운동 뉴런의 다른 특수형을 생성의 가능성은 근위축성 측삭 경화증과 같은 현대 운동 신경 질환을 모델링하는 데 특히 관련이 있습니다. 이 방법은 짧은 시간 프레임과 정화 단계없이 척추 또는 두개골 정체성을 가진 운동 뉴런에 대해 매우 경직된 세포 집단을 획득 할 수 있습니다. 단순화된 배양 조건 하에서 유도된 만능 줄기 세포 또는 iPSC로부터 인간 모터 뉴런의 생성은 운동 신경 질환에 대한 약물 스크리닝을 용이하게 할 수 있다.
프로그래밍 전사 인자의 유도식 발현은 iPSC 리포지토리로부터 뉴런, 골격 근 및 신경교 세포와 같은 다른 세포 유형을 생성하는 데 사용될 수 있다. NIL 및 NIP iPSC 라인 생성의 경우, 37°C에서 5~10분 동안 세포 해리 시약으로 세포를 치료하기 전에 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 인간 iPSC 배양을 헹구는 다. 세포가 배양 용기에서 분리되기 시작하면 P1000 파이펫을 사용하여 세포를 3~4회 부드럽게 수동으로 분리합니다.
세포를 15 밀리리터 튜브로 옮기고 칼슘과 마그네슘없이 신선한 PBS로 최종 볼륨을 최대 10 밀리리터까지 가져 오십시오. 원심분리에 의해 10-6세포를 1회 수집하고 전기기 키트로부터 완충 R의 100마이크로리터에서 펠릿을 재보펜한다. 트랜스포지션 벡터 플라즈마 DNA 4.5 마이크로그램과 피기박 트랜스포사제 플라즈마 DNA0.5 마이크로그램을 추가하여 트랜스페션을 생성합니다.
표시된 매개 변수를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 전기 포기 시스템을 가진 트랜스펙트. 그런 다음, 인간 iPSC 배지에서 세포를 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 마이크로몰러 ROCK 억제제 Y-27632로 보충하였다. 이식 후 이틀, 세포가 이식되지 않은 세포를 반성하기 위해 적어도 7-10 일 동안 항생제에 세포를 유지하는 배양 배지에 블라스티시딘의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 다른 수의 트랜스유전자및 상이한 통합 사이트 또는 분리 단일 클론을 가진 세포로 구성된 혼합 된 집단으로서 안정적으로 전이된 세포를 유지한다. 앞서 설명한 바와 같이 신경게닌-2에 대한 트랜스진 특이 프라이머를 가진 RT-PCR에 의해 평가될 독시사이클린 유도의 밀리리터 당 1 마이크로그램당 트랜스게인의 효과적인 발현을 허용하는 추가 접시를 준비한다. 이 단계에서, 소설 NIL및 NIP iPSC 라인의 주식도 인간 iPSC에 대한 동결 매체에서 동결되어야한다.
모터 뉴런 분화의 경우, DMEM/F12 배지의 5부량을 포함하는 15밀리리터 튜브에서 세포를 수집할 수 있도록 입증된 바와 같이 해리 시약으로 안정적으로 전이된 세포 배양을 해리한다. 원심분리 후, 계수를 위한 마이크로몰라 ROCK 억제제로 보충된 인간 iPSC 배지에서 세포를 재중단한다. 매트릭스 코팅 된 접시에 세포를 씨앗 6.25 시간 10 제 4 세포 센티미터 제곱 밀도.
다음 이틀 동안, 초자연적 인 분화 매체로 대체 독시 사이클린으로 보충. 둘째 날에는 감마 분비 효소 억제제, 혈관 내피 성장 인자 수용체 억제제 및 독시실린으로 보충된 신경 물질 B27 배지로 배지를 변경합니다. 5일째에, 입증된 바와 같이 세포를 분리하고 계고를 위해 DMEM/F12 배지의 4밀리리터에서 분리된 세포를 다시 중단한다.
피펫팅은 셀의 완전한 해리에 중요합니다. 제조업체의 지시에 따라 세포 동결 배지에서 운동 뉴런 전조의 알리쿼터를 동결하고 원심분리에 의해 나머지 세포를 수집합니다. 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제로 보충 된 신경 매체에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
폴리오니틴 라미닌 코팅 마이크로슬라이드에 세포를 10번 10번 에서 5분의 1의 제곱밀도로 파종한다. 6일째에는, 지지 표면에서 세포를 분리하지 않고 다운스트림 분석까지 배양억제제 없이 배지를 신선한 뉴런 배지로 신중하게 교체한다. 분만성 마커 옥타머 결합 전사 인자 4 또는 OTC4의 균일한 발현은 팬 뉴런 마커 뉴런 특이적 클래스의 부재시 0일 제로에 세포 배양을 분화하여 3개의 베타-튜툴린 TUJ1 양성성을 관찰할 수 있다.
셋째 날에는 OCT4 양성 세포의 수가 크게 감소하는 것이 분명합니다. 즉, 차별화 된 iPSC의 하위 집합에서 TUJ1의 표현에 의해 미러링됩니다. 5일째에는 TUJ1의 일관된 발현과 획득한 뉴런 형태에 대한 일관된 발현을 보여주는 인구에서 OCT4의 발현이 관찰되지 않는다.
면역염색 분석 7일 후 운동 뉴런 전구 세포의 투석 후 TUJ1 및 성숙한 운동 신경 마커 콜린 아세틸 트랜스퍼라아제의 균일한 발현을 드러낸다. iPSC NIL 유래 뉴런은 전압에 의존하는 나트륨 전류와 전압 의존성 칼륨 전류를 성공적으로 표시합니다. 현재 클램프 양면에 고정된 iPSC NIL 유래 모터 뉴런의 80%는 현재 펄스60피쿠앰프 이상을 주입할 때 스파이크 트레인을 발동할 수 있다.
기록된 세포의 50% 이상에서 반복발사를 유도하는 데 필요한 최소 전류는 약 마이너스 38밀리볼트의 스파이크 임계값과 평균 발사 빈도가 약 8헤르츠의 40피코프를 더한 40피코프를 더한 40개의 피코암프를 더한 플러스40피콥스이며, 이는 iPSC NIL 유래 척추 운동 뉴런이 성숙한 뉴런의 전형적인 기능적 특성을 나타낸다는 것을 시사한다. 척추 및 두개골 운동 뉴런은 병리학적 돌연변이를 운반하는 제어 된 iPSC 또는 iPSC에서 파생 될 수 있으며 이러한 세포는 약물 검사 모델로 또는 약물 스크리닝을 위해 사용될 수 있습니다. 우리의 방법은 다른 모터 뉴런 유닛이 ALS에 의해 차별화적으로 영향을받는 이유를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
