이너 유리 판을 스페이서 위에 올려 젤 샌드위치를 형성하고 유리 판 위에 플라스틱 분리 시트를 놓습니다. 젤 샌드위치 조립품 3개 더 준비합니다. 챔버의 나머지 공간을 차지하기 위해 필요한 경우 아크릴 블록이나 유리 판을 더 추가합니다.
개스킷노치에 단단히 앉기 전에 홈에 파라필름 스트립을 놓습니다. 천장 판을 챔버에 놓고 6 개의 나사를 모두 조입니다. 주조 챔버를 서.
빛 믹싱 챔버에 자기 교반기와 교반 접시에 구도 를 배치합니다. 주조 챔버의 튜브를 구에 연결하여 구도 전의 구체에 연결하고 연동 펌프의 카세트에서 튜브를 고정합니다. 그라데이션 전자의 스톱콕이 닫혀 있는지 확인합니다.
4개의 젤을 주조하려면, 에를렌마이어 플라스크 2개로 4%의 60밀리리터와 12%의 젤 솔루션 60밀리리터를 준비하고, 혼합을 위해 철저히 소용돌이합니다. 4% 젤 용액을 라이트 믹싱 챔버에 붓고, 12%는 구이의 무거운 저수지 챔버에 구비하였다. 교반판의 교반 속도를 350rpm에 설정합니다.
그런 다음 스톱콕을 열고 35 rpm에서 펌프를 켭니다. 광 분수의 용액 수준이 무거운 분획보다 낮으면 펌프를 일시 중지하고 빛과 무거운 저수지 사이에 밸브 스템을 엽니다. 분수가 펌프를 평형화하고 다시 시작하게 합니다.
거품이 시스템에 들어가지 않고 유리 판 사이에 갇히지 않도록 하십시오. 그라데이션 젤이 완전히 부어지면 펌프를 멈추고 각 젤 샌드위치에 1밀리리터 물을 오버레이하여 젤의 건조를 방지합니다. 2 시간 동안 중합하게하십시오.
Erlenmeyer 플라스크에 25 밀리리터 스태킹 젤을 준비하고 잘 섞어 소용돌이합니다. 몽타주를 섬세하게 반전하여 물을 제거하고 각 젤 샌드위치에 15웰 빗을 삽입합니다. 스태킹 젤을 붓고 2 시간 동안 중합하게하십시오.
그 후, 젤과 샌드위치 클램프를 삽입하고 빗을 제거합니다. 짧은 유리 판을 아래로 향하여 냉각 코어에 젤 샌드위치를 삽입합니다. 다른 쪽에 반복하고 전기 전수기에 코어를 배치합니다.
전기 포진 탱크의 내부 챔버에 파란색 음극 버퍼 300 밀리리터를 붓습니다. 파이펫과 로딩 팁으로 우물당 75~175마이크로그램의 단백질을 적재합니다. 섭씨 4도의 차가운 방에서 전극을 전원 공급 장치에 연결하고 150 볼트로 켜고 1 시간 반 동안 젤을 실행하거나 샘플이 모두 그라데이션 젤에 들어갈 때까지 젤을 실행합니다.
별도의 우물에서 시료를 복제하여 OXPHOS 복합체의 인겔 활동 및 면역블롯 분석을 병렬로 측정할 수 있습니다. 파이펫으로 파란색 음극 버퍼를 제거합니다. 쿠마시 블루 프리 음극 버퍼 300밀리리터로 교체하고, 차가운 방에서 하룻밤 동안 200볼트에서 젤을 실행합니다.
전기 전도가 끝나기 전에 원고에 따라 겔 내 활동 버퍼를 준비하고 실온에서 어둠 속에서 유지하십시오. 전기 전도를 중지하고 젤을 검색합니다. 비닐 봉지를 잘라서 책처럼 열 수 있습니다.
차선을 자르고 젤 레인을 비닐 봉지에 옮길 수 있습니다. 열 실러를 사용하여 세 면 중 두 개를 밀봉합니다. 음의 대조군 실험이 수행되는 경우 분석 버퍼에 억제제를 추가합니다.
3개의 실험적인 견본을 위해, 인겔 활동 버퍼의 20 밀리리터를 추가합니다. 거품을 제거하고 비닐 봉지의 네 번째 면을 밀봉합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 젤 레인을 인큐베이션하고 15 분마다 확인하십시오.
인큐베이션 시간은 단백질과 복합체의 양에 따라 다릅니다. 인큐베이션 후, 피부젤레인을 물에 헹구고, 복잡한 I, 복잡한 II, 복잡한 IV 또는 검은 배경에 대한 백색 배경상에서의 이미지는 이러한 예에서, 복잡한 IV 내 겔 활성을 수행하여 신선한 마우스 간 미토콘드리아로부터 분리된 초복합체를 시각화하였다. 이 샘플에 대한 디지오닌의 최적 양은 모노머 복합 IV 및 높은 분자량 슈퍼콤플렉스의 좋은 해상도를 제공하기 때문에 그램 당 4 그램입니다.
낮은 비율로, 밴드는 명확하지 않고 전기 포진 동안 얼룩으로 해결, 반면 디지토닌의 높은 비율의 사용은 높은 분자량 초복합체의 중단으로 이어질. 한 마우스에서 분리된 간 미토콘드리아는 호흡 초복합체를 추출하기 위해 최적의 양의 디지토닌으로 처리하였다. OXPHOS 복합체의 전기 이동성은 표준 네이티브 PAGE와 비교하여 하이브리드 클리어/블루 네이티브 PAGE 조건을 사용하여 단백질을 분리할 때 쿠마시 블루의 양이 감소하여 약간 감소합니다.
이러한 이동성 변화는 복잡한 IV 단조량에 비해 크고 복잡한 V 단조로가 뒤따르고 복잡한 I.Blue 배경은 파란색 네이티브 PAGE에 비해 하이브리드 클리어 네이티브/블루 네이티브 PAGE에서 낮습니다. 파란색 네이티브 PAGE 다음 높은 배경 수준은 완전히 복잡한 II에 대한 인젤 활동 염색을 마스크하고, 복잡한 IV 디머의 활동과 관련된 배경 잡음을 향상시킵니다. 이 프로토콜의 경우, 다양한 양의 디지토닌을 가진 관심 있는 시료의 적정은 효소 활동 및 생리적 단백질 상호 작용을 유지하면서 최적의 용해화를 허용하는 조건을 식별하기 위해 중요합니다.
젤 주조에 관한 모든 단계는 적절한 시료 분리를 위한 최적의 그라데이션의 형성에 세심하게 수행되어야 합니다. 이러한 크고 깨지기 쉬운 젤의 조작을 위해 극단적 인주의를 기울여야합니다. 항상 젤의 높은 백분율 끝을 사용하여 여러 손가락으로 그들을 잡아.
이 하이브리드 클리어/블루 네이티브 PAGE 방법을 사용하면 샘플은 다른 세제에 노출되지 않고 전기 전구의 시작 부분에서 음이온 염료 쿠마시 블루에 잠시 노출됩니다. 이를 통해 초복합체를 전통적인 블루 네이티브 PAGE 방법과 마찬가지로 효과적으로 분리하고 해결할 수 있으며, 초복합체 내에서 겔 활동 분석 및 음순 단백질 상호 작용에 높은 Coomassie 블루 수준의 부정적인 영향을 피할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜을 사용하면 정밀하고 신속한 인겔 활동 측정을 2D 전기전도, 면역 검출 및/또는 초복합체의 분석을 참조한 프로테오믹스와 관련된 분석 기법과 결합할 수 있습니다.
