The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

솔루션 1. 준비 <ol><li> BGE 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 0.05 %로 이루어지는 용액 100㎖를 제조 하였다 (m / v)의 하이드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 200 mM의 ε-N - 아미노 카프로 산 (EACA)와 30mm의 리튬 아세테이트. 주 : HPMC는 점탄성 폴리머이기 때문에, 유리 비이커에 분말을 부어 물 80 mL를 첨가하고 마지막으로 교반 막대를 추가한다. 일반적으로 남아있는 시약을 계속 추가합니다. 그것은 눈 자극을 일으킬 수있는 리튬 아세테이트를 취급 할 때는 보안경을 착용한다. </li><li> 50 % (v / v)로 아세트산으로 4.8 ± 0.1의 pH 값으로 조정한다. 용액을 5 분 동안 안정하고 필요에 따라 조정할 수 있습니다. </li><li> 메스 플라스크에 100 ㎖의 최종 부피를 만들기 위해 물을 추가합니다. </li><li> 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터. </li><li> 최대 7 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 내부 표준을 준비합니다. <ol><li> 1 mL의 준비1 % (m / v)로 히스타민 이루어지는 용액. </li><li> 0.2 ㎛의 세공 크기를 갖는 친수성 막을 통과 필터. </li><li> 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 1 mg / ml의 최종 농도로 트리스 완충액 (50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄, pH를 8.0)으로 희석 된 단클론 항체의 샘플을 180 μL를 준비한다. </li><li> 1 % (m / v)의 히스타민의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 5 초 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 보편적 인 유리 병 내부에 마이크로 병을 놓습니다. </li><li> 마이크로 바이알에 샘플을 전송하고 보편적 인 유리 병 캡. 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 위쪽으로 시료를 분배. </li><li> 최대 1 일 동안 2-8 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 샘플 입구 트레이 (시료 용액을 포함하는 마이크로 바이알)와 보편적 인 병을 놓습니다. </li></ol> CE 시스템 3. 준비. <ol><li> CE 시스템 청소. 참고 : 실시 일먼지 나 이물질이 축적 유래의 전류 누설을 방지하기 위해 적어도 일주일 절차이다. 그러나, 용도에 따라 (예를 들면, 점도가 증가 또는 높은 염 농도 증가 점도 시료와 BGE 사용) 전극 및 개방 레버 교차 오염 샘플 캐리 오버를 방지하기 위해 더 자주 세정 될 필요로 할 수있다. <ol><li> 은 CE 기기의 전원 스위치를 끄고 전면 도어를 엽니 다. </li><li> 물에 적신 부직포 와이프와 함께, 샘플 유지 시스템 (샘플 버퍼 트레이), 카트리지 커버, 클램프 바, 인터페이스 블록과 전극을 샘플 커버의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 사용하기 전에 건조. </li><li> 철저하게 물을 개방 레버를 씻어. 부직포 닦아 자신의 표면을 청소합니다. 과 절차를 반복 에탄올을 묻혀 닦아 설치하기 전에 건조. </li><li> 주의 광섬유 케이블의 양단 청소물에 적신 마이크로 화이버 천으로 사라져. 에탄올에 적신 천으로 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 카트리지 어셈블리. <ol><li> 패키지에서 새로운 중립 모세관 (50 μm의 내경)를 제거합니다. </li><li> 테이프 워크 벤치에 모세관 보호 튜브의 한쪽 끝을 아래로. , 풀다 똑바로 튜브에서 모세관을 당기십시오. </li><li> 워크 벤치에 테이프 나 종이 스틱 다음과 같이 측정 마크를 추가 길이 검출기 (30cm), 출구 단부에 모세관 창 (0.2 cm) 길이 (10cm) (즉, 40.2 cm 전체 길이에, 30.0 cm 유효 길이). </li><li> 참조 논문에서 0.2 cm 측정 마크 모세관 창을 맞 춥니 다. 테이프로 모세관을 수정하고 모세관이 측정 마크 외부 2mm를 종료 표시합니다. </li><li> 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 입구 끝 부분에있는 보호 캡 (창에서 최종 먼)를 잘라.<ol><li> 모세관 내부 코팅에 영구적 인 손상을 방지하기 위해 물이 가득 덮인 보편적 인 유리 병에 모세관 끝을 담가. 이 절차를 모세관 말단 이상 1 분 동안 대기에 노출 될 때마다 반복한다. </li></ol></li><li> 카트리지의 출구 측에 모세관 입구 끝을 삽입합니다. </li><li> 밀어 모세관 창 카트리지 창을 중심으로 될 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당기십시오. </li><li> 카트리지 창에 구멍 플러그 (100 μm의 X 200 μm의)를 삽입합니다. 주 : 빛의 화이트 소스에 노출되면 흰색 빛이 창을 통해 전달되었는지 확인합니다. 통과하는 광은 갈색 외관이 경우, 필요에 따라 조정한다. </li><li> (순서대로 양단에 사전 설치된 튜브 너트, 페룰 및 O 링 포함) 40.2 cm의 총 모세관 길이에 대한 미리 형성된 냉매 배관에 모세관을 삽입합니다. </li><li> coolan을 통해 모세 혈관을 눌러모세관이 관의 다른면에 나타날 때까지 필요한 t 튜브. </li><li> 카트리지의 출구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오. </li><li> 카트리지의 입구 측에 모세관 입구 단부를 삽입한다. </li><li> 밀고 모세관 카트리지의 입구 측에 나타날 때까지 필요에 따라 카트리지를 통해 모세관을 당긴다. </li><li> 카트리지의 입구 측에 냉각수 튜브의 끝을 삽입하고 튜브 너트를 조이십시오. </li><li> 클 리빙 돌의 평면 가장자리를 사용하여 하나의 직선 운동에 모세관 출구 단부 (창에서 가까운 끝 부분)에서 보호 캡을 잘라. </li><li> 모세관 끝 부분을 통해 밀봉 고정 클립을 삽입하고 위치에 고정하는 키를 누릅니다. 시각적으로 모세관이 종료 검사합니다. 그들도없는 경우, 절차를 반복한다. </li><li> 워크 벤치의 가장자리에 모세관 길이 템플릿을 놓습니다. </li><li> AG를 아래로 향하게하여 카트리지를 배치모세관 길이 템플릿을 ainst과 모세관 템플릿의 참조 라인으로 끝 맞 춥니 다. 모세관 계측 마크 (3.2.4 참조) 기준선과 정렬되지 않는 경우, 필요에 따라 조정한다. </li><li> 모세관 길이, 모세관에 대해 템플릿을 잡고 템플릿 기준선 아래 절단 돌 2mm의 세척 에지 사용 모세관의 양쪽 끝을 절단. </li><li> 시각적으로 모세관은 돋보기로 끝나는 검사합니다. 모세관 말단이 평활하지 않은 경우, 클 리빙 스톤의 부드러운면을 사용하여 윤기. </li><li> O 링 삽입 도구를 사용하여 개구부 플러그 구멍에 개구 O 링을 삽입한다. </li><li> 유리 병에 삽입 모세관 끝 즉시 케이스에 카트리지 케이스와 장소 카트리지에 물이 가득 덮인 보편적 인 튜브를 설치합니다. 단기 및 장기 저장에 2-8 ℃에서 보관. </li></ol></li><li> 버퍼 트레이의 제조. <ol><li> 작성하고 출장 UNIVERS를 배치버퍼 입구에서 알 튜브 및 배출 트레이 (그림 1). 샘플 수에 따라 레인 2, 3, 4 및 5의 반복 바이알 위치가 매 6 샘플 주입 하나 차선 배치 분석한다. 주 : 누설 전류를 방지하기 위해 캡 바이알 습윤 피한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> 그림 1 : 위치 및 버퍼 입구와 출구 트레이에 보편적 인 유리 병의 레벨을 입력합니다. 수준을 채우기 : 1/1 = 1400 μL, 3/4 = 1300 μL 1/2 = 1000 μL를. 요약 : W = 물, 염산은 0.1 M 염산. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="4"><li> CE 시스템 구성 요소 어셈블리. <ol><li> 자외선 검출기를 설치합니다. </li><li> 개방 레버를 설치인터페이스 블록에 최대 눌러. </li><li> 광섬유 케이블을 설치한다. 양쪽 끝을 잡고 시계 방향으로 회전 클램프 표시 줄에 해당 끝을 삽입합니다. 자외선 검출기 다른 쪽 끝을 연결합니다. 참고 : 그 파괴의 원인이 굴곡 때문에이 절차를 수행하는 동안주의 광섬유 케이블을 처리합니다. </li><li> 장소 샘플과 샘플 유지 시스템에 버퍼 트레이 및 위치에 걸립니다. </li><li> 양단의 클램프 바가하면서 손잡이를 조여, 상기 인터페이스 블록으로 모세관 카트리지 놓고. </li></ol></li></ol> 4. 악기 방법 셋업 <ol><li> 전압, 최대 : 다음 매개 변수를 표 1에있어서, 상기 조절을 만들고 실행 및 종료 악기 방법 30.0 kV의; 현재, 최대 : 300.0 μA; 카트리지 온도 : 20.0 ° C; 샘플 보관 온도 : 10.0 ° C; UV 검출기 초기 조건 : 파장 : 214 nm 인; 데이터 속도 : 4 Hz에서; 필터 : 일반; 피크 폭 () 포인트 : 16-25; 흡광도 신호 : 직접. 참고 : 데이터 수집 속도는 좁은 분리 영역의 커버리지를 향상시키기 위해서는 25 Hz로까지 증가시킬 수있다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> 컨디셔닝 방법 시간 프로그램 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><td> 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : C1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td> &lt;TD&gt; 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> 별도 - 전압 </td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : D1 </td><td> BO : D1 </td><td> 0.17 최소 램프, 정상 극성 </td><td> 갈라진 </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2758 밀리바 </td><td> 10.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> - </td><td> 린스 팁 </td></tr><tr><td colspan="8"> 방법 시간 프로그램을 실행 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><tD&gt; 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : C1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 4.0 분 </td><td> BI : E1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> 주입 - 압력 </td><td> 34 밀리바 </td><td> 20.0 초 </td><td> SI : A1 </td><td> BO : B1 </td><td> 앞으로, 재정의 </td><td> 샘플 주입 </td></tr><tr><td> - </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.4 분 </td><td> BI : A1 </td><td> 악: A1 </td><td> / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 워시 팁 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 별도 - 전압 </td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0 분 </td><td> BI : D1 </td><td> BO : D1 </td><td> 0.17 최소 램프, 정상 극성 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 샘플 분리 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 자동 영점 조정 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> 데이터를 중지 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 2.0 분 </td><td> BI : B1 </td><td> BO : C1 </td><td> 앞으로, 인 / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 물 </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> / 아웃 유리 병 INC (6) </td><td> 린스 팁 </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> 종료 </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 종료 </td></tr><tr><td colspan="8"> 종료 방법 시간 프로그램 </td></tr><tr><td> 시간 (분) </td><td> 행사 </td><td> 값 </td><td> 지속 </td><td> 입구 유리 병 </td><td> 아울렛 유리 병 </td><td> 개요 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 1.0 분 </td><td> BI : E6 </td><td> BO : E6 </td><td> 앞으로 </td><td> 염산 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> 린스 - 압력 </td><td> 2068 밀리바 </td><td> 6.0 분 </td><td> BI : F6 </td><td> BO : F6 </td><td> 앞으로 </td><td> 물 </td></tr><tr><td> - </td><td> 램프 - 오프 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 기다림 </td><td> - </td><td> 0.0 분 </td><td> BI : A1 </td><td> BO : A1 </td><td> - </td><td> 린스 팁 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 컨디셔닝, 실행 및 종료 시간 프로그램. 5. 데이터 수집 및 처리 <ol><li> 샘플 세트를 프로그램. <ol><li> 컨디셔닝기구 방법을 사용하여 컨디셔닝 모세관 프로그램. 모세관가 처음 사용되는 경우, 네 개의 반복 과정; 그렇지 않으면 조절 방법의 두 반복 프로그램. </li><li> 주행 계기 방법을 이용하여 분석 될 시료 프로그램. </li><li> 셧다운기구 방법을 이용하여 저장을 위해 모세관 프로그램 섹션 3.2.22에 나타낸 절차를 반복한다. </li></ol></li><li> 실험을 실행합니다. </li><li> electropherograms를 내 보냅니다. </li><li> 마이그레이션 시간과 기본 주 (A)의 함유율을 계산electropherogram 프로필의 수직 드롭 라인 통합을 사용하여 차 산성 이성체. </li></ol>

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The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

실시 CZE가 성공 확률을 높이기 위해 모노클로 날 항체 분석 할 때이 튜토리얼에서, 우리는 적절한 방법의 중요성을 강조 표시합니다. CZE가 일상적으로 사용하는 경우에는, 문제가 필연적으로 발생한다 (12). 최상의 결과를 얻으려면, 그들이 극복하고 어려운 단계 문제를 해결하는 분석가 도움이 될 것 같은 프로토콜을 통해 포함 된주의 사항을 따르는 것이 중요합니?...

단일 클론 항체 (단클론 항체는)으로 인해 여러 가지 만성 및 퇴행성 질환 일에 대해 행동하는 능력에 관심을 증가 biotherapeutic 단백질이다. 다른 생체 분자와 마찬가지로, 모노클로 날 항체가 (최종 제품에 생합성에서, 예) 수명주기의 모든 단계에서 여러 가지 물리 화학적 변형을 받아야하는 경향이있다. 이러한 변형을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 : 탈 아미드 화, 글리코 실화, 산화, 폐환 반응, 이성화 반응, 응집 단백질 분해 절단이. 따라서, 극한 이성체를 해결할 수있는 분석 기법은 품질 사양을 설정하기 위해 모노클로 날 항체 얼룩이 안정성을 모니터링 할 필요가있다. 모세관 전기 영동 (CE)는 배경 전해질 (BGE)로 채워진 좁은 용융 실리카 튜브 (μm의 범위)의 outinside 실시 고성능 분리 기술이다. 전계의인가시에, 충전 분자 (30,000 V까지)의는 반대 전하 (즉, 전기 구동 분리)와 전극으로 이동한다. CE에서 높은 전압의 사용은 전통적인 겔 전기 우수한 고속 분석 및 증가 된 효율을 허용한다. 모세관 영역 전기 영동 (CZE)는 통상적으로 제품의 품질 평가 3-9에 대한 생물 약제 산업에 사용되는 CE 기반 기술이다. CE의 다른 모드 (예, 모세관 전기 영동, 모세관 등전점 포커싱) 또는 크로마토 기반의 방법과는 달리, CZE은 그 나라의 상태 (10)에 가까운 모노클 고유의 이질성의 분석을 허용 변성제 고체상 인터페이스를 사용하지 않고 수행 될 수있다 . 단클론 항체 동종의 CZE 분리는 친수성 고분자 (중립 모세관)으로 피복 용융 실리카 모세관 내부의 발생 전하, 질량, 크기 및 형상 (또는 유체 역학적 부피) (11)에 의해 지배되고 서로 다른 전기 영동 이동성을 기반으로한다. 단클론 항체 잔기 때 검출이들은 동원 214 내지 4에서 자외선 (UV) 흡수 검출기에 의해 감지 된 검출 윈도우를 통과한다. 이러한 분석 기술의 성공적인 구현은 전 실험 기간 동안 세부 적절한주의에 달려있다. 궁극적으로 지속적인 실패와 좌절로 이어지는 분석을 수행하기 위해 비용과 시간을 증가시킬 것이다, 그렇지 않으면 연기. 여기서는 용액 및 시료 CE 시스템 설정 악기 방법, 데이터 수집의 제제의 제조에 대한 상세한 설명을 통해 CZE 의해 단클론 이질성 성공적인 분석을 수행하는 단계별로 제시하고, 처리. 이 가이드의 목적을 위해, 재조합 완전 인간 항 종양 괴사 인자 알파 (TNFα 항) 단클론 항체 단백질 모델로서 사용된다; 그러나,이 프로토콜은 쉽게 간단한 수정을 고려하여 다른 단백질의 분석을 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. 에이dditionally 몇 가지 권장 사항은 잠재적 인 문제가 제안 완화합니다. 독자는 엄격하게 증가 할 것이다 성공 확률로, 제안 된 프로토콜을 따르도록 권장합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Tecsiquim</td>
			<td>AT0035-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACS grade hydrochloric acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&#160; pH 8</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Neutral capillary&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Micro, 200 &#181;l</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144709</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vial Caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable, Optics, UV/Vis</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Detector Module</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144733</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144738</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

도 2는 200 mM의 EACA, 30mm의 리튬 아세테이트의 전형적인 전류 프로파일을 도시 트리스 완충액 (50 mM의, pH를 8.0)로 희석 한 항 - TNFα 단클론 항체 샘플을 사용하여 pH 4.8 BGE. 관찰 될 수있는 바와 같이, 전류는 분석에 걸쳐 안정하고 30 내지 35 μA의 값 사이에서 발진 할 수있다. 검출 된 피크가 히스타민 내부 표준에 대응한다 그림 3은 빈 샘플의 CZE의 elec...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K 조회수.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

연구

생화학

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

실험실 규모의 생산과 치료 용 항체의 정제

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

단백질 및 모 세관 전자 초점 방법으로 그들의 Isoforms의 매우 민감하고 정량적 검출

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...