P2X7 수용체는 매우 다재다능하며 현재의 작용제의 양에 따라 다르게 기능합니다. 이러한 방식으로, P2X7은 다른 기능을 가지고 있으며 많은 다른 시스템의 생리학을 조절 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 P2X7 수용체의 세 가지 주요 기능에 대한 조사를 허용합니다.
그것은 그것의 기능을 이해 하기 위한 신속 하 고 재현 가능한 정량화 하는 방법. P2X7 수용체가 신경 전구 세포에서 조절할 수 있는 방법에 대한 우리의 초점. 그러나 이 방법은 모든 세포 유형에 맞게 쉽게 적응할 수 있다.
이 절차를 시도하기 전에 충분한 문학을 읽은 학생들은 하루에 이 모든 것을 배우고 두 세 번 의 시도 후에 혼자서 실행할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 성인 마우스의 심실 영역 및 해마에서 신경 전구 세포를 획득하여 이 절차를 시작합니다. 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 문화를 유지합니다.
신경구는 7~10일 후에 형성되어야 하며, 항로는 영하구역 배양과 15~20일 후에 해마 배양에서 형성되어야 한다. 초기 통과 제로 배양 단계에 따라 생물학적 안전 캐비닛 및 표준 조직 배양 관행을 사용하여 필요에 따라 7~10일마다 통과합니다. 직경이 150~200미크론에 도달하면 구체를 통과합니다.
15 밀리리터 튜브에서 구체와 배지를 수집하고 2 분 동안 저속으로 회전하십시오. 배지를 제거하고 구체의 크기에 따라 섭씨 37도에서 7~10분 동안 해리 시약으로 세포를 배양한다. 마지막으로, 혈전계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
칼슘이 없는 나트륨 배지의 1밀리리터로 단일 세포를 일시 중단합니다. 그런 다음 칼슘 표시기 염료의 밀리리터 당 2 개의 니니그램과 5 %의 플루론산 10 마이크로 리터로 세포를로드합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
칼슘이 없는 나트륨 배지의 3~5밀리리터를 추가하고 부드럽게 원심분리를 하여 세포를 씻어내십시오. 상체를 제거하고 칼슘이없는 나트륨 배지에서 세포를 다시 일시 중단하여 두 번째로 세척하십시오. 칼슘이 없는 나트륨 배지의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 세포를 얼음위에 놓고 30분 동안 세포를 제거하도록 허용합니다. 칼륨 배지와 원심분리기의 3~5밀리리터를 이전과 같이 첨가하여 세포를 한 번 더 씻으시다. 칼륨 배지에서 세포를 다시 중단한 후, FACS 튜브당 500 마이크로리터당 100만 개의 세포 농도로 형광 활성화 세포 선별 또는 FACS 튜브로 이리액을 넣습니다.
세포를 분석할 준비가 될 때까지 FACS 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 장기간 얼음에 세포를 두지 말고 가능한 한 빨리 분석작업을 시작합니다. 일부 샘플의 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 P2X7 수용체 특이억제제로 세포를 사전 배양한다.
첫 번째 샘플을 실행하기 몇 분 전에, 1 밀리머의 최종 농도에 염화 칼슘을 추가하고 복구할 수있는 섭씨 37도 수조에 튜브를 배치합니다. 깨끗한 작은 자기 교반기를 FACS 튜브에 떨어뜨리고 시료 온도를 제어하기 위해 순환되는 섭씨 37도 수조에 연결된 시간 모듈에 튜브를 배치합니다. 소용돌이 효과를 도입하지 않고 시료의 움직임을 보장하기 위해 낮은 교반 속도를 선택합니다.
물 주전자와 튜브 어댑터를 샘플 플랫폼에 놓고 FACS 기계의 레버 암을 닫습니다. 샘플 수집을 시작하고 초당 약 1, 000 이벤트에서 3분 동안 샘플을 실행합니다. 40초 마크에서 튜브를 빠르게 제거하고 P2X7 작용제에 추가합니다.
1 밀리머 ATP 또는 300 마이크로 몰라 BzATP. 그런 다음 튜브를 교체하여 인수를 계속합니다. 첫 번째 샘플이 기록하는 동안 염화 칼슘으로 두 번째 샘플을 준비합니다.
분석 전에 세포가 예열될 수 있도록 섭씨 37도에 놓습니다. 첫 번째 샘플이 완료되면 물 샘플을 실행하여 섭취를 청소하십시오. 그런 다음 두 번째 샘플의 획득은 이전과 같이 시작될 수 있습니다.
항상 샘플 사이의 섭취량을 청소하십시오. 이전과 같이 단일 셀 서스펜션을 만들고 조건부 배지의 몇 밀리리터를 저장합니다. 이 매체를 사용하여 FACS 튜브당 100마이크로리터당 100개의 세포 농도로 세포를 다시 중단하고 세포가 준비될 때까지 얼음 위에 놓습니다.
분석서를 실행하기 전에 900 마이크로리터의 칼륨 배지를 추가하여 1 밀리리터의 최종 부피에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10분간 놓아 복구합니다. 해당되는 경우 P2X7 특이 억제제를 포함한 치료로 세포를 사전 배양합니다.
분석 을 실행하기 직전에 FACS 튜브에 25 마이크로 몰러 에디튬 브로마이드를 추가하십시오. 그런 다음 자기 교반기를 추가하고 FACS 기계에 튜브를 배치하고 이전과 같이 인수를 시작합니다. 세포막에서 모공의 형성을 유도하기 위해, 1 밀리머 ATP 또는 100 마이크로몰러 BzATP를 추가 40 취득의 시작 후 초.
샘플을 초당 약 1, 000 이벤트에서 6분간 실행합니다. 첫 번째 샘플이 실행되는 동안, 얼음에서 두 번째 샘플을 가져 와서 분석 전에 세포가 회복 할 수있는 충분한 시간을 허용하기 위해 37섭씨 수조에 배치하십시오. 첫 번째 샘플 수집이 완료되고 섭취량이 정리되면 두 번째 샘플을 컴퓨터에 배치하여 레코딩을 시작할 수 있습니다.
우리는 조건부 배지에서 단일 세포를 중단하고 FACS 튜브 당 100 마이크로 리터 당 적어도 백만 세포의 농도에서 FACS 튜브로 그들을 이액. 나트륨 매체로 밀리리터 당 백만 세포의 최종 농도로 세포를 희석하고 분석이 수행 될 때까지 얼음에 세포를 배치합니다. 실시간 phagocytosis 분석약에 대 한 phagocytic 대상으로 하나의 미크로네 넓은 G 구슬을 사용.
첫 번째 샘플을 실행하기 전에 세포를 섭씨 37도로 옮기고 약 7~10분 동안 배양하여 세포가 회복되도록 합니다. ATP, 산화 ATP, 사이토켈리신 D 및 4% 파라포름알데히드를 포함한 각 튜브에 사전 인큐베이션을 요구하는 모든 트리트먼트를 추가합니다. 5%의 인간 혈청에는 사전 잠복이 필요하지 않습니다.
치료가 거의 동시에 추가되면, 샘플은 연속적으로 실행될 수 있으며 다른 샘플은 인큐베이션 시간이 다양하기 때문에 계속 배양을 계속할 수 있습니다. 마그네틱 교반기로 사이토미터에 샘플을 놓고 이전과 같이 시료 수집을 시작합니다. 수집 시작 후 15~20초 후에 기계에서 샘플 튜브를 제거하고 희석되지 않은 YG 구슬 5마이크로리터를 추가합니다.
샘플 FACS 튜브를 계측기로 반환하고 인수를 계속합니다. 초당 약 1, 000 이벤트에서 7~8분 동안 샘플을 실행합니다. 첫 번째 샘플이 실행되는 동안, 얼음에서 두 번째 샘플을 가져 와서 분석 하기 전에 세포가 복구 할 수있는 충분한 시간을 허용하기 위해 섭씨 37도 수조에 배치합니다.
첫 번째 샘플이 완료되고 섭취량이 정리되면 두 번째 샘플에서 수집을 시작합니다. 시간이 지남에 따라 플롯 될 때, 칼슘 유입은 일반적으로 해마 와 지하 영역 신경 전구 세포에서 유사했다. 42번째 마크에 고뇌주의자가 추가되었습니다.
BzATP는 P2X7 수용체를 빠르게 활성화하여 이온 채널을 열고 플루오-8 및 형광에 결합하는 칼슘 유입을 허용합니다. ATP 응용 프로그램은 일반적으로 더 점진적인 칼슘 유입을 초래합니다. BzATP에 비해 P2X7에 대한 선호도가 낮으며 G 단백질 결합 수용체 활성화도 초래할 것이다.
아고니스트의 ATP와 BzATP의 적용에 따라, 시간 해결 혈중 세포측정은 실시간으로 막 기공을 통해 세포로 유입되는 에티듐 브로마이드를 포착한다. 이 효과는 P2X7 특이적 억제제에 의해 감쇠되었다. ATP 농도 반응 작용제는 시간이 지남에 따라 에티듐 브로마이드 형광의 변화를 사용하여 P2X7 모공 형성에 대한 고뇌농도의 효과를 보여준다.
여기서 P2X7 수용체-관련 식세포는 해마 및 지하존 신경 전구 세포에 의한 교후세포가 실시간으로 나타나고 있다. YG 라텍스 구슬의 억제되지 않은 식세포증 수준이 긍정적 인 제어로 확립되었습니다. ATP는 비특이적 억제제, 즉 파라포름알데히드 고정및 액틴 중합 억제제 시토켈리신 D.5%의 혈청이 모든 선천적 식세포증을 폐지하는 비특이적 억제제와 같은 정도로 YG 구슬의 식증을 억제하였다.
건강한 세포 인구를 유지하고 얼음에 시간을 줄이는 것은 재현 가능한 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 전체 셀 분석에 대해 동일한 ATP 배치를 사용하여 가변성을 최소화할 수 있습니다. 여기에서 입증된 흐름 세포측정의 시간 지정 결과는 대상 하위 인구의 흐름 및 변화에 대한 수량을 계속 선택할 수 있는 유일한 메시지입니다.
대체 방법은 형광 현미경 및 형광 플래터 판독기입니다. 그러나, 이 방법은 형광 친화성 프로그램 때문에 형광 변화를 지속적으로 측정할 수 없다. P2X7은 고유 멀티 모달입니다.
관심 있는 셀에서 그 표현을 발견하는 것은 수사관이 탐구할 수 있는 일련의 독특한 질문을 열어주어집니다.
