라이브러리 스크리닝이라고 불리는 당사의 풀드sgRNA는 게놈 전체의 비코딩 요소의 생물학적 기능을 식별하고 평가하는 강력한 유전적 접근법입니다. 이 기술을 통해 우리는 표적 유전자 발현에 관련된 결합 부위, 색채 경계 또는 기타 규제 요소를 방해하는 효과를 검사할 수 있습니다. 우리의 접근은 초기 배아 발달에 있는 HOX 유전자 규정에서 CTCF, 긴 비 코딩 RNA 및 증강제의 역할을, 뿐만 아니라 비정상적인 HOX 유전자 서명을 가진 특정 백혈병의 역할을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다.
CTCF 바인딩 사이트를 대상으로 하는 sgRNA의 설계로 이 절차를 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포 제제에서 sgRNA 라이브러리의 복제. 렌티바이러스를 포장하기 위해, cotransfect HEK293 T 세포에 20 마이크로그램의 정제 된 라이브러리 벡터, 포장 된 플라스미드의 15 마이크로 그램, 그리고 봉투 플라스미드의 10 마이크로 그램, 바이러스를 수확하기 전에 48 시간 동안.
48 시간 후에, 바이러스 상체를 수집하고 0.45 미크론 저단백질 결합 PVDF 막을 통해 필터링합니다. 다음으로, 농축기사용, 렌티바이러스 상체를 50배 씩 농축한다. 농축 된 바이러스를 알리쿼트와 영하 80도 냉동고에 저장합니다.
MOLM13 세포를 농축 렌티바이러스의 다양한 용량과 혼합하여 총 6개의 총 군에 대해 12개의 웰 플레이트의 별도의 우물에서 작업한다. 즉시 33섭씨에서 2시간 동안 1000배 g의 혼합물을 원심분리합니다. 12개의 웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 인큐베이터로 다시 옮길 수 있습니다.
셀 팔레트를 방해하지 않고 슈퍼나탄을 부드럽게 흡인시키고, 신선한 보충 RPMI 1640 배지로 변환된 세포를 다시 중단한다. 그런 다음 다시 중단된 세포를 T25 플라스크로 옮기고 푸오마이신없이 48시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 48시간 후에 이 세포를 2개의 플라스크로 분할한 후에, 5일 동안 밀리리터 푸오마이신 당 1개의 마이크로리터로 취급된 실험군 및 5일 동안 푸오마이신 처리 없이 대조군.
푸오마이신 처리 없이 세포의 수로 푸오마이신으로 처리된 살아있는 세포의 수를 분할하여 전이에 최적화된 MOI 값을 측정합니다. 풀이 된 라이브러리로 세포를 변환하려면, sgRNA 풀렌티바이러스의 0.3 MOI를 가진 6 웰 플레이트에 150만 MOLM13 세포를 감염시 배지에서 렌티바이러스를 풀로 한다. 렌즈 바이러스 감염없이 세포를 대조군으로 사용하십시오.
즉시 세포를 소독하기 위해 섭씨 33도에서 2 시간 동안 1000 배 g에서 6 개의 우물 플레이트를 원심 분리합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 4시간 동안 5%의 이산화탄소로 다시 배양합니다. 셀 팔레트를 방해하지 않고 부드럽게 슈퍼내퍼나탈트를 흡인시키고, 환원된 세포를 신선한 배지로 다시 중단한다.
그런 다음 세포를 T25 플라스크로 옮기고 푸오마이신없이 48 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 48 시간 후에, 5 일 동안 밀리리터 puromycin 당 1 개의 마이크로 그램으로 세포를 치료하십시오. 2 일 후에 신선한 매체를 교환하고 최적의 세포 밀도를 유지합니다.
희석 방법을 제한하는 96 웰 플레이트에서 단일 클론을 시드합니다. 이 단일 클론을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 3-4 주 동안 그들을 문화.
sgRNA 통합 MOLM13 세포를 0.4%의 Trypan Blue 용액 염색으로 계산한 다음 잘 10, 000 개의 라이브 셀을 96 개의 잘 PCR 플레이트로 전송합니다. 접시를 5분 동안 1000배 g로 원심분리한 다음 피펫으로 상판을 철저히 제거하고 폐기합니다. 셀 팔레트를 방해하지 마십시오.
텍스트에 설명된 바와 같이 세포를 세척한 후 각 웰에 셀 리시스 마스터 믹스의 50 마이크로리터를 첨가한다. 파이펫은 셀 팔레트를 다시 일시 중단하기 위해 5번 위아래로 합니다. 상온에서 10분 동안 믹스를 배양합니다.
그런 다음 혼합물을 섭씨 37도에서 5분간 옮은 다음, 섭씨 75도를 추가로 5분간 옮김시합니다. 이제 RT qPCR 반응 믹스를 포함하는 PCR 웰에 셀 리세이트의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 이러한 혼합에는 마커 유전자가 전방 및 역프라이머, 역실사 및 1단계 반응 믹스를 포함한다.
섭씨 50도에서 10분 동안 역전사 반응을 실행하고, 95도에서 1분간 DNA-데니션을 사용한다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 40사이클의 PCR 반응으로 RT PCR을 수행합니다. HOXA9감소발클론을 Sanger 시퀀싱을 통해 검증하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MOLM13 게놈 DNA로 PCR을 수행한다.
PCR 정제 키트로 PCR 제품을 추출하고 정화합니다. 정제된 PCR 제품을 T4 결찰 버퍼, T 벡터 DNA, PCR DNA 및 T4 리구아제로 T 벡터로 리게이트합니다. 하룻밤 사이에 인큐베이터에 리기션 믹스를 넣습니다.
LB 암피실린 항생제 한고 판에 DH5 알파 유능한 세포 및 플레이트로 결찰 믹스를 전송합니다. 하룻밤 사이에 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다. LB 플레이트에서 단일 클론을 선택하고 지노티핑과 Sanger 시퀀싱으로 확인합니다.
200 나노그램의 기준체와 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 200 나노그램의 테스트 PCR 앰플리턴을 가진 헤테로두플렉스 혼합물 군을 설정하였다. 대조군으로서 400나노그램의 레퍼런스 PCR 앰플리콘을 가진 호모듀플렉스 혼합물 군을 포함한다. 800 밀리리터의 물로 채워진 1리터 비커로 5분간 95도의 이테로듀플렉스와 호모듀플렉스 혼합물을 별도로 배양합니다.
그런 다음 혼합물을 실온으로 점진적으로 냉각하여 음막으로 냉각하고 이종 또는 호모듀플렉스를 형성합니다. 지금, 별도로 소화 400 안열 이테로듀플렉스및 호모두플렉스 혼합물의 1개의 마이크로리터인 인델 돌연변이 검출 뉴클레아제, 그리고 60분 동안 42°C에서 뉴클레아제 반응 완충제의 2개의 마이크로리터. 아가로즈 젤 전기포고증으로 소화된 샘플을 분석한다.
이종 혼합물 DNA는 작은 조각으로 절단되어야하며 호모 두플렉스 DNA는 절단되어서는 안됩니다. MOLM13 양성 클론을 표적으로 하는 sgRNA는 대조군 세포와의 비교를 가진 HOXA9 유전자의 발현 수준에 기초하여 RT qPCR 방법으로 확인되었다. 528개의 생존 클론 중 10개의 클론이 HOXA9 수준에서 50% 이상 감소했습니다.
HOXA9에 통합된 sgRNA감소, HOXA9 변경 및 HOXA9 증가 클론, SgRNA의 PCR 증폭 및 Sanger 서열에 의한 식별에 의해 더욱 확인되었다. HOXA9 수준이 감소하는 것을 보여주는 10개의 클론 중 6개는 Sanger 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이 CBS79 사이트를 대상으로 sgRNAs를 포함했다. 통합 sgRNA 양성 클론의 인델 돌연변이는 PCR 계 유전화 및 뉴클레아제 소화에 의해 결정되었다.
HOXA7과 HOXA9 유전자 사이에 위치한 CTCF 사이트의 이종화구균 삭제는 PCR 기반 의 유전자 인식에 의해 확인되었다. HOXA9 감소 클론 5, 6, 28 및 121 CBS79 경계 위치에서 삭제를 나타냈다. 핵소화 분석에 의해 분석된 CBS79 부위에서 인델 돌연변이에 대해 유사한 결과가 관찰되었다.
이 절차를 수행할 때, 핵분석 분석기를 통해 sgRNA 유도 인델 돌연변이를 검출하기 위해 동일한 양의 헤테로듀플렉스 및 호모듀플렉스를 만드는 것이 중요합니다. 우리의 접근은 선택된 마커의 활용을 가능하게 하고, 백혈증에 유전자의 효력을 발견하기 위하여 표적 유전자에 차세대 순서를 실행합니다. 전반적인 우리의 접근은 사후 게놈 프로젝트 오류에 있는 일반적인 생물학 프로세스 및 백혈신생 도중 지적한 유전 불규칙한 요소의 기능적 정확성 그리고 감소를 위한 RPC의 방지합니다.
