망막 세포의 생체 내 이미징 방법은 안과 질환을 조사하고 망막의 정상적인 기능을 이해할 수있게합니다. 이 방법은 이광자 현미경에 의한 망막의 생체 내 이미징에 대한 간단하고 재현성이 높은 접근 방식을 제공합니다. 마우스를 적절하게 안정화하는 것은 고품질 in vivo 이미지를 얻는 데 중요합니다.
헤드 홀더에 마우스를 놓는 연습을 하고 이미지를 획득하기 전에 절차에 익숙해집니다. 승인 된 동물 사용 프로토콜에 따라 동물을 진정시킵니다. 동공 확장 용액을 바르고 마우스를 5 분 동안 어둠 속에 두어 동공이 팽창되도록하십시오.
아래쪽 외이도 핀을 안쪽으로 확장 된 위치에 고정하고 위쪽 외이도 핀을 빼낸 위치에 고정합니다. 이어피스 바가 수평 아래 60도 각도로 기울어질 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌립니다. 마우스가 바이트 바를 향하도록 한 상태에서 핀을 외이도에 삽입하여 한쪽 귀를 확장된 하단 핀에 장착합니다.
상부 외이도 핀을 고정하는 나사를 푼 후 핀을 다른 외이도로 확장하고 나사를 다시 조여 머리를 고정합니다. 마우스가 헤드 홀더에 고정되어 있는지 확인하십시오. 머리 꼭대기를 아래로 누릅니다.
마우스는 이어 바에 단단히 고정되어야하며 머리는 외이도 축을 중심으로 자유롭게 회전해야합니다. 바이트 바가 마우스 머리 쪽으로 오도록 한 상태에서 마우스 헤드를 부드럽게 들어 올려 상악 앞니가 바이트 바 홀더로 내려갈 수 있도록 하고 바이트 바를 부드러운 힘으로 집어넣어 헤드를 고정합니다. 나사를 사용하여 바이트 바를 제자리에 고정하고 마우스와 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.
마우스의 양쪽 눈에 윤활유 안약을 바릅니다. 한쪽 눈의 동공이 광 경로와 일직선이 될 때까지 헤드 홀더의 메인 암을 돌리고 1.5번 커버슬립을 컴팩트 필터 홀더에 넣습니다. 홀더를 현미경 스테이지에 고정한 후 각막에 닿지 않고 윤활제 아이 젤에 닿을 때까지 커버슬립을 내리고 광시야 여기광이 각막을 완전히 덮을 때까지 XY 차원과 대물렌즈 Z 위치에서 스테이지를 조정합니다.
접안 렌즈를 사용하여 망막의 형광 세포 또는 구조에 초점이 맞춰질 때까지 Z 위치를 계속 조정하고 필요에 따라 에피 형광 조명기를 증가시켜 개별 세포 또는 관심 구조를 해결합니다. 망막과 이미징 광 경로의 정렬을 미세 조정합니다. 초점면을 변경할 때 초점이 맞지 않는 조명의 확장 또는 수축만 발생할 때까지 헤드 각도를 조정하여 X-Y 왜곡을 최소화합니다.
그런 다음 에피형광 조명기를 끄고 조명기 셔터를 닫습니다. 2광자 이미징의 경우 모든 기관 레이저 안전 프로토콜을 따르십시오. 모든 주변광을 끄고 덮고 여기광 경로를 레이저로, 방출광 경로를 PMT로 전환합니다.
이미지 수집 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512로 설정하고 프레임 평균을 3으로 설정합니다. Z 스테핑을 스택의 상단에서 시작하여 아래쪽으로 진행하도록 설정하여 광 수용체의 2 광자 레이저 활성화를 최소화합니다. PMT를 켜고 활성화하고 전압을 680볼트로 조정합니다.
이미징 및 방출 셔터를 활성화합니다. 1%레이저 출력에서 시작하여 표적 조직의 라이브 이미지 미리보기를 시작하고 디스플레이 밝기를 자동으로 조정하여 관심 있는 세포 또는 구조를 시각화합니다. 표적 조직이 어둡거나 불분명하면 구조가 45밀리와트를 초과하지 않고 보일 때까지 레이저 출력 비율을 높입니다.
현미경 스테이지를 X-Y 방향으로 움직여 원하는 이미징 영역의 중심을 맞추고 관심 구조에 초점이 맞춰진 Z 평면으로 이동합니다. 만성 타임랩스 실험의 경우 이전에 얻은 이미지를 열어 관심 있는 셀에 대한 참조로 사용하고 현재 이미지의 이미징 각도가 이전 이미지의 이미징 각도와 유사한지 확인합니다. 그런 다음 관심 있는 맨 위 및 맨 아래 Z 평면으로 이동하여 이미징 스택의 Z 제한을 설정하고 이미지를 획득합니다.
모든 이미지가 획득되면 PMT와 레이저 셔터를 비활성화합니다. 여기 광 경로를 에피 형광 조명으로 전환하고 방출 광 경로를 접안 렌즈로 다시 전환합니다. 그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 종료하고 컴퓨터 인터페이스에서 레이저를 끄고 항상 켜져 있는 장비를 제외하고 역순으로 하드웨어를 종료합니다.
분석이 끝나면 헤드 홀더에서 마우스를 제거하고 보푸라기가없는 조직을 사용하여 아이 젤을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 윤활제 눈 연고를 양쪽 눈에 바르고 마우스를 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 섭씨 37도의 따뜻한 물 순환 가열 패드에 놓고 마우스를 하우징으로 되돌립니다. VGlut-2-Cre 마우스에서 망막 신경절 세포 체종은 명확하게 식별 할 수 있으며 축삭 근막이 종종 나타납니다.
축삭의 궤적과 혈관계의 부정적인 이미지는 VGlut-2-Cre 마우스에서 시신경 두의 식별을 용이하게하며, 이는 만성 영상 실험의 랜드 마크로 유용합니다. 망막 신경절 세포와는 달리, 무축삭 세포 신경 돌기는 내부 플렉시 폼 층에서 더 자주 관찰됩니다. 안구 내 NMDA 주사 후 하루, 망막 미세아교세포는 이전 보고에 따라 짧은 과정 또는 아메보이드 형태를 보여줍니다.
영상 촬영 30-60 분 전에 단일 복강 주사를 통해 Evans 청색 염료를 전달하면 적어도 7 일 동안 지속되는 시신경 머리에서 나오는 혈관의 강력한 표지가 유도됩니다. 고정 후, 평평한 망막 전체 마운트 내의 세포 쌍 사이의 실제 거리는 컨포칼 스캔에서 측정되고 생체 내 픽셀 거리와 일치하여 생체 내 이미지의 평균 픽셀 크기를 결정할 수 있습니다. 마우스의 눈에 주입된 형광 마이크로스피어는 생체 내에서 마이크로스피어 직경을 측정할 수 있게 하여 약간 더 큰 픽셀 크기 추정치를 제공하지만 더 많은 분산을 제공합니다.
생체 내 이미징은 면역염색 및 현장 혼성화와 같은 조직학적 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 특정 세포 유형을 식별하고 이미징된 세포의 유전자 발현을 검사할 수 있습니다.
