테스 J. 라마이어, 루스 프랭크, 마이클 A. 무니악 박사와 맥스 플랑크 플로리다의 야스다 료헤이 박사에게 2pFLIM 인수 소프트웨어에 감사드립니다. 이 작품은 두 개의 브레인 이니셔티브 어워드 U01NS094247 (H.Z. 및 T.M.) 및 R01NS104944 (H.Z. 및 T.M.), R01 교부금 R01NS081071 (T.M.), R21 교부금 R21NS097856 (H.Z)에 의해 지원되었습니다. 모든 상은 미국 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소에서.

여기에 설명된 모든 방법은 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 2pFLIM 현미경 설치
<ol><li>제조업체 설명서에 따라 광자 타이밍 카운팅 모듈(PTCM, 재료표)을 설치하고 컴퓨터에 연결합니다(그림 1). 참고: PTCM은 전형적으로 광증층 튜브(PMT)로부터 레이저 펄스 타이밍 및 광자 입력에 대한 "동기화" 입력을 수신하는 컴퓨터 보드이다. 또한 2광자 이미징 제어 소프트웨어에서 픽셀, 선 및 프레임에 대한 클럭 타이밍을 수신합니다. PTCM은 클럭 신호를 사용하여 개별 광자를 다른 픽셀과 프레임으로 분리합니다.</li>
	<li>>200MHz 대역폭의 포토다이오드를 추가하여 레이저 타이밍을 측정합니다. 레이저 광의 작은 분획을 광이오디오드에 반사하도록 광경로에 표준 유리 커버슬립을배치하여 광경로에 수직으로 배치하였다(도 1). 포토다이오드 출력을 PTCM의 "동기화" 입력에 연결합니다. 참고: 많은 현대 레이저는 또한 레이저 타이밍을 출력. 이러한 레이저의 경우 포토다이오드가 필요하지 않으며 레이저 타이밍 출력을 PTCM의 동기화 입력에 직접 연결할 수 있습니다.</li>
	<li>
낮은 노이즈, 빠른 GaAsP PMT(그림 1)로, tAKARα의 경우, 녹색채널 PMT의 경우 PMT를 교환한다. PMT 출력을 PTCM의 신호 입력에 연결합니다.
	<ol>
<li>선택적 신호 스플리터(도 1)를 추가하면 종래의 2광자 이미징 채널을 통해 강도를 동시에 획득하는 것이 요구된다. PMT 출력을 신호 스플리터에 연결하고 스플리터 출력을 PTCM 및 기존 2광자 이미징 모듈에 연결합니다. 참고: GaAsP PMT는 기존의 비알칼리 PMT보다 더 빠른 단일 광자 신호를 제공하며 광자 타이밍을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. GaAsP PMT의 특정 모델은 주변 온도보다 10-35°C 낮으로 냉각될 수 있으므로 다크 카운트를 초당 수백 개 이하의 수준으로 억제할 수 있습니다(일반적으로 ≤200 카운트/s). 이 낮은 노이즈 레벨은 노이즈 광자 수를 형광 수명 곡선에서 쉽게 구별하거나 빼을 수 없기 때문에 형광 수명을 정밀하게 측정하는 데 중요합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수용기 형광단의 스펙트럼 오염을 최소화하는 밴드 패스 형광 방출 필터를 추가합니다. 예를 들어, tAKARα의 경우, 녹색 채널에 대한 500 nm ±20 nm 장벽 필터는 수용자 sREACh로부터의 오염을 감소시키기 위해 사용되며, 이는 어두운(QY~0.07) 황색 형광 단백질(YFP)29,30이다. 제어 소프트웨어에 적합하고 PTCM 사용자 설명서에 설명된 개별 이미지 픽셀, 선 및 프레임에 대한 시계와 같은 타이밍 신호를 연결합니다. 적절한 데이터 제어 및 수집 소프트웨어를 설치합니다. 참고: 일부 PTCM제조업체(재료 표)는 2pFLIM 이미징을 위한 소프트웨어를 제공합니다. 여기, FLIMimage라는 사용자 정의 소프트웨어가 사용된다, 야스다 연구소에 의해 개발 된 (맥스 플랑크 플로리다, 개인 통신을 통해). 이 소프트웨어는 특정 2 광자 수집 소프트웨어(재료표)에 추가 사용자 기능으로 작동합니다. 2pFLIM 이미지를 획득하기 위해 2광자 이미징 중에 적절한 타이밍에 PTCM을 제어하고 통신합니다.</li>
</ol>2. 전동 러닝 머신 의 건설
참고: 맞춤형 전동 러닝머신의 디자인은 그림2에 나와 있습니다.
<ol><li>폼 롤러(Ø = 200mm)를 미세쇠톱으로 길이 150mm로 자른다. 또는 폼 볼의 두 반쪽을 함께 붙이고 이음새 위에 테이프를 놓습니다. 선택적으로 롤러에 프로파일이 있는 고무 매트를 접착제로 붙이면 롤러의 견인력이 높아지도록 합니다.</li>
	<li>롤러의 평평한 면에서 롤러의 중심을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫거나 폼 볼을 사용하는 경우 공의 각 절반의 중간을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>
구멍을 통해 직경 1/4 인치 강철 차축을 설치합니다. 폼 호환 접착제를 사용하여 폼 롤러 / 볼을 액슬에 붙입니다. 선택적으로, 두 개의 유연한 샤프트 커플링(1/4 인치 내경)을 수정하여 액슬과 폼 롤러/볼의 결합을 강화합니다. 참고: 많은 일반적인 접착제는 거품이 용해 될 수 있습니다.<ol>
<li>각 샤프트 커플링의 경우 샤프트 커플링을 평평한 면과 직사각형 금속 판의 중앙(0.7mm x 15mm x 76mm)에 배치합니다. 샤프트 커플링에 플레이트를 용접합니다. 플레이트 중앙에 1/4 인치 구멍을 뚫어 변형된 샤프트 커플링을 액슬에 설치하고 두 개의 나사 구멍을 중앙에서 금속 판 측면으로 설치할 수 있습니다.</li>
		<li>샤프트 커플링을 폼 롤러/볼에 대고 액슬에 설치합니다. 후자를 사용하는 경우, 공의 곡률에 맞게 플레이트를 약간 구부립니다. 나사를 측면 구멍에 배치하여 액슬의 롤러/공을 고정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>케이지 플레이트 중앙에 있는 3/8-32 나사산드릴을 드릴및 탭하고 로터리 인코더를 설치합니다. 나사 구멍을 직각 모터 브래킷의 베이스에 드릴링하여 모터를 포스트 홀더에 부착할 수 있도록 합니다. 유연한 샤프트 커플링을 사용하여 회전식 인코더와 모터를 액슬 끝에 부착합니다.</li>
	<li>모터 및 회전 인코더용 포스트를 사용하여 알루미늄 브레드 보드에조립된 러닝머신을 설치합니다(그림 2). 모터 입력을 속도 컨트롤러에 연결하고 회전 인코더 출력을 컴퓨터 데이터 수집(DAQ) 보드의 아날로그 입력에 연결합니다. 참고: 회전 각도 속도는 회전 인코더에 의해 전압으로 인코딩되며 MATLAB에 작성된 AnimalTracker라는 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 디지털화됩니다.</li>
	<li>헤드플레이트 호환 홀더를 직각 브래킷에 설치합니다. 러닝머신 앞의 빵 판에 단단한 포스트를 설치하고 포스트에 직각 브래킷이 있는 조립헤드플레이트홀더를 설치합니다(그림 2). 헤드플레이트 홀더 바가 액슬과 정렬되어 마우스가 러닝머신에서 적절하고 편안한 보행 위치를 채택할수 있도록 합니다(그림 2C).</li>
</ol>3. 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 식
<ol><li>
자궁 전기 에서
	<ol>
<li>플라스미드 DNA(3−4 μg/μL; CAG 프로모터, 센서 서열 및 우드척 간염 바이러스를 포함하는 센서 구성)에 빠른 녹색 염료(주입 시 시각화용)의 최종 농도를 0.2% 추가하여 IUE에 대한 DNA 솔루션을 준비합니다. 전사 후 반응 요소 [WPRE] 번역 증강) 용해/물 또는 트리스-EDTA에 희석.</li>
		<li>E1624에서IUE를 위해 시간 적시 임산부 마우스(예: C57BL/6)를 준비합니다. 이소플루란으로 마우스를 마취 (유도 4%, 유지 보수 1.5%, O2 95% O2 5%CO2)를 바르고 5 mg/kg 멜록시캄 과 4 mg/kg 부피바카인을 함유한 피하 진통제를 발라주세요. 메스와 가위로 복강을 열고 자궁 뿔을 조심스럽게 노출시다.</li>
		<li>앞서 설명한 바와 같이 한 반구의 측면 심실에서 배아 당 DNA 용액 1 μL을 주입한다24.</li>
		<li>피질에 양극 말단 발을 배치하고 전기 포더로 1Hz에서 5 개의 100 ms 정사각형 펄스 (38 V)를 사용하여 피질 뉴런에 대한 일반 IUE24를 수행합니다. 참고: 다른 피질 영역은 측면 심실을 기준으로 전극 말단 발의 배치를 변경하여 전기 천공을 대상으로 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스테레오택시 주입
	<ol>
<li>생후 30일에 마우스를 준비하여 입체외과수술(26)한다. 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 5 mg/kg 카프로펜을 함유하는 회음부 진통제의 피하 주사를 적용한다.</li>
		<li>AAV 혈청형 2/1(AAV2/1)을 경험적으로 결정된 역가(~1 x 10 9-1010 게놈/μL)에 hSyn-tAKARα-WPRE를 표현하여 주사기 여과(0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 막) 인산완충세액수액을 하였다.</li>
		<li>모터 피질에 대한 다음 좌표에서 스테레오 현미경에서 핸드 헬드 드릴을 사용하여 ~ 500 μm 직경의 구멍을 드릴 : 0.5 mm 전방 브레그마, 1.2 mm 측면 에서 중간선.</li>
		<li>인젝터(예: 맞춤형 플런저/유리 파이펫 홀더가 있는 오일 유압 조작기)를 전동 조작기에 장착합니다. 브레그마-람다 평면을 기준으로 주사 바늘을 15° 각도로 놓습니다. 전방 후방 및 등쪽 복부 축을 따라 각각 700 μm 및 200 μm 진행에 해당하는 x-및 z-축을 가로질러 대각선 이동을 프로그래밍합니다. 참고: 의도된 이미징 필드 바로 위에 있는 조직에 손상을 방지하기 위해, AAV 입자는 bregma-lambda 평면에 비해 비스듬히 주입된다.</li>
		<li>주사 바늘의 끝을 드릴 구멍 중앙의 피아에 놓고 위에서 설명한 대각선 운동 (~25 μm / s)을 천천히 실행합니다. 이 절차는 사출의 중심을 1.2 mm 전방에서 bregma, 1.2 mm 측면에서 중간선, 0.2 mm 의 피아 아래에 배치합니다.</li>
		<li>희석 된 바이러스 입자 20 nL (~10 nL / 분)을 주입하십시오. 적어도 10 분 기다렸다가 천천히 주사 바늘을 철회하십시오 (~12.5 μm / s).</li>
		<li>스테레오택 주사 절차를 완료하고 접착제 / 피부26.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 두개골 창 설치
<ol><li>IUE(섹션 3.1) 또는 바이러스 입자(섹션 3.2)의 입체주사를 통해 tAKARα를 발현하는 마우스상에 두개골 창을 30일에서 60일 사이에 배치한다. 바이러스 성 입자에 감염된 마우스의 경우 바이러스 주입 후 적어도 2 주 후에 두개골 창을 구현하십시오. 앞서 설명한 대로 cranial 창을 설치27,28, 다음 세부 정보와 함께. 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 4 mg/kg에서 회음부 진통제 0.075 mg/kg 부프레넥스 및 항염증제 덱사메타손의 피하 주사를 적용한다.</li>
	<li>회막을 제거하고 목 근육을 철회하십시오. 수술 후 목 근육의 노출을 피하기 위해 조직 접착제로 두개골에 피부의 가장자리를 접착제.</li>
	<li>메스를 사용하여 부드럽게 긁어 두개골에서 골막을 건조하고 제거합니다. 이미징 헤드플레이트(내경 8mm)를 배치하여 의도한 이미징 필드를 둘러싸습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 시아노 아크릴레이트 기반 접착제를 사용하여 두개골에 헤드 플레이트를 접착제. 최적의 접착을 위해 헤드플레이트가 노출된 두개골과 말린 두개골위에 놓여 있는지 확인하십시오. 접착제 가속기는 경화를 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>치과 용 드릴을 사용하여 의도 한 이미징 필드 (단계 3.2.3에 지정된 좌표)보다 직경이 5mm의 원을 그리고 경막 미를 노출시다.</li>
	<li>전체 두개골 창을 커버하는 듀라 표면에 인공 경도라고도 하는 투명 폴리머의 얇은 층을 적용합니다. 중합체는 경막 미더를 보호하고 안정화합니다. 멸균 원형 커버슬립(직경 5mm)을 경구 에 놓습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 창의 가장자리 주위에 적용 시아노 아크릴레이트 접착제로 커버 슬립을 고정합니다.</li>
</ol>5. 생체 내 2 광자 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법
<ol><li>두개골 창의 설치 후 2주 이상에서 2pFLIM 이미징을 시작합니다(섹션 4). 마우스를 습관화하기 위한 이미징 연구가 시작되기 전에 마우스를 자주 취급하고 스크러핑하여 스트레스로 인한 실험 간섭을 최소화합니다.</li>
	<li>2광자 레이저를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 2광자 여기 레이저 파장을 960nm로 설정합니다.</li>
	<li>4% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시다. 꼬리 꼬집기와 호흡 속도를 관찰하여 적절한 마취를 확인합니다. 즉, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어야하며 호흡 속도는 초당 ~ 1 호흡으로 감소되어야합니다. 불필요한 절차 시간을 최소화하고 마취가 2 ~ 3 분 동안만 지속되기 때문에 눈 윤활유는 사용되지 않습니다.</li>
	<li>마취된 마우스를 전동 러닝머신(도2C)으로옮기고 마우스의 헤드플레이트를 러닝머신 셋업의 헤드플레이트 홀더에 장착합니다(자세한 내용은 도 2 참조). 70% 에탄올로 마우스의 두개골 창 커버슬립 표면을 청소합니다.</li>
	<li>전동 러닝머신을 장착된 마우스를 2pFLIM 목표 아래에 놓습니다. 두개골 창 덮개 슬립과 목표 사이에 증류수 한 방울을 바칩니다.</li>
	<li>장착된 마우스가 마취에서 깨어나서 러닝머신과 현미경 환경에 적어도 10분 동안 익숙해지게 하십시오.</li>
	<li>에피 조명 아래의 사출 위치로 이동합니다. 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역(ROI)의 이미징을 돕기 위해 밝은 시야 아래에 있는 피덕셜 기능(즉, 혈관)을 문서화합니다.</li>
	<li>뇌 조직에서 방출된 빛 이외의 들어오는 빛을 제거합니다. 에피 조명 광원을 끄고 2pFLIM 장비의 인클로저를 닫습니다. 하드웨어 명령 전압 제어를 켜서 2pFLIM PMT를 활성화합니다.</li>
	<li>깨어있는 마우스에서 tAKARα 양성 소마타를 이미징하기 위한 다음 권장 설정을 사용하여 2pFLIM 획득 소프트웨어 FLIMimage를 사용하여 z-stack 2pFLIM 이미지를 획득한다. 프레임 평균을 3프레임으로 설정하고, 스캔 속도를 2ms/line으로, 이미지 크기를 128 x 128픽셀로, 시야를 90-100μm로 설정합니다. 준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다.</li>
	<li>
FLIMview에서 획득한 이미지를 검사합니다(사내에서 개발된 사용자 지정 소프트웨어; 섹션 6 참조). 5.9단계 에 이어 이미징 설정을 조정하여 광자 수를 최적화하고 광표백을 최소화합니다. 참고: 생체 내에서 tAKARα 양성 소종의 일생 이미징을 위한 ROI에서 실행 가능한 통합 광자 수는 특정 자극으로부터 발생하는 신호 진폭에 따라 ~1,000-10,000 광자입니다(토론 참조). <ol>
<li>필요한 경우 시야 감소, 스캐닝 속도 감소, 레이저 전력 증가, 평균 프레임 수 증가를 사용하여 통합 된 광자 수를 늘리고 수명 추정 오차를 줄입니다. 동시에 최소한의 필수 레이저 파워, 프레임 평균화 및 스캐닝 속도를 사용하여 광표백을 최소화해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5.10단계에서 결정된 설정을 사용하여 z-스택 획득을 반복함으로써 일정한 시간 간격(예를 들어, 30~60초마다)으로 이미지화한다. 러닝머신 제로 속도로 최소 15분 동안 베이스라인 2pFLIM 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>러닝머신 회전 속도를 2pFLIM 이미지를 획득하는 동안 15분 동안 ~15cm/s로 설정합니다. 러닝머신 회전을 끄고 20분 동안 영상을 계속하여 강제 운동을 중단한 후 PKA 활성 의 지속 시간을 평가합니다.</li>
</ol>6. 2pFLIM 이미지 분석
<ol><li>
FLIMview에서 획득한 이미지를 열고 FLIMview에서 다음 매개 변수를 설정합니다. 참고: 매개 변수 세부 정보는 설명에 설명되어 있습니다.<ol>
<li>FLIMview에서 단일 광자 계수(SPC) 최소 및 최대 범위 필드를 클릭합니다. 일반적으로 각각 1.2-2와 10−12 ns 사이의 적절한 최소 및 최대 SPC 범위 값을 입력합니다.</li>
		<li>FLIMview에서 t0 값 필드를 클릭하고 t0 값(일반적으로 ~2ns)을 입력합니다. FLIMview에서 수명 휘도 최소 임계값 필드를 클릭하고 원하는 임계값을 5-30 광자로 입력합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>새 그룹 단추(N)를 클릭하고 실험 그룹 이름을 할당합니다. 이렇게 하면 추가된 각 FLIM 이미지의 데이터를 결합하는 그룹이 생성됩니다.</li>
	<li>FLIMview의 Roi 컨트롤 모듈에서 ROI 버튼을 클릭하고 tAKARα 양성 소마 주위에 ROI를 그립니다. FLIMview의 z 스택 제어 슬라이더에서 하부 및 상부 z 한계를 이동하여 z 스택 범위를 줄이면 다른 z 깊이의 배경 광자에서 발생하는 신호 오염을 최소화할 수 있습니다.</li>
	<li>+ 버튼을 클릭하여 FLIM 이미지를 그룹에 추가합니다(6.2단계). Calc 버튼을 클릭하여 ROI 및 수명 추정 오차(δδ)에 대한 평균 수명(LT, 평균 광자 방출 시간[MPET]이라고도 함)을 계산합니다.</li>
	<li>만성 2pFLIM 이미징 시리즈에서 다음 파일을 엽니다. 6.4단계를 반복합니다. 시간이 지남에 따라 조직이 표류할 수 있기 때문에 ROI 및 z-stack 범위의 위치를 조정하여 시간이 지남에 따라 동일한 tAKARα 양성 소종을 측정해야 합니다.</li>
	<li>그룹 컨트롤 모듈의 드롭다운 메뉴에서 deltaMPET/MPET0을 선택합니다. 기준선# 필드를 클릭하고 인덱스(들)를 입력합니다(예: 6.3단계에서 만든 그룹의 처음 5개 이미지에 대해 1 2 3 4 5)를 입력합니다. 이렇게 하면 기준 수명(LT 0)을계산하는 데 사용되는 이미지가 정의됩니다.</li>
	<li>플롯을 클릭하여 정의된 ROI에서 실험 중에 tAKARα의 FLIM 응답(ΔLT/LT 0)을 포함하는 그래프를 생성합니다. 해당 기준 선회 수명(LT 0)에 의한 개별ROI의 정규화된 변경(ΔLT)을 통해 다른 ROI에서 운동 중 PKA 활동을 비교할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. 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(12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 FRET-FLIM 센서 tAKARα를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 신경 변조 트리거 PKA 활성을 시각화하는 것을 보여줍니다. 본 출원은 얻어진 FLIM 신호가 생리학적 신경조절 이벤트(17)와 관련이 있음을 입증하기 위해 시험관내 및생체내 tAKARα의 광범위한 시험 및 특성화에 기초한다. 여기서, 하나의 생체 내 응용 프로그램, 운동 유도 PKA 활성 모터 피질에서, 뇌에 센서...

또한 느린 시냅스 전송으로 알려진 신경 변조는 스트레스, 각성, 주의 및 운동과 같은 다른 행동 상태동안 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 부과 1,2,3, 4. 그 중요성에도 불구하고, 신경 조절 이벤트가 일어나는 시기와 장소에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 아세틸콜린, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 많은 뉴로펩타이드를 포함한 신경 조절제는 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 활성화하여 광범위한 기간의 확장창을 통해 세포내 두 번째 메신저 경로를 트리거합니다. 초에서 시간까지. 각 신경 조절기는 신호 이벤트의 뚜렷한 세트를 트리거하는 동안, cAMP /단백질 키나제 A (PKA) 통로는많은 신경 조절제 1,5에대한 일반적인 다운스트림 통로입니다. cAMP/PKA 통로는 신경 흥분성, 시냅스 전송 및 가소성 6,7,8,9,따라서, 신경 네트워크 역학을 조정합니다. 다른 뉴런 또는 뉴런 유형이 신경 조절제 수용체의 다른 유형 또는 수준을 표현하기 때문에10,동일한 세포 외 신경 조절기의 세포 내 효과는 다른 뉴런에 걸쳐 이질적 일 수 있으며, 따라서, 세포 해상도로 공부했습니다. 날짜를, 그것은 행동 하는 동안 생체 내 개별 뉴런에서 신경 조절 이벤트를 모니터링 하는 도전 남아.
신경 변조의 시공간 역학을 연구하기 위해서는 적절한 기록 양식이 필요합니다. 미세 투석 및 빠른 스캔 주기적 voltammetry는 신경 조절제의 방출을 연구하는 데 자주 사용되지만 세포 이벤트를 모니터링하는 공간 해상도가 부족합니다11,12. 집단 화상 진찰13에 있는 신경 전기 활동에 대한프록시로 이용되고 있는 칼슘 역학과 유사하게, PKA 화상 진찰은 세포 해결책에 신경 인구에 걸쳐 신경 조절 사건을 판독하기 위하여 이용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 동물 행동 동안 생체 내에서 PKA 활동을 모니터링하기 위해 개선된 A-키나아제 활성 리포터(AKAR)의 사용을 설명한다. 여기에 설명된 방법은 생리학적 신경 조절 이벤트를 추적하는 시간적 해상도로 세포 내 해상도에서 신경 인구의 동시 이미징을 허용합니다.
AR은 PKA 인산화 기질 펩타이드 및 기질의 인산화 세린 또는 스레오닌에 결합하는 지게차 관련(FHA) 도메인에 의해 연결된 공여자 및 수용체 형광 단백질(14,15)으로구성된다. PKA 통로의 활성화시, AKAR의 기질 펩티드는 인산화된다. 그 결과, FHA 도메인은 인산화된 기질 펩티드에 결합하여, 두 개의 형광단을 근접하게, 즉 AKAR의 폐쇄 상태라고 한다. 인산화된 AKAR의 폐쇄 상태는 기증자와 수용자 형광단 사이의 증가된 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 초래합니다. 인산화된 AR의 비율은 PKA 활성도 16의수준과 관련이 있기 때문에, 생물학적 샘플내의 FRET양은 PKA 활성의 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다16,17,18, 19,20.
AR의 초기 버전은 주로 2색 비율 측정 이미징14를위해 설계되었습니다. 뇌 조직에 더 깊은 이미징을 할 때, 비율 측정 방법은 파장 의존광 산란으로 인해 신호 왜곡을 겪습니다17,18,21. 아래에 논의된 바와 같이, 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 FLIM이 기증자 형광에 의해 방출된 광자만 측정하기 때문에 이 문제를 제거합니다18,21. 그 결과, FRET의 FLIM 정량화는 조직 심도(17)에 의해 영향을 받지 않는다. 또한, 수용기 형광단의 "다크"(즉, 낮은 양자 수율[QY]) 변이체가 사용될 수 있다. 이는 제2 센서 또는 형태학적마커(17,19,20)의동시 이미징을 통해 직교 뉴런 특성의 다중화 측정을 용이하게 하는 컬러 채널을 해제한다.
FLIM 이미징은 형광공이 흥분한 상태, 즉 형광 수명18에서보내는 시간을 정량화합니다. 불소가 지면 상태로 돌아오면, 따라서 흥분 상태의 끝은 종종 광자의 방출과 수반된다. 개별 흥분 분자에 대한 광자의 방출은 스토크이지만, 집단에서 평균 형광 수명은 특정 형광공의 특징입니다. 형광단의 순수한 인구가 동시에 흥분되면, 생성된 형광은 하나의 기하급수적 붕괴를 따를 것이다. 이 지수 붕괴의 시간 상수는 형광 단백질의 경우 일반적으로 1 ~ 4 나노 초 범위 평균 형광 수명에 해당합니다. 흥분한 공여자 형광단의 지상 상태로의 복귀는 또한 FRET에 의해 발생할 수 있다. FRET의 존재에서, 기증자 형광의 형광 수명이 감소된다. 인산화되지 않은 ALA는 상대적으로 더 긴 공여자 형광 수명을 나타낸다. PKA에 의한 인산화 시, 센서는 기증자와 수용자 형광체가 서로 가까이 가져오고 FRET가 증가하기 때문에 수명이 짧아지게 됩니다. 따라서 ALA의 집단에서형광 수명의 정량화는 PKA 활성의 수준을 나타낸다.
ALA의 초기 버전은 단세포 해상도에서 생체 내 이미징에 성공적으로 사용되지 않았습니다. 이는 주로 생리적 활성화(17)에 대한 AKAR 센서의낮은 신호 진폭 에 기인한다. 최근에는 2광자 형광 평생 이미징 현미경 검사법(2pFLIM)에 사용할 수 있는 AKAR 센서를 체계적으로 비교하여 FLIM-AKAR라는 센서가 대체 센서를 능가하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 표적으로 한 AKAR (tAKARs)에게 불린 일련의 FLIM-AKAR 이체는 특정 세포소 위치에서 PKA 활동을 구상하기 위하여 개발되었습니다: 마이크로소튜블 (tAKARα), 시토졸 (tAKARβ), 액틴 (tAKARδ), 필라멘트 액틴 (tAKARθ), 막 (tAKARγ), 및 후성 밀도 (tAKARθ). tAKAR중, tAKARα는 노르에피네프린에 의해 유도된 신호 진폭을 2.7배 증가시였다. 이는 뉴런에서 PKA의 대다수가 휴식 상태22,23에서미세소관에 고정된다는 지식과 일치한다. tAKARα는 2pFLIM에 대한 기존 AR 중 최고의 성과를 보였습니다. 더욱이, tAKARα는 다중 신경조절기에 의해 유도된 생리학적 관련 PKA 활성을 검출하고, tAKARα의 발현은 신경 기능17을변화시키지 않았다.
최근, tAKARα는 헤드 고정 된 행동 마우스(17)에서PKA 활동을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었다. 운동운동이 운동, 배럴 및 시각 코르티케에서 피상층 뉴런(층 1~3, 피아로부터 ~300 μm의 깊이까지)의 소마에서 PKA 활성을 유발한 것으로 나타났다. 운동 트리거된 PKA 활동은 β-아드레날린 수용체 및 D1 도파민 수용체를 통한 신호화에 부분적으로 의존했지만, D2 도파민 수용체 길항제에 의해 영향을 받지 않았다. 이 작품은 2pFLIM을 사용하여 생체 내에서 신경 변조 이벤트를 추적하는 tAKARs의 능력을 보여줍니다.
현재 프로토콜에서, 시행된 운동 패러다임 동안 헤드 고정 깨어 있는 마우스에서 PKA 활성 이미징을 위한 전체 방법은 6단계로 설명된다. 먼저, 종래의 2광자 현미경에 2pFLIM 기능을첨가하였다(도 1). 둘째, 전동 러닝머신의 시공(도 2). 셋째, DNA 플라스미드의 자궁 전기천공화(IUE)에 의해 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 발현, 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)의 입체주입. IUE24,25 및 바이러스 성 입자(26)의 입체 주입에 대한 수술을위한 우수한 프로토콜은 이전에 출판되었다. 우리가 사용하는 주요 매개 변수는 아래에 설명되어 있습니다. 앞으로, 두개골 창의 설치. 우수한 프로토콜은 이전에 두개골 창 수술에대한 출판된 27,28. 표준 프로토콜에서 수정된 몇 가지 단계가 설명되어 있습니다. 다섯째, 생체 내 2pFLIM에서 수행. 여섯째, 2pFLIM 이미지의 분석(도3 및 도4). 이 접근법은 다른 많은 머리 고정 행동 패러다임 및 뇌 영역에 쉽게 적용 되어야 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

신경 변조는 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 발휘합니다. 신경 조절 시스템의 기능 장애는 신경 및 정신 장애에 결과. 그들의 중요성에도 불구 하 고, 세포 해상도 신경 변조 이벤트를 추적 하기 위한 기술은 등장 하기 시작. 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린 및 세로토닌과 같은 신경 조절제는 각각의 G 단백질 결합 수용체를 통해 세포내 신호 전달 이벤트를 트리거하여 신경 흥분성, 시냅스 통신 및 기타 뉴런을 조절합니다. 신경 네트워크에서 정보 처리를 조절할 수 있습니다. 위에서 언급 한 신경 조절제는 cAMP / 단백질 키나아제 A (PKA) 통로에 수렴합니다. 따라서, 단일 세포 해상도를 가진 생체 내 PKA 이미징은 신경 전기 활동을 위한 칼슘 이미징과 유사한 방식으로 신경 조절 이벤트에 대한 판독으로 개발되었다. 본 명세서에서, 헤드 고정 행동 마우스의 피질에서 개별 뉴런의 수준에서 PKA 활성을 시각화하는 방법이 제시된다. 이를 위해, 개선 된 A-키나아제 활동 리포터 (AKAR), 라는 tAKARα, Förster 공명 에너지 전송 (FRET)를 기반으로 사용 됩니다. 이 유전자 부호화 된 PKA 센서는 DNA 플라스미드의 자궁 전기 천공 (IUE) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV)의 입체 적 주입을 통해 모터 피질에 도입됩니다. FRET 변화는 광산성 뇌 조직에서 FRET 신호를 정량화하기 위한 비율 메트릭 FRET 측정에 비해 이점을 제공하는 2광자 형광 평생 이미징 현미경(2pFLIM)을 사용하여 이미지화됩니다. 강제 운동 중 PKA 활동을 연구하기 위해 tAKARα는 속도 제어 전동 러닝 머신에서 실행하거나 쉬는 깨어있는 머리 고정 마우스의 피질 위의 만성 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 이 화상 진찰 접근은 생체 내 화상 진찰을 위한 그밖 FLIM 기지를 둔 센서에 대응하는 행동 유도한 PKA 활동을 공부하기 위하여 많은 그밖 두뇌 지구에 적용될 것입니다.

FRET-FLIM 센서는 신경 변조에 관여하는 cAMP/PKA 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로를 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 2pFLIM과 함께 최근에 개발된 tAKARα 센서를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 PKA 활동을 시각화합니다. 대부분의 기존 2광자 현미경은 그림 1에 나와 있는 것처럼 3~4개의 구성 요소를 추가하여 2pFLIM 기능으로 업그레이?...

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Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

우리의 방법은 대상 A 키나아제 활동 기자 알파 또는 tAKAR라는 새로운 단백질 키나아제 A 센서를 활용

visualizing-protein-kinase-activity-head-fixed-behaving-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K 조회수.  Oregon Health & Science University. 우리의 방법은 대상 A 키나아제 활동 기자 알파 또는 tAKAR라는 새로운 단백질 키나아제 A 센서를 활용

비디오: Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

이광자 홀로그램 현미경을 사용한 신경 활동의 평가 및 조작

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

제브라피시 전뇌의 행동 추적 및 신경 활동 패턴

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

저자 스포트라이트: 성체 제브라피시 뇌 연구의 발전 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...