안녕하세요, 내 이름은 박사 비파샤 보스입니다. 저는 부교수로 일하고 있으며 줄기 세포 및 재생 의학 센터, 예네포야 연구 센터, 예네포야 대학, 인도 만갈로어에서 담당하고 있습니다. 이제 우리는 자외선-C 방사선의 각종 복용량에 드러진 마우스 안구 표면에서 살아있는 배양에서"즉 반응성 산소 종인 ROS의 존재를 검출하는 방법을 시연할 것입니다.
이 기술의 장점은 여기서 우리는 동시에 베스터 세포를 가질 필요없이 반응성 산소 종, 살아있는 죽은 세포의 존재를 감지 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 원리는 본질적으로 염료 DCFDA의 살아있는 세포 투과성에 있습니다. DCFDA는 살아있는 세포 무색 염료로, 산화 스트레스 가 세포 내 산화에 의해 행동되고 녹색 형광 DCF로 변환됩니다.
따라서, 녹색 꽃은 우리가 살아있는 세포에 반응성 산소 종의 존재를 검출할 수 있게 합니다. 한편, 프로피듐 요오드제는 홍조를 적색으로 하는 만사세포 침전염염이다. 그것은 rDNA 이중 좌초 연염염입니다.
그러나, 염료 Hoechst는 살아있는 세포와 죽은 세포 둘 다에 periss입니다. 푸른 색 핵 얼룩입니다. 따라서, 이것은 우리가 죽은 세포의 평가와 함께 시간 종속 방식으로 장기 배양에 반응성 산소 종의 존재를 검출 할 수있는 매우 간단한 방법입니다.
플레이트 포인트 35 밀리미터 배양 접시 당 2 백만 셀. 우리가 적용하는 세포는 마우스 안구 표면에서 세포입니다. 각 세포 배양 접시에서 최대 양의 미디어를 제거합니다.
세포 배양 매체의 약 500 마이크로리터를 세포와 밀접한 접촉으로 남겨 둡니다. 최소한의 양의 매체는 세포의 건조를 방지할 수 있습니다. 그러나 최소한의 양의 미디어의 목적은 UVC 노출의 최대 침투를 허용하는 것입니다.
UV 소스에서 세포를 가지고, 그것은 UV 크로스 링커 일 수있다, 또는 다른 자외선-C 소스 가 될 수 있습니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 줄과 같은 UVC 방사선의 상이한 복용량에 세포를 노출하는 것은 미터 평방 당 10, 000 줄. 세포가 자외선-C 방사선에 노출되면 뚜껑은 열린 위치에 있어야합니다.
이것은 세포에 자외선-C의 최대 침투를 허용하고 그러므로 자외선-C 방사선에 세포의 최적 복용량 반응을 보여줄 것입니다. 세포를 라미나르 공기 흐름 후드에 가져와 서 전체 미디어의 2 밀리리터와 각 접시를 보충. 이 완전한 매체는 DMEM에 있는 20% 태아 소 혈청을 포함합니다, 1%최소 비 필수 아미노산과 같은 보충교재로 보충되고, 또한 페니실린과 연쇄상 구균인 1%항생제.
그 후, 최대 부피로 보충 한 후, 즉 완전한 매체의 두 밀리리터, 자외선-C 방사선의 초기 효과를 보기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 반환하고 인큐베이터. UVC 세포 인큐베이션 후 3시간 후 의 마지막 15분 동안 라이브 셀 염색 매체를 준비한다. 스테인닝 미디어는 37도까지 미리 따뜻하게 DMEM을 포함하는 10 % FBS로 준비됩니다.
염색 매체의 10 밀리리터를 만들기 위해, 먼저 5 마이크로 몰러의 최종 농도를 얻기 위해 10 밀리머의 주식에서 DCFDA의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 둘째, mL당 10밀리그램의 스톡에서 Hoechst 용액 5마이크로리터를 추가하여 mL당 5마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.
이제 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 마지막으로 mL 당 1 밀리그램의 주식에서 프로피듐 요오드의 200 마이크로 리터를 추가하여 mL 당 20 마이크로 그램의 최종 농도를 얻습니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.
이제 염색 솔루션을 사용할 준비가 되었습니다. UVC 노출 후 3시간 동안 잠복후 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 평방 미터 당 10, 000 줄과 같은 UVC의 다양한 복용량에 노출 된 각 요리에서 미디어를 흡인.
이제 갓 준비된 라이브 셀 스테닝 미디어를 접시 의 측면에서 부드럽게 두 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 다시 반환하고 라이브 셀 염색을 위해 15 분 동안 배양하십시오. 살아있는 세포 염색 매체에서 15분 동안 배양한 후, 자외선-C 방사선의 상이한 복용량에 노출된 세포를 포함하는 각 접시에서 염색 매체를 제거한다.
완전한 매체의 2 밀리리터로 세포를 보충하십시오. 이제 셀이 볼 준비가 되었습니다. 이제 형광 이미저의 밝은 필드 아래에 제어 세포를 배치합니다.
세포는 통제 세포이기 때문에 명백하게 정상보입니다. 파란 들판 아래에서 우리는 형광 총 세포를 할 수 있습니다. 녹색 필드 아래에는 ROS 생성이 표시됩니다.
이들은 제어 세포이기 때문에, 생성된 ROS가 없습니다. 적색 필드 아래에서, 프로피듐 요오드 염색 죽은 세포가 볼 수 있습니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 UV를 유지합니다.
파란색 필드 아래에서, 또한 우리는 파란색 필드 아래총 셀 번호를 볼 수 있습니다. 그러나, 우리가 녹지에 노출될 때, DCFDA 양성 세포가 보입니다, 또한 PI 양성 사구는 보입니다. 마지막으로, 최대 UV 용량을 배치, 즉 10, 000 미터 평방 노출 세포 당 줄, 밝은 필드 아래에.
우리는 비정상적인 세포 형태를 볼 수 있습니다. 그러나, 푸른 필드 에서 우리는 총 파란색 세포를 볼 수 있습니다. 녹색 필드 에서, 녹색 형광 DCFDA 양성 세포는 ROS 생성을 나타내는 볼 수 있습니다.
세포가 적색장에 노출될 때, 모든 세포는 세포가 UV 투여량의 미터 당 10, 000 줄로 취급될 때 많은 수의 세포사를 나타내는 적색을 형광하였다. 이제 다양한 채널에서 캡처한 이미지를 자외선-C 용량 및 노출되지 않은 컨트롤에 대응하는 단일 복합 이미지 패널로 정렬합니다. 이미지는 그룹의 단일 패널로 정렬됩니다.
첫째, 밝은 필드. 둘째, 호흐스트 블루 핵 얼룩. 셋째, 죽은 핵에 관해서는 요오드 염색을 프로디듐 요오드데.
넷째, ROS 양성 세포를 위한 DCFDA. 그리고 다섯 째, 병합된 이미지입니다. 우리가 이미지의 첫 번째와 두 번째 행을 볼 때, 즉 노출되지 않은 제어 및 미터 평방 당 하나의 줄에 노출 되지 않은 세포, 우리는 PI 도 ROS 양성 세포가 조명 했다 관찰, 따라서 노출 되지 않은 컨트롤에 ROS와 세포 죽음의 완전 한 부재와 하나의 joule 평방 미터 당 의 이러한 낮은 UVC 복용량을 나타내는 것을 관찰.
이제 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 세포의 합성 이미지의 세 번째 행에 오고. 세포의 매우 낮은 비율, 약 10%는 이 복용량에서 PI와 DCFDA 둘 다에 대해 긍정적이었다, 따라서 ROS 생성 및 세포 죽음의 낮은 양을 나타내는. 이제 우리는 복합 이미지의 네 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 1, 000 줄인 UVC 방사선 노출의 더 높은 용량으로 이동합니다.
여기서, 세포의 대략 70%는 PI와 DCFDA를 위해 양수이었습니다. 마지막으로, 우리는 복합 이미지의 다섯 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 10, 000 줄입니다 UVC 노출의 가장 높은 복용량으로 이동합니다. 여기에 세포의 거의 100 %가 PI와 DCFDA 모두에 대해 양성이었다는 것을 발견, 따라서 이 특정 UVC 용량에서 100 %의 세포 죽음과 ROS 생성을 나타내는.
이미지를 이미징 소프트웨어로 전송합니다. 먼저 Hoescht 염색 핵을 나타내는 파란색 이미지를 엽니 다, 즉 세포의 총 수입니다. 카운트 도구를 열고 숫자를 갖기 위해 각 셀을 한 번에 하나씩 클릭합니다.
이제 PI 양성 죽은 세포를 나타내는 빨간색 채널 아래에 캡처 된 이미지를 엽니 다. 카운팅 도구를 열고 PI 양수 죽은 세포의 수를 나타내는 각 빨간색 반점을 클릭합니다. 죽은 세포의 계산이 끝나면, 녹색 채널 캡처 된 세포를 클릭하고 계수 도구를 열고 ROS 생성을 나타내는 세포를 나타내는 녹색 반점의 각을 클릭합니다.
녹색 채널에서 캡처된 녹색 셀의 계수를 완료한 다음, 포뮬러를 사용하여 UVC 손상 및 UVC 손상에 의한 ROS 생산의 백분율에 의한 세포 사멸의 비율을 확대합니다. 이는 PI 양성 세포의 간단한 수식 수를 사용하여 계산되며, 즉 적색 형광 세포이며, Hoechst 양성 세포의 수로 나누어 100을 곱한다. UV 손상에 의한 ROS 생산의 백분율은 100을 곱한 Hoechst 양성 세포의 수로 나눈 수식, DCFDA 양성 또는 녹색 형광 세포의 수를 사용하여 계산됩니다.
셀 사망 비율과 ROS 생산 비율의 백분율인 백분율이 모두 있으면 이러한 값을 사용하여 막대 그래프를 플롯합니다. X축은 UV의 투여량을 나타내는 반면 y축은 세포의 백분율을 나타냅니다. 녹색 막대는 ROS 생성 의 백분율을 나타내고 빨간색 막대는 세포 사망 비율을 나타냅니다.
분석 시, UVC 용량 100 줄에는 10%의 ROS 생성 세포와 10%의 세포 사망이 있음이 분명합니다. UVC 투여량 10에서 미터 정사각형 당 3개의 줄로 상승하는 반면, 70%의 세포는 세포 사멸뿐만 아니라 ROS 생성을 나타냈다. UVC의 가장 높은 복용량에 있는 동안, 그 10 미터 평방 미터 당 4 줄로 제기, 약 100% 세포는 세포 죽음 뿐만 아니라 ROS 생산을 전시.
따라서, ROS 생성과 세포 사멸 사이에 강한 긍정적 인 상관 관계가 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 살아있는, 일반적인 사건 문화에서 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포의 동시 평가를 위해 아주 편리합니다. 이 기술은 또한 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포, 자외선, 또는 화학 에이전트와 같은 각종 세포 손상 제에 노출된 장기 배양에서 제한된 평가에 유용합니다.
그리고 이 기술은 또한 PCR 및 서양 블로팅에 QR과 같은 많은 다운스트림 응용 에 대한 수 로 등등 50 %ROS, 75 %ROS, 등등에서 세포를 수확하기위한 최적의 시간을 결정하기위한 연구원을 안내 할 수 있습니다.
