이 연구의 전반적인 목표는 인간 IPS 세포를 학습하고 신경 혈통으로 분화하기 위한 자동화된 절차를 구현하는 방법과 자동화된 이미징을 구현하는 방법을 보여주는 것입니다. 표준화된 자동화 된 절차는 높은 현상 재현성을 보장하면서 낮은 실험 적 변화를 허용합니다. 또한 새로운 프로토콜의 개발에 맞게 시스템을 조정할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 요아킴 태거와 엘리젤라 브레산, 우리의 실험실에서 포스트 문서입니다. 자동화 된 시스템의 그래픽 사용자 인터페이스에서 리소스 계측기 프로세스 보기를 클릭하고 리소스 계측기 프로세스를 선택합니다. 실행 계측기 프로세스를 클릭하고 실행 HEPA 후드및 다시 로드 프로세스를 실행합니다.
로드할 리소스를 선택하고, 도어를 열고, 팝업 이미지에 표시된 대로 적절한 위치에 셀 배양 판과 일회용 팁을 로드합니다. 그런 다음 닫기 전에 70 %의 에탄올로 문을 오염 제거하고 오염 제거 프로세스를 실행합니다. 이 시스템은 30분 동안 UV 방사선에 의해 멸균됩니다.
배양 배지 또는 해리 시약으로 플레이트를 적재하려면 HEPA 후드 스텝을 실행하고 액체 처리 스테이션의 문을 엽니다. 70%에탄올로 오염 제거 후, 저수지를 갑판에 배치하여 할당된 위치에 놓고 뚜껑을 닫습니다. 액체 처리 스테이션의 문을 닫은 다음 InitHepaHood 자원 계측기 프로세스를 실행하여 HEPA 후드를 전원을 공급합니다.
자동화된 배양 방법을 실행하려면 그래픽 사용자 인터페이스의 캘린더 뷰에서 프로세스 단계를 클릭하고 실험에 사용할 셀줄을 선택합니다. 마법사를 사용하여 프로젝트를 선택하고 사용할 일괄 처리를 표시합니다. 오른쪽 화살표 헤드를 클릭하고 실행할 프로세스 단계를 선택하려면 마법사의 다음 페이지로 이동합니다.
마법사의 마지막 페이지에서 실험을 예약하고 메서드를 실행하는 데 필요한 적절한 매개 변수 세부 정보 변수를 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 인간 IPS 셀 서스펜션으로 50 밀리리터 튜브를 적재한 후, 선반상에서 세포를 수신하기 위한 코팅된 배양판을 적재하고 튜브 방법으로부터 플레이트의 파싱을 실행한다. 브라이트필드 이미징 사이토미터의 세포를 계산하려면 덱에 셀 서스펜션이 있는 384웰 카운팅 플레이트를 자동으로 준비하고 로봇 암을 사용하여 데크에서 브라이트필드 이미징 사이토미터로 384웰 카운팅 플레이트를 전송합니다.
계산 후 시스템은 플레이트를 원래 위치로 되돌리고 코팅된 문화권 또는 분석판을 선반에서 파이펫팅 데크로 옮깁니다. 그런 다음 시스템은 플레이트에 적합한 사용자 정의 번호 및 볼륨의 셀을 시드하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 시드 후, 플레이트는 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨지기 전에 세포 분포를 위해 분당 500회전에서 10초 동안 온데크 셰이커로 이동됩니다.
자동화된 합류를 평가하려면 검사 합류 방법을 실행하고 적어도 하나의 배양 판과 분석 플레이트가 없는 배치를 선택합니다. 매개 변수 세부 정보 섹션에서 이미징 분석 설정에서 이미지 수집을 위해 iPSCf_2020 입력합니다. 그런 다음 시스템은 인큐베이터에서 브라이트필드 이미징 세포계로 첫 번째 플레이트를 전송하고 세포 합류를 이미지화합니다.
세포 배양 또는 분석 플레이트 미디어를 변경하려면 배양 판 방법의 미디어 변경을 실행하고 배양 판만 포함하는 배치를 선택합니다. 시스템은 판을 갑판으로 옮기고 판을 기울여 상체의 포부를 허용합니다. 상체는 폐기물 수거 모듈에 버려지고 팁을 폐기하고 신선한 매체의 12 밀리리터가 각 접시에 추가됩니다.
그런 다음 시스템은 플레이트를 다시 뚜껑을 닫고 판을 세포 배양 인큐베이터로 반환합니다. 또는 분석 플레이트의 매체를 변경하려면 분석 플레이트 방법의 미디어 변경을 실행합니다. 세포를 경작하기 위해, 부착 된 세포 방법의 하위 경작을 실행하고 하위 가 필요한 배양 판을 포함하는 배치를 선택합니다.
매체를 폐기한 후, 시스템은 세포에 0.5 밀리롤러 EDTA의 8밀리리터를 추가하기 전에 플레이트당 PBS8 밀리리터로 세포를 한 번 씻는다. 기울기 옵션으로 갑판에서 8분 후 EDTA는 플레이트당 12밀리리터의 신선한 매체로 대체됩니다. 이 시스템은 식민지를 50~80마이크로른 덩어리로 나누기 위해 5주기의 파이프팅으로 세포를 세트리히하기 전에 식민지를 제거하기 위해 분당 2, 000 회전에서 플레이트를 흔들것입니다.
그런 다음 세포는 갑판에 있는 50 밀리리터 튜브로 옮겨진 다음 1대 7 분할 비율로 시드됩니다. 자동화된 고함량, 높은 처리량 세포 이미징의 경우 이미징 방법을 실행하고 적어도 하나의 분석 플레이트와 배양 판이 없는 배치를 선택합니다. 그런 다음 시스템은 이미징을 위해 자동 공초점 현미경으로 분석 플레이트를 전송합니다.
필요한 프로세스 단계를 수행하는 동안 올바른 배치 및 플레이트 ID를 선택해야 합니다. hiPSC 배양은 성장을 위해 매일 감시되고 브라이트필드 이미징 사이토미터에서 의 합류 비율을 분석해야 합니다. 수동 또는 자동화된 시스템 배양 후, 세포는 전형적인 줄기 세포 및 흉부 마커 발현을 나타낸다.
자동화된 배양 시스템에서 분화된 뉴런은 수동으로 재배되는 뉴런과 유사한 형태학 및 뉴런 네트워크 조직을 시연한다. 6일간의 분화 후, 자동으로 분화된 피질 뉴런은 뉴런 특이적 등급 III 베타-튜룰린 및 상부 피질 층 마커 발현에 대해 양성이다. 8 일 후, 세포는 또한 마이크로 튜블러 관련 단백질 2, 신경 세포 접착 분자, 및 시냅신 I뿐만 아니라 피질 뉴런 마커를 표현했다.
이러한 마커의 발현은 매우 낮거나 전혀 hiPSC에서 관찰되지 않습니다. 이 시스템은 또한 중성염 길이가 수동 개입없이 분화의 11 일 이상 측정 할 수 있도록 라이브 셀 자동화 된 neurite 아웃 성장 분석체를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 자동화된 배양 시스템을 사용하여 65일 간의 배양 기간 동안 중간 변화를 수행하면 예상 된 세포 조직 및 형태와 함께 중뇌 도파민 성 뉴런으로 hiPSC 분화를 용이하게합니다.
중성염 외성장 이외에, 신경 변성을 연구하는 것과 관련된 다른 자동화된 피노티픽 어약, 예를 들어, TDP-43 전좌 RNA 포시 및 알파 시뉴클레인 피브릴 섭취량은 이 높은 처리량, 높은 함량의 포맷을 사용하여 탐구할 수 있다.
