P3 절단은 포유류 상형 재생을 조사하기 위한 전임상 모델이며 내인성 재생을 제어하는 중요한 세포 집단 및 메커니즘을 식별하기위한 강력한 도구입니다. P3 모델은 조기 및 후기 발아 세포 집단의 식별, 재생 중 의 재변 성 연구, 복잡한 뼈 안정화 장치 요구 사항없이 내성 골화의 조사를 허용합니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 오사마 쿠레시, 알리사 팔크, 그리고 캐서린 짐멜, 기술자, 레지나 브루나에르, 우리의 실험실에서 모두 연구 조교수가 될 것입니다.
8 주에서 12 주 된 CD-1 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 10배 해부 현미경 아래에 마우스를 배치합니다. 수술용 포비도네 요오드와 70%에탄올을 사용하여 각 뒷다리의 숫자를 살균하고 미세 시저를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 다듬습니다. 국소 부피바카인 1개를 국소 부피바카인 1개를 현지에서 적용하여 수술 부위를 마취하고, 한 뒷발을 부드럽게 재생하여 내측 자릿수 표면을 노출시합니다.
그런 다음 메스를 지방 패드와 평행하게 각도로 잡고 멸균 번호 10 메스를 사용하여 2 자리와 4 자리의 단말 지골의 단부 끝을 절단합니다. 절단된 각 수분에 부피바카인 을 추가로 적용하고 마우스를 깨끗한 케이지로 돌려보내 상처 드레싱 없이 완전한 재조정까지 모니터링할 수 있도록 하십시오. 성공적인 P3 절단 평면을 보장하기 위해 절단 중에 메스를 지방 패드와 평행하게 잡고 미세 CT 스캐닝을 수행하여 올바른 절단 길이를 확인합니다.
적절한 실험 종점에서 메스를 사용하여 약 두 번째 복부 지방 패드 들여쓰기에서 중간 지골 뼈를 통해 중간 지골 뼈를 통해 숫자를 끊습니다. 24~48시간 동안 10밀리리터의 신선한 완충 아연 포르말린 고정을 포함하는 20밀리리터 신발성 바이알로 조직을 옮기다. 그리고 마이크로토메를 사용하여 각 자릿수의 4~5마이크로미터 두께의 부분을 획득하여 슬라이스를 38~41도의 수조에 배치하여 조직학적 접착제 용액을 획득합니다.
그런 다음 점착 슬라이드에 슬라이스를 캡처하고 건조 37도 섭씨 슬라이드 워머에 슬라이드를 배치합니다. 슬라이드가 적절한 항원 검색 용액의 염색 용기에 샘플을 담그고 슬라이드를 25분 동안 섭씨 95도로 가열하여 끓이지 않도록 합니다. 인큐베이션의 끝에서 항아리가 실온에 와서 바닥에 촉촉한 티슈 페이퍼가있는 1 인치 깊이 덮인 플라스틱 슬라이드 상자에 슬라이드를 평평하게 놓습니다.
각 샘플에 미리 따뜻해지는 단백질Ase K 100 마이크로리터를 추가합니다. 각 슬라이드를 작은 파라필름 스트립으로 덮어 섹션이 건조하지 않도록 합니다. 섭씨 37도에서 12분 후, 파라핀 필름을 조심스럽게 제거하고 티슈 페이퍼의 슬라이드를 부드럽게 배출하여 과도한 차단 용액을 제거합니다.
다음으로, 각 슬라이드에 관심있는 1 차 항체 용액의 100 ~ 200 마이크로 리터를 추가합니다. 4도에서 하룻밤 잠복을 위해 파라핀 필름으로 덮인 가습 챔버로 사이트를 반환하십시오. 다음날 아침 TRIS 완충식식염수와 TWEEN 또는 TBST라벨은 빛으로부터 보호되는 실온에서 45분 배양에 적합한 이차 항체 용액으로 슬라이드를 라벨로 표시합니다.
인큐베이션이 끝나면 TBST에서 슬라이드를 세척하고 건조시키십시오. 그런 다음 100 마이크로리터의 페이드 장착 매체를 사용하여 말린 슬라이드에 커버립을 조심스럽게 배치하고 매끄러움으로부터 보호되는 실온에서 슬라이드를 평평하게 보관하여 장착 매체가 건조할 수 있도록 합니다. 순차적으로 생체 내 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 마이크로 CT 복장을 위해 마이크로 CT 동물 챔버안팎으로 산소 흐름을 가능하게 하는 튜브가 있는 마이크로 CT 이미저를 사용하여 유출된 산소에 이소플루란을 포획하기 위한 활성탄 필터가 장착되어 있는지 확인합니다.
Voxelsize를 55피크 킬로전압에서 10.5마이크로미터로 설정하고 180도당 1, 000프로젝션, 연속 회전 시간은 200밀리초로 연속 회전하여 스캔당 최대 213개의 슬라이스를 생성합니다. 스캐너가 준비되면 마취된 마우스를 마이크로 CT 동물 챔버에 부드럽게 배치하고 뒷다리 숫자가 평평하고 가까운 접견 복부 면을 왼쪽 에 있는 왼쪽 발과 스캐닝 플랫폼의 오른쪽에 배치합니다. 그런 다음 수술 용 테이프를 적용하여 숫자를 부드럽게 고정하십시오.
검사를 시작하기 전에 동물의 눈에 안과 연고를 바치면 됩니다. 스캔 후, 완전한 recumncy까지 모니터링깨끗한 케이지에 동물을 반환하고 마이크로 CT 이미지 재구성을 위해 최대 몇 시간을 허용합니다. 재구성된 3D 골격 이미지를 분석하려면 마이크로 CT와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 일련의 DICOM 파일로 변환합니다.
모든 파일이 변환되면 웹 브라우저에서 일괄 처리 파일 다운로더를 사용하여 단일 폴더에서 DICOM 시리즈를 다운로드합니다. ImageJ 플러그인 폴더에 BoneJ 플러그인을 로드합니다. DICOM 파일 시리즈 폴더를 ImageJ 막대에 드래그 앤 드롭하여 파일을 엽니다.
모든 회색 값을 표시하는 16비트 이미지 스택이 열립니다. 골격만 표시하려면 이미지 조정 및 임계값을 클릭합니다. 위쪽 임계값 막대를 맨 오른쪽으로 밀어 내고 골격만 빨간색으로 강조 표시될 때까지 아래 임계값 막대를 조정합니다.
낮은 임계값은 32, 767의 최대 신호 강도에서 약 10, 000 ~ 13, 000이 될 것이다. 적용을 클릭하고 새 대화 상자에서 검은 배경을 클릭합니다. 다음으로 확인을 클릭합니다. 흑백 값을 표시하는 8비트 이미지가 생성됩니다.
뼈에 해당하는 흰색으로. P3 골격 주위에 사각형을 그려 서 선택하고 스택을 복제합니다. 3D 이미지를 생성하려면 플러그인 및 3D 뷰어를 클릭하고 프리핸드 선택 도구를 사용하여 삭제할 골격을 동그라미로 조정합니다.
그런 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 채우기 선택을 선택하여 이미지에서 불필요한 골격을 자르게 합니다. 3D 렌더링에서 골격 볼륨을 정량화하려면 BoneJ 플러그인을 열고 볼륨 분수를 선택합니다. 결과 창이 나타나고 골격 볼륨이 밀리미터 큐브단위로 표시됩니다.
3D 렌더링에서 골격 길이를 정량화하려면 ImageJ 멀티포인트 도구를 사용합니다. 3D 렌더링의 이미지를 캡처하려면 보기를 클릭하고 스냅샷을 찍습니다. 그런 다음 이미지를 TIF 또는 JPEG 파일로 저장합니다.
P3 숫자를 재생하는 성인 마우스의 이러한 이미지 섹션에서는 6일째에서 7일, 9일 및 10일째에 자궁내 골 재생 및 블라데마 형성을 시각화하기 위해 항체로 면역염색하였다. 여기서, 절단 전에 스캔된 숫자의 대표적인 마이크로 CT 렌더링과 길이 측정을 식별하는 데 사용되는 랜드마크를 사용하여 재생하는 동안 다양한 시점에서 스캔한 것이 표시됩니다. 마우스 자리 모델은 말단 수준에서 절단 할 때 블라데마 형성을 트리거 프로 재생 상처 환경을 분석하기위한 강력한 시스템입니다.
반대로, 숫자의 근위 절단은 재생 실패를 조사하기 위한 모델 시스템뿐만 아니라 재생을 향상시키기 위한 테스트 전략을 위한 사이트역할을 합니다.
