The authors have no conflicts of interest to disclose.

성인 전혈 1. 농축 조혈 전구 세포 주 : 조혈 전구 세포 또는 CD34 + 세포를 밀도 구배 원심 분리 기반의 방법을 이용하여 제대혈, 백혈구 성분 채집 물질 및 전혈을 다양한 소스로부터 유도 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 정제 될 수있다. 여기에 나열된 방법은 예를 들어 전혈을 사용한다. <ol><li> 전체 혈액에서 PBMC를의 분리 : <ol><li> 삽입물의 중앙 구멍을 피펫 팅하여 SepMate 튜브에 림프구 분리 매체의 4.5 ML을 추가합니다. </li><li> 2 % 인간 혈청을 함유하는 무균의 DPBS 동량 혈액 시료를 희석 (V / V). 예를 들어, DPBS + 2 % 인간 혈청을 5 ml의 샘플 5 ml의 희석. </li><li> 튜브의 측면을 아래로 피펫 팅에 의해 희석 된 샘플을 추가합니다. 중앙 구멍을 통해 직접 샘플을 부어 않도록주의하십시오. </li><li> 실온에서 10 분 동안 1,200 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 PMBC 층 위의 상층 액을 제거합니다. </li><li> 새로운 튜브로 PBMC 층 (흐린)를 수집합니다. </li><li> 브레이크 해제와 함께 실온에서 10 분 동안 150 XG에서 2 % 인간의 튜브에 혈청 및 원심 분리기를 포함하는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 2 % 인간 혈청을 포함하는 DPBS 15 ml의 펠렛을 재현 탁. 세포의 수를 계산. </li><li> 실온에서 10 분 동안 690 XG에 원심 분리기. 튜브에서 모든 상층 액을 제거합니다. </li><li> 15 1 % 항생제를 포함 Iscove의 수정 둘 베코의 매체 (IMDM)의 ㎖ (v / v)의 10 % 인간 혈청 당 1 × 10 7 세포에서 재현 탁 세포 (v / v)로. </li><li> CD34 + 세포를 분리하기 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO 2 배양기를 세포 O / N을 품어. </li></ol></li><li> CD34 MultiSort 키트를 사용하여 한 PBMC에서 CD34 + 세포의 긍정적 인 선택 : 참고 : 빠른 작업 차가운 세포를 만들기 위해 사전 냉각 솔루션을 사용하여 캡을 방지키트 지시에 따라 세포 표면 비특이적 세포의 표지에 대한 항체. <ol><li> 50 ㎖ 튜브에 모두 모아서 PMBCs 배지에서 총 세포 수를 계산. </li><li> 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 완전히 모든 상층 액을 제거합니다. </li><li> 10 8 비드 버퍼 300 μL 당 세포 (DPBS 포함 0.5 % 인간 혈청 (v / v)의 2 mM의 EDTA)까지 재현 탁. </li><li> 의 FcR 차단 시약 100 μl를 추가하고 CD34의 MultiSortMicroBeads 100 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 섞어 냉장고에 30 분 동안 배양 (2-8 ° C에서). </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 비드 (10) 8 셀 당 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 첨가하여 세포를 씻으십시오. 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 버퍼의 500 μl의 10 8 셀을 재현 탁. </li><li> MACS 분리기의 자기장에 MACS LS 열을 올려 놓고 비드 버퍼의 3 ㎖로 세척하여 열을 준비합니다. </li><li> cente에 세포 현탁액을 적용열의 R. 레이블이없는 세포를 선호하는 경우이를 통해 수집 할 수 흐를 것이다. </li><li> 워시 열 비드 버퍼의 3 ㎖로 3 회. </li><li> 분리기로부터 열을 제거하고 15 ML 튜브에 놓습니다. </li><li> 컬럼 상 비드 완충액 5 mL를 첨가하고, 즉시 컬럼으로 플런저를 밀어 자기 적으로 표지화 된 세포를 세척. </li><li> 세포 현탁액 1 ㎖ 당 MultiSort 출시 시약의 20 μl를 추가합니다. 잘 섞어 냉장고에 10 분 동안 배양 (2-8 ° C에서). </li><li> 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 세포를 10 7 셀 당 구슬 버퍼 2 ㎖ 원심 분리기 - 1을 추가합니다. 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 10 7 세포 당 비드 버퍼의 50 μL에 재현 탁 세포. </li><li> 10 7 세포 당 MultiSort 중지 시약의 30 μl를 추가하고 냉장고에 15 분 동안 품어. </li><li> RT에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 비드 완충액 5 mL를 첨가하고 원심 분리기. 상층 액을 제거한다. </li></ol></li></ol> CD34 + 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 2. 유도 <ol><li> CD34 + 세포 배양 : 참고 : 냉장고에 보관하면 갓 준비한 매체는 7 일 이내에 사용되어야한다. 상당한 CD34 세포 손실이 24 시간 후에 관찰 될 수도 있지만, 셀 번호가 연속적으로 감소하거나 전혀 증식이 없으면 세포의 현저한 증식 특히 일 5. 후에 두드러 질 경우, 이는 불량 매체 또는 CD34 세포의 품질과 세포를 의미 다음 단계에 사용되어서는 안된다. <ol><li> CD34에 재현 탁하고 배양 CD34은 + 세포 (인간 트롬 함유 (StemSpan SFEM 매체 SCF를 (TPO, 100 NG / ㎖), FMS 같은 티로신 키나아제 3 (예를 들어 Flt-3) 리간드 (100 NG / ml) 및 줄기 세포 인자를 배지를 유지 NG 100 / ㎖), 인터루킨 -6 (IL-6, 20 NG / ml) 및 인터루킨 -7 (IL-7, 24- 웰 플레이트에서 20 NG / ㎖)) (최대 3 × 105 / 웰 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 잘 당 중) 1 ㎖. </li><li> AF터 24 시간은 부동 세포를 수집하고 연결된 모든 세포와 세포 파편을 제거하는 RT 110 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 추가로 5 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 새로운 24 웰 플레이트 (물론 최대 1 × 10 5 /)에서 신선한 CD34 유지 매체와 씨앗의 1 ml의 세포를 재현 탁. </li><li> CD34 + 세포가 우물 (그림 1A)의 바닥에 떠있는 동안 조심스럽게 상층 액의 위쪽 절반을 흡입하여 매체마다 다른 하루의 절반을 교체합니다. </li></ol></li><li> 센다이 바이러스 형질 : <ol><li> 5 일째, CD34 세포를 수집하고 RT에서 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거한다. </li><li> 웰의 배지 1 ㎖ 중의 24- 웰 플레이트에 1 × 105 / 신선한 배지에서 세포를 재현 탁. </li><li> 처음 10 초 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브의 바닥을 담금으로써 cytotune - 만능 줄기 센다이 리 프로그래밍 키트를 해동 한 후 완전히 해동t RT. 간단히 튜브를 원심과 얼음에 넣어. 해당 로트의 분석 인증서 (COA)에 나열된 각 바이러스의 권장 볼륨을 혼합하여 센다이 바이러스 혼합물을 준비합니다. MOI (15)을 권장합니다. </li><li> CD34 세포의 각 웰에 센다이 바이러스 믹스를 추가한다. 부드럽게 흔들어 우물을 섞는다. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 24 시간 후 형질 전환 효율을 관찰한다. 세포 집합체 및 구 형성이 성공적으로 형질 전환 (그림 1B)에 대한 지표는 것을 알 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 다른 매체의 위쪽 절반을 전송 잘하여 매체의 절반을 변경합니다. 새로운 웰 세포 분야가 있다면, 새로운 배지의 동일한 양을 첨가하는 것이 바람직하다. </li><li> 단계 2.2.6를 반복하여 다른 일 매체마다 변경합니다. </li></ol></li><li> 신경 줄기 세포의 유도 : 주 : 셀 조건에 따라 약 5 칠일 형질 감염 후, 부착 세포 단층 (30)에 도달한다 -50 %의 합류 (그림 1C). <ol><li> 영양소 혼합물 F-12 1X N2 보충제, 0.1 % (w / v)의 소 혈청 알부민을 함유하는 (DMEM / F12), ((둘 베코 변형 이글 중간 부유 세포 및 구 함유 상층 액을 제거한 후 신경 전구 배지 1 ㎖를 추가 BSA), 1 % (V / V) 항생제, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 20 ng를 / ㎖ (의 bFGF) 및 부착 세포 내로 표피 성장 인자 (EGF)) 20 ng / ml이되게 준비 하였다. </li><li> 임의로, 부드럽게 피펫 팅하여 세포를 해리 분야 및 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리. 상층 액을 제거하고 다시 명령 당 리겔로 코팅 된 새로운 24 웰 플레이트에서 신경 전구 배지 1 ㎖의 세포를 재현 탁. </li><li> 80 %의 합류 보통 일주 후, - 세포가 60에 도달 할 때까지 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 신경 줄기 세포 배지 (무 혈청 배지, NSC SFM) 1 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 이어서 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 해리매우 부드러운 피펫으로. </li><li> 세포를 제거하고 6- 웰 플레이트의 한 웰에 그들 모두를 시드. 신경 줄기 세포 매체의 다른 1 ㎖를 각 웰에 대해 2 ml의 용지를 만들기 위해 추가. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 일전에 매체마다 변경합니다. </li><li> 세포가 60 % 합류에 도착했을 때, 해리와 1의 세포를 replate : 2.3.4과 2.3.6의 단계에 따라 3 비율. </li></ol></li><li> 신경 줄기 세포의 냉동 : <ol><li> 신경 줄기 세포의 배지에 20 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 첨가하여 동결 배지 신경 줄기 세포를 준비한다. 얼음에 동결 매체를 보관하십시오. </li><li> 부드럽게 피펫 팅 하였다 셀 스크레이퍼를 사용하여 6 웰 플레이트에 세포를 해리. 세포를 계산합니다. RT에서 10 분 동안 170 XG에 세포를 원심 분리기. 상층 액을 제거한다. </li><li> 1 × 106 / ㎖에서 신경 줄기 세포 배지에서 세포를 재현 탁. 세포에 매체를 동결 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 1 ㎖ (5 × 1 추가cryovial에 세포의 0 ~ 5 총 세포). 다음 명령어 씨 Froster 냉동 컨테이너를 사용하여 세포를 동결. </li></ol></li></ol> 3. 신경 세포 분화 <ol><li> 신경 세포의 분화 : <ol><li> 신경 줄기 세포가 80 % 합류에 도달하면 고무 경찰관을 사용 신경 줄기 세포를 분리 한 다음 온화하게 피펫 팅하여 해리. </li><li> 세포를 세어 신경 줄기 세포 배지에서 1 × 105 / ml의 농도로 조정한다. </li><li> 신경 세포의 분화를 들어, 폴리 D 라이신 / 라미닌 코팅 덮개의 세포를 판 잘 1 × 10 5 / 24 웰 플레이트에서 미끄러 져. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 신경 분화 매체와 매체를 교체 (DMEM 1 배 N2 보충, 1X B27 보충제, 300 NG / ㎖ 캠프, 0.2 mM의 비타민 C, 신경 영양 인자 (BDNF 유도 10 NG / ml의 뇌) 10 NG / ㎖ 아교 세포를 포함 / F12 유도 신경 영양 인자 (GDNF)) AF터 24 시간. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 2 주간 일주일에 두 번 신경 분화 매체를 변경합니다. </li></ol></li><li> Astroglial 차별화 : <ol><li> 피펫으로 신경 줄기 세포를 해리. </li><li> 세포를 세어 5 × 104 세포 / ml의 세포 농도를 조절한다. 24 웰 플레이트에 세포를 시드. 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM / F12 배지로 교체하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 배양한다. </li><li> 2 주간 일주일에 두 번 매체 변경합니다. 세포가 이주 전에 합류에 도달하면, 단계 3.2.1과 3.2.2 다음 세포를 replate. </li></ol></li><li> 희소 돌기 아교 세포의 분화 : <ol><li> 피펫으로 신경 줄기 세포를 해리. </li><li> 희소 돌기 아교 differenti 1 ml의 세포 및 종자 폴리 -L- 오르니 틴 코팅 된 24 웰 플레이트에 1 × 105 세포 개수, N2 보충제를 함유하는 DMEM / F12 혈소판 유래 성장 인자-AA (PDGF-AA) 10ng의 / ㎖, 뉴로 트로 핀 -3 (NT-3)의 2 ng를 / ㎖, 소닉 헤지 호그의 2 ng를 / ㎖로 이루어진 ATION 매체 ( 쉬) 및 트리 요오 도티 로닌 (T3 3 ㎚). 주식을 5 %에서 37 ° C에서 2 배양기를 세포를 품어. </li><li> 2 주간 일주일에 두 번 매체 변경합니다. </li><li> DMEM / 1xN2 보충과 F12와 T3의 3 nM의 문화 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 생산을위한 추가 주에 대한 세포 매체를 교체합니다. </li></ol></li></ol> 4. 면역 형광 염색법 <ol><li> 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 미디어를 교체합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. </li><li> PFA를 버리고 PBS 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T) 3 회, 5 분마다 포함 씻어. </li><li> PBS는 RT에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 세포를 Permeabilize 하시려면. </li><li> PBS-T는 RT에서 20 분 동안 4 % 염소 혈청을 함유하는 세포와 차단. </li><li> 해당 차 antibo와 세포를 품어냉장실 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 0.1 % BSA를 함유하는 PBS-T에 희석 죽는다. </li><li> PBS-T, 5 분마다 3 번 세포를 씻으십시오. 어둠 속에서 진탕 기에서 1 시간 동안 0.1 % BSA를 함유하는 PBS-T에 희석 400 : 1을 사용하는 형광 색소와 결합 이차 항체에 상응하는 세포를 배양한다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 4 &#39;, 6 diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)를 포함하는 PBS-T와 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 5 분마다 PBS-T로 세포를 두 번 더 씻는다. </li><li> 현미경을 사용하여 레이블 세포를 관찰하고 걸릴 사진 (그림 3). </li></ol>

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	<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny.">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS ONE. 6, e20941 (2011).</li><li>Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroblast+assay:+an+assay+for+the+generation+and+enrichment+of+neuronal+progenitor+cells+from+differentiating+neural+stem+cell+progeny+using+flow+cytometry.">The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry.</a> J Vis Exp. 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The study is funded by NIH intramural funds.

직접 주연 조혈 전구 세포로부터 신경 줄기 세포를 생성하는 상세한 프로토콜이 제공된다. 섬유 아세포에 비교하여, 인간 말초 혈액 더 접근 할 수있다. 제시된 프로토콜 이상 1 × 105 조혈 전구 세포 또는 CD34 양성 세포를 이용하여, 전혈을 10 ㎖에서 농축 될 수있다. 혈소판 오염 보통 예방하지 않지만, 용이하게, 저속 원심 분리에 의해 감소​​ 될 수 있으며 신경 줄?...

시험관 내에서의 연결을 문화는 신경 질환의 연구를위한 기본적인 도구로 사용되어왔다. 일차 동물 (주로 쥐) 신경 배양 1, 2, 또는 다른 신경 교종 종양에서 유래 인간 신경 세포주는 가장 일반적으로 사용되는 등의 연구에있다. 그러나, 설치류 및 인간 세포 사이에 상당한 차이가 있음을 인식하고있다. 설치류에 기초하여 다수의 발견은 인간으로 변환 될 수 없다. 또한, 대량의 게놈 정보 및 비교적 쉽게 유전자 편집 및 총 유전체 분석의 급속한 발전과 함께, 추세는 더욱 기어 몇몇 인간 신경 세포를 만드는 질병 경향 유전자를 검색하고 특정 질환의 기능 및 역할을 서술하는 것 세포주 만 사용을 제한. 이론적으로, 환자 신경계의 샘플에서 파생 된 인간의 기본 신경 문화 최선의 선택을하지만 그들은 얻을 불가능하다; 따라서 다른 메타ODS가 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 몇몇 접근법은 두 가장 구별되는 함께 진행되고있다. 생성 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)을 사용하여 마우스 및 인간 체세포 기술의 발달에 따라 3, 4는, 신경 세포들을 상기 5-7에서 차이가있을 수있다. 그러나, 생성 및 IPSC을 특성화하는 것은 노동 집약적, 기술, 시간 입력을 요구하고, 때로는 엄청나게. 얼마 후, 또 다른 접근 방식은 직접 체세포 8, 9에서 신경 세포를 변환하기 위해 개발되었다. 생성 된 뉴런 비 증식하는, 그 예의 연구 및 세포 많이 필요 약물 스크리닝에의 응용을 제한한다. 두 가지 기술, 신경 줄기를 직접 유도의 장점을 활용하려면 / 체세포에서 전구 세포는 여전히 IPSC 생성 및 특성화하지만 있습니다 provi의 지루한 과정을 거치지 여러 그룹 10-12에 의해 탐구되었다데 나중에 신경 분화 신경 줄기 세포의 괜찮은 번호. 우리는 이전에 조혈 전구 세포로 야마나카 전사 인자의 도입 다음, 신경 줄기 세포가 직접적으로 매체 (13)를 선택하는 신경 전구 세포를 이용하여 생성 될 수 있음을 보여 주었다. 여기서 우리는 자세히 방법을보고한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="584">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Material List</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Name</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:72px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Lymphocyte Separation Medium</td>
			<td style="width:171px;">Lonza</td>
			<td style="width:135px;">17-829E</td>
			<td style="width:72px;">1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SepMate</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">15415</td>
			<td style="width:72px;">15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Human Serum</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">34005-100</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:135px;">15240-062</td>
			<td align="right" style="width:72px;">1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CD34 MultiSort Kit</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-056-701</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Cellgro</td>
			<td style="width:135px;">46-034-Cl&#160;</td>
			<td style="width:72px;">2mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">MACS LS Column</td>
			<td style="width:171px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-042-401</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">StemSpan SFEM Medium</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:135px;">9650</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IMDM</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:135px;">112-035-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TPO</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-18</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Flt-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-19</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">SCF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">300-07</td>
			<td style="width:72px;">100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-6</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-06</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IL-7&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">200-07</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">IPS Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1378001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:171px;">Sarstedt</td>
			<td align="right" style="width:135px;">83.183</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMSO</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D2650</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">CryoTube vials</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:135px;">368632</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Mr. Frosty container</td>
			<td style="width:171px;">Thermo</td>
			<td style="width:135px;">5100-0001</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">12400-024</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A2934</td>
			<td style="width:72px;">0.1% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">bFGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-18B</td>
			<td style="width:72px;">20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">EGF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">AF-100-15</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:171px;">Life technologies</td>
			<td style="width:135px;">17504-044</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NSC serum free medium</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">A1050901</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:208px;">Poly-D-lysine/laminin coated cover slips</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">BD Bioscences</td>
			<td align="right" rowspan="2" style="width:135px;">354087</td>
			<td rowspan="2" style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">cAMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A9501</td>
			<td style="width:72px;">300 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Vitamin C</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">A0278</td>
			<td style="width:72px;">0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-02</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">GDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-10</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P4957</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PDGF-AA</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">100-13A</td>
			<td style="width:72px;">10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">NT-3</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">450-03</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Shh</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">1314-SH/CF</td>
			<td style="width:72px;">2 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">T3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T6397</td>
			<td style="width:72px;">3 nM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">PFA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">P6148</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:208px;">PBS</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:135px;">119-069-101</td>
			<td style="width:72px;">1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">Goat serum</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G9023</td>
			<td align="right" style="width:72px;">4%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">T9284</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse monoclonal anti-Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:135px;">AB5922</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-SOX2&#160; antibody</td>
			<td style="width:171px;">Applied Stemcell</td>
			<td style="width:135px;">ASA0120</td>
			<td style="width:72px;">Ready to use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Mouse anti-&#946;III-tubulin antibody</td>
			<td style="width:171px;">Promega</td>
			<td style="width:135px;">G712A</td>
			<td style="width:72px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:208px;">Rabbit anti-GFAP antibody</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">G4546</td>
			<td style="width:72px;">1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Anti-O4 antibody</td>
			<td style="width:171px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">MAB1326</td>
			<td style="width:72px;">IgM; 1 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11012</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A11001</td>
			<td style="width:72px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:208px;">Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody</td>
			<td style="width:171px;">Life techniologies</td>
			<td style="width:135px;">A21042</td>
			<td style="width:72px;">1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:208px;">DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:135px;">D9542</td>
			<td style="width:72px;">1 ug/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of human neural stem cells from peripheral blood hematopoietic progenitor cells

인간의 질병 특정의 연결을 문화는 인간의 신경 질환에 대한 체외 모델의 생성에 필수적이다. 그러나, 인간 성인 일차 배양 신경에 대한 액세스는 고유의 부족 문제를 제기한다. 유도 만능 줄기 세포의 최근 개발 (IPSC)는 환자의 특정 IPSC을 통해 피부 섬유 아 세포에서 신경 문화를 유도하기 위해 또 다른 방법을 제공하지만,이 과정은 노동 집약적이며, 특별한 전문 지식과 자원의 많은 양을 필요로하고, 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 이것은 신경 질환의 연구에이 기술의 다양한 응용 프로그램을 방지 할 수 있습니다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 IPSC 도출 과정을 거치지 않고, 직접 사람 성인 말초 혈액으로부터 신경 줄기 세포를 유도하는 방법을 개발 하였다. 성인 인간의 말초 혈액에서 농축 조혈 전구 세포가 시험 관내에서 배양하고 10 월을 전사 요인 SOX2 함유 센다이 바이러스 벡터로 형질3/4, Klf4 및 c-Myc와. 상기 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 인간 신경 전구 매체를 이용하여 선택되는 세포의 형태 학적 변화의 형질 전환 결과. 생성 된 세포는 네 스틴과 같은 SOX2 같은 신경 줄기 세포 마커에 대한 발현을 특징으로한다. 이러한 신경 줄기 세포는 더 뉴런, 아스트로 글 리아 세포가 지정된 차별화 미디어에서 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 쉽게 접근 인간 말초 혈액 샘플을 사용하여,이 방법은 신경 질환의 체외 모델링 신경 세포로 더욱 분화 신경 줄기 세포를 유도하는데 이용 될 수 있으며, 이들 질환의 병인 및 치료에 관한 시험을 진행할 수있다.

<html> CD34 세포의 품질은 신경 줄기 세포 전달의 성공에 중요하다. 높은 품질의 CD34 세포는 문화의 일의 처음 몇 동안 증식 단지 배양 용기 (그림 1A)의 바닥 위에 떠, 비 점착성, 균일 라운드 세포로 나타납니다. 세포의 확장이 아닌 특정 세포 집계 세포 배양 중에 발생할 수 있지만, 시간 (그림 1B)를 통해 확장 집계 및 협회의 성공적인 감염 결과가 느슨하다. 부착 세포는 일?...

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Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

direct-induction-human-neural-stem-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.4K 조회수.  National Institutes of Health.  직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다. 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro is essential for mechanistic studies of the endothelial-hematopoietic transition and hematopoietic specification. Here, we describe a method for the efficient induction of HE from human pluripotent stem cells (hPSCs) by way of overexpression of different sets of transcription factors. The combination of ETV2 and GATA1 or GATA2 TFs is used to induce HE with pan-myeloid potential, while a combination of GATA2 and TAL1 transcription factors allows for the production of HE with erythroid and megakaryocytic potential. The addition of LMO2 to GATA2 and TAL1 combination substantially accelerates differentiation and increases erythroid and megakaryocytic cells production. This method provides an efficient and rapid means of HE induction from hPSCs and allows for the observation of the endothelial-hematopoietic transition in a culture dish. The protocol includes hPSCs transduction procedures and post-transduction analysis of HE and blood progenitors.

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...